Name: 털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 털이 마우스 귓불 모델을 이용한 생체 내 현미경 및 혈전 유도 방법을. 이 기술은 미세혈관 혈전 형성과 혈관활성 약물의 영향을 실시간으로 관찰하여 패혈증 및 조직 이식 합병증 연구에 활용됩니다.

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모든 생체 실험 (7221.3-1-006 / 15) 동물의 보호 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 (실험 동물 자원 연구소, 국립 연구위원회)에 독일 법률에 따라 실시 하였다. 동물의 1. 일반 상태 유지 <ol><li> 4 ~ 6 주 세 남성 SKH1 - 시간의 시간의 쥐 실험을 수행합니다. (20)와 25g 사이 무게 동물을 사용합니다. </li><li> 물과 음식을 자유로이에 지속적으로 액세스하는 무균 시설에서 26 ° C 24의 표준화 된 조건 약 60 %의 상대 습도에서 동물을 유지합니다. </li><li> 하나 개의 새장에 다섯 개 수컷에 계속. 자신의 웰빙을위한 동물의 하우징 동안 침구와 농축 자료를 제공합니다. </li></ol> 동물 2. 사전 약속 <ol><li> (예를 들면, 칸 나비 노이드, 5m 마우스 체중과 각 약물로드인슐린 주사기로 g / kg 체중 (BW)). 혈전 유도하기 전에 약 30 분을 관리. </li><li> 엄지와 집게 손가락과 새끼 손가락으로 마우스의 꼬리와 마우스의 목을 잡고함으로써, 동물 스트레칭과 복부의 왼쪽 하단 사분면에 약 복강 (IP)을 주입. 15 분 동안 케이지로 다시 동물을 넣습니다. </li><li> 케타민 (90 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (25 ㎎ / ㎏ 체중)로 마취를 준비한다. 혈전 유발 15 분 전에 마우스를 마취. 케이지에 마우스를 넣어 살짝 꼬리를 당겨, 그리고 인슐린 주사기와 마취제의 IP를 주입. </li><li> 마취의 발병 때까지 다시 케이지에 마우스를 넣습니다. 충분한 마취를 확인하려면 집게로 꼬리를 꼬집어. </li><li> 인슐린 주사기로 (5 %, 150 kDa의 FITC 덱스 트란)의 제상 형광 염료 - 표지 된 덱스 트란의 0.05 mL의로드. 주사기를 작성하는 동안, 기포가 남아 있지 않도록 아주 작은 intravenousl 때문에Y는 (IV) -administered 기포 동물 용 치명적일 수있다. </li><li> 의 인쇄면이 밑으로 가도록 위치에 가열 플레이트에 마취 마우스를 놓습니다. 37 ° C로 가열 플레이트를 조정한다. </li><li> 마우스의 각막에 눈 연고를 넣습니다. 피부를 소독하고 멸균 악기를 사용합니다. </li><li> 오른쪽 손잡이의 두개골과 꼬리 가장자리에 폴리 프로필렌 7/0 두 봉합 스티치. 가능 (도 1b)와 같은베이스 가장자리에 근위로 스티치를 놓는다. </li><li> 지느러미의 위치로 마우스를 이동. 접착제 스트립을 사용하여 acrylglass 플랫폼에 대한 모든 다리를 수정합니다. 앞니 아래에서 봉합사를 걸고 접착제 스트립과 acrylglass에 봉합사를 행해서 배굴에 헤드를 위치. </li><li> 동작 실체 현미경 아래 플랫폼에 동물을 이동시키다. 16X 배율을 사용합니다. </li></ol> 왼쪽 경정맥과 FITC - 덱스 트란 사출 3. 준비 참고 : 마이크를 들어오른쪽 귀 roscopy은, 왼쪽 경정맥을 준비합니다. <ol><li> 메스를 이용하여, 부교감 꼬리 방향의 목의 왼쪽에있는 피부에 5 mm의 절개를 생성한다. microforceps 및 microscissors와 피하 조직을 해부하다. 폴리 에스테르 8/0 봉합 또는 electrocoagulation와 결찰 교차 선박 중 하나. </li><li> 혈관을 건드리지 않고 microforceps 및 microscissors를 사용하여 외막에서 정맥 무료. </li><li> 형광 염료의 주입을 위해 제조 된 인슐린 주사기를 사용한다. 조심스럽게 정맥을 관통하지 않고 microforceps와 혈관 벽을 잡아. 주사기로 팽창 된 혈관 벽을 관통하여 FITC 덱스 트란 IV 주입. </li><li> 면봉을 사용하여 주사기를 철수 후 출혈을 중지합니다. 혈액을 피하고 귀 오염을 염색. </li></ol> 생체 내에 형광 현미경의 오른쪽 귀 4. 위치 <ol><li> acrylglass C까지 가열판에 동물을 이동시켜가열판위한 슬롯과 귀 위치하는 0.5 cm 높이의 평면 onstruction. </li><li> 접착 스트립을 이용하여 가열 플레이트 상에 동물을 고정면. 귀 선단 부분이 평면에서 평면에 위치 될 수 있도록 귀 (도 1b)에 대해 0.5 cm 높이의면 옆에 귀 기지에서 비교적 강한 볼록 연골 놓는다. </li><li> 귀를 배치하기 위해 acrylglass 평면에 상온 0.9 %의 NaCl 한 방울을 추가합니다. 오목 복부 측 기정 봉합 0.9 % 염화나트륨 드롭에서 아래쪽으로 향하도록 오른쪽 귀를 놓는다. 면봉을 사용하여, 염화나트륨의 드롭을 흡수하고 모세관 힘이 acrylglass에 귀 평면을 첨부 할 수 있습니다. </li><li> 귀의 위치를 ​​해결하기 위해 acrylglass에 봉합 테이프로. </li><li> 귀 볼록 등쪽에 0.9 % NaCl을 실온에서 한 방울을 추가한다. 조심 번째 입력 기저 용기를 압축하지 않고 귀에 한 커버 슬립 (0.5 cm 직경)을 넣어전자 귀. 면봉을 이용하여 커버 슬립하고 귀 혈관 대상 사이의 거리를 최소화하기 위해 커버 슬립 아래에서 최대한의 NaCl을 제거한다. </li></ol> 오른쪽 귀 5. 생체 내에 형광 현미경 및 혈전 유도 <ol><li> (-; 510; LP : 520 FT 490 내지 450) FITC 덱스 트란 시각화를위한 생체 내에 형광 현미경을 조정한다. 광원으로 가변 100 W 수은 램프를 사용한다. DVD 레코더에 고해상도 흑백 CCD 카메라를 연결합니다. </li><li> 생체 내에 형광 현미경의 책상에 고정 납치 귀 가열 플레이트를 포함하는 acrylglass에 동물을 전송합니다. </li><li> 직경 400의 선행 성 혈류에 60 μm의 - - 600 μm의 / s 20X 배율 (20X / 0.95 개구 수) 20 % 광량을 사용하여 정맥 용기 50를 검색. </li><li> 63X magnificatio의 수침위한 커버 슬립을 실온에서 물을 적하 추가n 개의 목표 (63X / 0.95 개구 수). 1 mm 직경 정맥 주사기를 사용하여 현미경의 목적의 드롭 놓습니다. 물 방울과 커버 슬립과 목적에 문의 충분한 물을 추가합니다. </li><li> 즉시 물방울의인가 후, 직경 및 혈액 흐름의 오프라인 측정 20 % 광 강도로 20 초 동안 기록을 시작 용기. </li><li> FITC 덱스 트란의 주사 후 혈전 유도 5 분 시작. 이러한 목적을 위해, 100 %의 발광 강도를 올릴. </li><li> 혈전 유도시 혈액 흐름을 체크 30 초의 기간 내에 2 초 동안 현미경의 개구부를 닫는다. 혈액 흐름을 지속하는 경우, 다시 조리개를 연다. 정지 혈류량의 경우, 30 초 동안 혈관을 관찰한다. 참고 : 흐름이 30 초 이상이나 피가 역행 흐르는 경우 여전히 유효하면 혈관이 폐색으로 분류됩니다. orthograde 혈액의 흐름이 다시 시작되면 완전히 조리개와 CONTIN을 엽니 다<html> 상술 한 바와 같이 UE 혈관 폐색까지 혈전 유도가 발생한다. 조기 혈전 유도시, 상기 개구는 혈류를 확인하는 폐쇄 된 시간은 거의 연속적인 에피 조명을 유지하기 위해 가능한 한 짧은 것을 보장한다. 나중에, 혈전 성장 동안, 용기가 적은 형광 염료 관류이므로 계속 관찰 할 수있다. </li><li> 선택과 귀 당 5 개 혈관을 폐색. FITC 덱스 트란의 주사 후 약 1 시간에 현미경 혈전 유도 시간을 제한한다. </li></ol> 6. 후속 활동 <ol><li> 경피 폴리 프로필렌을 6/0 봉합사를 사용하여 목의 상처 봉합을 수행합니다. </li><li> 마취에서 회복하는 동안, 케이지에 다시 마우스를 놓고 적외선을 사용하여 동물을 따뜻하게. </li><li> 혈관과 혈류 속도의 직경의 측정을 가능하게 소프트웨어로 DVD 레코더에서 기록 된 데이터를 전송합니다. </li></ol>왼쪽 귀의 _title &quot;&gt; 7. 시험 <ol><li> 동물 복구하고 48 시간 동안 모든 주입 FITC-덱스 트란을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 상술과 같이, 우측 경정맥 및 좌측 귀를 제조 이번에 재실행. </li></ol> 8. 조직 Asservation <ol><li> 왼쪽 귀의 생체 내에 형광 현미경 후 샘플 0.5 ㎖를 눈 구후 정맥 얼기 혈액의 유리 모세관을 이용. 정맥 혈액이 모세관를 통과 할 때까지 조심스럽게 속이 움직임 내측 눈꺼풀 각 관통. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 혈액 튜브 프로브를 수집. </li><li> 채혈 후에 꼬리 정맥 내로 500 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 주입하여 동물을 희생. </li><li> 백혈구, 적혈구, 혈소판, 헤모글로빈 및 적혈구 용적률의 정량적 평가에 대한 혈액 분석기를 사용하여 혈액 세포를 계산합니다. </li><li> 10m 2,500 XG하고 실온에서 나머지 EDTA 혈액을 원심에. 피펫 및 추가 조사에 대한 혈장을 동결. </li><li> 가위를 사용하여 귓바퀴을 절감하고 조직 학적 검사에 대한 4 %의 포름 알데히드에 오류를 수정. </li></ol>

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SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귓불에서 성공적인 혈전 유도에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 문제 해결을 위해 프로토콜의 각 단계는 괄호 안에 표시됩니다. 육주와 표피의 낮은 각화로 - 시험 조건은 4 세의 나이에 젊은 동물에 이상적입니다. 이전 동물에서 혈관의 시각화 품질로 인해 피부 표면과 타겟 용기 (단계 1.1) 사이의 거리보다 더 적은 대등하다. 검사 지역에 FITC 덱스 트란의 혈관 외 유출을 방지하기 위해, 고정 봉합 가능한 한 가장자리에 배치되어야한다. 스티치에 근접하여, 형광 염료 extravasate 및 혈관 외 공간과 용기 사이의 콘트라스트를 감소시킬 수있다. 염료의이 넘쳐 천천히 진행. 종래 FITC 덱스 트란의 주입 좋은을 15 분 이상 한 바와 같이 봉합 스티치되면생체 내에 현미경 검사 조건 (단계 2.8)을 보장한다. ...

본 문서의 목적은 직접적인 관찰과 미세 분석, 혈전 형성 및 혈전 진화의 무모 마우스의 귓바퀴에 적용 생체 내에 현미경의 기술을 설명하는 것입니다. 1000 년 1의 발생율로, 정맥 혈전증 여전히 이환율의 일반적인 원인이다. 진단, 예방 전략 및 치료는 최근에 개발되었지만, 정맥 혈전증의 3 분의 1은 폐 색전증 1로 나타난다. 동맥 혈전증은 선진국에서 사망의 가장 흔한 원인이되는 심장 혈관 질환에 중요한 역할을한다. 동맥 경화성 플라크의 파열에 따라 동맥 혈전증은 심장 마비, 장간막 경색 및 뇌졸중에 참여하고있다. 모든 수술은, 혈액 성분에 피하 구조를 노출 혈류 역학을 변경하고 환자를 고정시킨다. 낮은 사지, 기관 t의 endoprosthetic 수술에서ransplantation 및 플랩 수술 혈전 합병증의 빈번한 원인입니다. 특히 미세 혈관 혈전증 자주 인해 임상 증상의 부족으로 돌이킬 수없는 손상을 야기한다. 마찬가지로, 미세 혈관 혈전증은 다른 사람의 사이에서 혈전 성 혈소판 감소 성 자반증, 패혈증, 파종 성 혈관 내 응고, 항 인지질 증후군, 만성 정맥 부전, 등 여러 질병에 중요한 규칙을한다. 치료 및 혈전증의 예방을위한 여러 가지 새로운 약물은 최근에 개발되었지만, 항 혈소판 약물과 항 응혈은 여전히 ​​부작용, 부족 길항제가 있고, 장기간 효과가 있습니다. 이 결함은 응급 의료의 문제로 이어집니다. 따라서, 더 많은 연구가 거의 시험 관내에서 모사 될 수 없다 혈전증 동안 발생하는 복잡한 프로세스를 발견 할 필요가있다. 털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스 런던 동물원에서 1926 발견되었다.때문에 14 번 염색체에 유전자 결함, 동물이이 선박의 생체 내에 현미경에 액세스 잘 혈관 귓바퀴를 만드는 출생 후 하루 10 후 털을 잃는다. 귀의 평균 두께는 300 μm의입니다. 이것은 연골에 의해 분리되어 진피의 두 층으로 구성. 연골의 볼록 등쪽에서 3 개 혈관 번들 귓불을 입력한다. 혀끝 혈관 호 및 기초 션트는 세 개의 번들을 연결합니다. 세정맥 200 μm의 (기부) 10 ㎛의 (정점) 사이의 직경을 갖는다. 근접 메시 모세 혈관 빈 머리 2 여포 둘러싸고 있습니다. 털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 해부학은 귓바퀴 혈전증 연구를위한 강력하고 비용 효율적인 모델을 만든다.

<table><tbody><tr><td>SKH-1/hr 마우스</td><td>Charles River</td><td>477</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>표준 실험실 식품</td><td>sniff Spezialdiaeten</td><td>V1594-0&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>실체현미경 작동</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M651/M655&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>생체 내 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiotech Vario 100&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>객관적인 (20X/0.95)&nbsp;</td><td>자이스</td><td>20x/0,50W; 플랜-네오플루아르&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>대물렌즈(63X/0.95)</td><td>Zeiss</td><td>63x/0,95W; 애크로플란&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>흑백 CCD 카메라&nbsp;</td><td>파이퍼&nbsp;</td><td>FK 6990 IQ-S&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>DVD-레코더</td><td>Panasonic</td><td>DMR-EX99V&nbsp;</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 염화물</td><td>Braun</td><td>5/12612055/1011</td>은 <td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>케타민 10%</td><td>Bela pharm</td><td>F3901-6</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC-덱스트란 5%</td><td>시그마&nbsp;</td><td>46945-100MG-F</td><td>는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>덱사판테놀 5% 눈 연고</td><td>바이엘</td><td>6029009.00.00</td>은 <td>다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>포름알데히드 4%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>커버슬립 5 x 5 x 1 mm</td><td>Menzel</td><td>L4339</td><td>는 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>접착 스트립</td><td>Leukosilk</td><td>4683400</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>CLGS 15</td><td>는 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>혈액학 분석기</td><td>Sysmex</td><td>KX-21 A6980</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-혈액 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>201,341</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>면봉</td><td>Sanyo</td><td>604-A-1</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>적외선</td><td>Beurer</td><td>5/13855</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>일회용 싱크린지</td><td>브라운&nbsp;</td><td>2020-08</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Braun</td><td>9161502</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>일회용 피하 주사 바늘</td><td>Braun</td><td>465 7640</td>은 <td>다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>종단 간 모세관</td><td>Sarstedt</td><td>19,447</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>가열판</td><td>Klaus Effenberg</td><td>OP-T 185/03</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>가위 14.5 cm</td><td>Aesculap</td><td>BC259R</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Aesculap</td><td>BM081R</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>microforceps</td><td>Aesculap</td><td>BD331R</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로가위</td><td>Aesculap</td><td>OC496R</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>메스 21</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.511</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>XNEH7470</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>프롤렌 6-0</td><td>에티콘</td><td>XN8706. P33</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>전기소작</td><td>Servoprax</td><td>H40140</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>아크릴 유리 패드</td><td></td><td></td><td>통합 가열, 0.5&nbsp; cm 높이 평면</td></tr></tbody></table>

털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

혈관 질환의 혈전 성 합병증은 선진국의 이환율과 사망률의 한 주요 원인이다. 때문에 혈전 형성시 셀룰러 및 비 셀룰러 혈액 성분 간의 복잡한 상호 작용의 생리 학적 및 병태 생리 혈전증의 신뢰성 시험은 생체 내에서 수행 될 수있다. 따라서이 문서는 털이없는 쥐의 귀 모델을 제시하고, 미세, 혈전 형성 및 혈전 진화의 생체 분석에 초점을 맞추고 있습니다. 생체 내에 형광 현미경 및 형광 염료 각각의 정맥 내 (IV) 애플리케이션을 이용함으로써, 귓바퀴의 미세 순환을 반복 분석을 용이하게 수술 준비 할 필요없이 수행 될 수있다. 또한,이 모델은 상처 치유, 재관류 손상, 또는 혈관 신생 등 다양한 문제의 생체 내 연구에 대해 적용 할 수 있습니다. 요약하면, 털이없는 쥐의 귀는에서 비비안을위한 이상적인 모델입니다생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 다른 전신 또는 국소 치료법과의 반응의 평가를 위해 피부의 미세 O 연구.

혈전의 치료 효과 카나비노이드 FITC 덱스 트란 0.05 mL를 주입하면, 광독성 혈전 유도는 (도 2 및도 3). 내피 병변 및 정수리 혈소판 플러그의 형성을 유도 본 연구에있어서, 칸 나비 노이드의 IP 주입 (5 ㎎ / ㎏ 체중) 또는 비히클 후의 혈전 유도는 모든 세정맥에서 혈전 혈관 폐색 (도 4) 결과. 비히클 - 처리 된 동물에서의 혈전 형성 시간 (430 개) S (:, 637의 75 번째 백분위 수 (330)의 25 번째 백분위 수)이었다. 어느 칸 나비 디올 (CBD)도 WIN55,212-2 (WIN) 관리는 혈관 폐색 시간에 관련된 영향을 보여 주었다. 240 : 그러나, 내인성 카나비노이드 아난다 상당히 270 s...

털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

이 실험의 전반적인 목적은 잠재적인 혈관 활성 약물이 생체 내 미세혈관 혈전 형성에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 패혈증 및 조직 이식 과정의 주요 합병증 중 하나인 미세혈관 혈전 형성을 예방하는 데 도움이 될 수 있는 새로운 항혈전 물질을 식별하는 등 혈전 형성과 관련된 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무모 쥐의 귀 모델을 통해 검사 대상 미세혈관층에 대한 사전 수술적 준비 없이도 생체 내 형광 현미경 관찰과 광독성 혈전 유도가 가능하다는 점입니다.먼저 마우스의 체중을 측정하고 기록합니다. 그다음 인슐린 주사기에 적절한 부피의 시험 물질을 충전합니다. 혈전 유도 30분 전에 약물을 투여합니다.혈전 유도 15분 전에 마우스를 마취시킨 후, 마취가 시작될 때까지 마우스를 다시 케이지에 넣습니다. 충분한 마취 여부를 확인하기 위해 포셉으로 꼬리를 집어 반응이 없는지 확인합니다. 다음으로, 해동된 50 Dextran 0.05 ml를 인슐린 주사기에 넣습니다.주사기를 채운 후, 정맥으로 투여되는 작은 공기 방울조차 동물에게 치명적일 수 있으므로 공기 방울이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 마취된 마우스를 가열판이 내장된 acroglass 패드 위에 엎드린 자세로 놓습니다. 가열판의 온도를 37 °C로 조절하십시오.마우스의 각막에 안연고를 도포합니다. 그다음 폴리프로필렌 7.0 봉합사를 사용하여 오른쪽 귀의 전단(cranial edge)과 후단(caudal edge)에 두 군데를 봉합합니다. 봉합사는 가능한 한 가장자리에 가깝게, 그리고 기저부에 최대한 근접하게 배치합니다.마우스를 배측으로 향하게 배치합니다. 모든 다리를 접착 밴드를 사용하여 플랫폼에 고정합니다. 앞니 아래에 봉합사를 걸고, 봉합사를 접착 밴드로 플랫폼에 고정하여 머리를 배측 굴곡 상태로 위치시킵니다.동물을 실체 현미경 아래의 플랫폼 위에 놓습니다. 10배 배율을 사용하십시오. 오른쪽 귀를 현미경으로 관찰하려면, 먼저 목 피부를 머리에서 꼬리 방향으로 5 mm 절개하여 왼쪽 경정맥을 준비합니다.그 다음 마이크로포셉과 마이크로가위를 사용하여 피하 조직을 절개합니다. 그런 다음 혈관에 닿지 않게 주의하며 외막으로부터 정맥을 분리합니다. 이제 미리 준비한 인슐린 주사기를 사용하여 형광 염료를 주입합니다.정맥을 천공하지 않도록 마이크로포셉으로 혈관벽을 조심스럽게 잡습니다. 팽창된 혈관벽에 주사기 바늘을 찔러 50 Dextran을 정맥 내로 주입합니다. 바늘을 뽑고 면봉을 사용하여 지혈합니다.귀 부위에 혈액이나 염료가 오염되지 않도록 주의하십시오. 가열판이 들어갈 틈과 귀 위치 고정을 위한 0.5 cm 높이의 평면이 있는 아크로 글라스 구조물 위로 가열판에 있는 동물을 옮깁니다. 접착 밴드를 사용하여 동물을 가열판 위에 복와위로 고정합니다.귀의 정점 부분이 평면에 평평하게 놓일 수 있도록, 볼록한 연골을 귀용 평면 옆의 귀 기저부에 배치합니다. 상온의 aqua 한 방울을 acro glass 플레이트에 첨가합니다. 면봉을 사용하여 aqua 한 방울을 흡수시키고, 모세관력에 의해 귀 평면이 acro glass에 부착되도록 합니다.연골로 인해 이개는 볼록한 형태를 띠지만, 가능한 한 평평하게 배치해야 합니다. 따라서 이개의 부분 중 더 유연한 원위부만을 아크릴 유리판 위에 놓아야 합니다. 조직 손상과 액체 및 염료의 유출을 방지하기 위해, 핀셋으로 귀를 만지는 횟수를 최소화하십시오.다음으로, 귀의 볼록한 등쪽에 aqua를 한 방울 떨어뜨립니다. 귀로 들어가는 기저 혈관이 압착되지 않도록 주의하며 귀 위에 커버 슬립 하나를 덮습니다. 면봉을 사용하여 커버 슬립 아래에서 가능한 한 많은 aqua를 제거함으로써, 커버 슬립과 대상 귀 혈관 사이의 거리를 최소화합니다.먼저 50 Dextran 시각화를 위해 생체 내 형광 현미경을 조정합니다. 준비된 동물을 생체 내 형광 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 5X, 10X 및 20X 배율과 20% 광도를 사용하여 직경 50~60 µm이며 순방향 혈류가 흐르는 정맥 혈관을 찾습니다.63X 배율 대물렌즈의 수침(water immersion)을 위해 커버 슬립에 실온의 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 물방울을 떨어뜨린 직후, 직경과 혈류의 기선(baseline) 평가를 위해 20초 동안 혈관을 녹화하기 시작합니다. 50 Dextran 주입 5분 후에 혈전 유도를 시작합니다.이를 위해 광도를 100%로 높입니다. 광독성 혈전 유도 과정 동안, 30초 간격으로 현미경의 조리개를 2초 동안 닫아 혈류 폐쇄 여부를 확인합니다. 혈류가 계속 유지되면 조리개를 다시 엽니다. 혈류가 30초 이상 정지하거나 혈류가 역행하는 경우, 해당 혈관을 폐쇄된 것으로 분류합니다.50 Dextran 주입 후 1시간 이내에 귀당 5개의 혈관을 선택하여 폐쇄합니다. 본 실험에서는 혈전 유도 전 50 Dextran 주입 이전에 동물에게 vehicle 또는 칸나비노이드인 anandamide, WIN 155, 212-2 또는 cannabidiol을 투여하였습니다. vehicle 대조군과 비교했을 때, CBD는 그렇지 않았으나 anandamide와 WIN 155, 212-2는 1회 투여 후 혈전 성장을 유의미하게 가속화했습니다.다른 실험 환경에서, anandamide를 indomethacin과 병용 투여하여 cyclooxygenase 의존적 생성물이 anandamide를 통한 혈전 형성에 미치는 영향을 평가하였습니다. indomethacin을 함께 투여했을 때 anandamide의 혈전 형성 촉진 효과가 상쇄되었습니다. 따라서, anandamide에 대한 급성 노출은 in vivo에서 cyclooxygenase 의존적인 혈전 형성 촉진 효과를 유발합니다.숙달되면 준비 시간을 포함하여 좁은 혈관 내 혈전 유도를 90분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 액체와 염료의 혈관 외 유출을 방지하기 위해 귓바퀴를 만질 때마다 매우 주의해서 다루는 것이 중요합니다. 이 방법은 혈전 형성에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 상처 치유, 플랩 괴사 및 혈관 신생과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 생체 내 광독성 혈전 유도를 수행하기 위한 정맥 내 형광 염료 투여, 이개(auricle)의 위치, 그리고 특정 혈관의 조명법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

이 비디오는 감광성 염료 투여 후 손상되지 않은 두개골의 레이저 조명으로 마우스 모델에서 광혈전 스트로크를 생성하는 절차를 보여줍니다.

마우스 모델의 광혈전성 스트로크 모델링: 광혈전증을 유발하기 위해 감광성 염료 투여 후 마우스 두개골을 통한 레이저 조명 기술

이 비디오는 마우스 모델에서 혈전 형성을 연구하기 위한 생체 내 형광 현미경 검사 기술을 보여줍니다. 마우스는 혈액 순환을 모니터링하기 위해 형광단이 표지된 다당류를 주입합니다. 고강도의 빛으로 조명을 비추면 귀의 미세 혈관 구조에서 손상의 광독성 유도가 혈전을 형성하게 되며, 이는 혈류의 방해를 시각화하여 확인됩니다.

미세혈관 혈전 형성을 연구하기 위한 Intravital Fluorescence Microscopy

출처: Kim, D., et. al. 대뇌 혈전색증을 직접 시각화하기 위해 근적외선 형광 이미징과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 결합했습니다. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 이미징을 사용하여 마우스의 뇌 혈전을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 대뇌 혈전 마우스 모델에는 조영제 역할을 하는 피브린 표적 금 나노 입자가 주입됩니다. 마우스를 마이크로 CT 기계의 침대에 놓고 여러 각도에서 이미지를 획득합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 재구성하고 처리합니다.

Visualization of a Cerebral Thrombus in a Mouse Using Micro-Computed Tomography Imaging(마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징을 사용한 마우스의 대뇌 혈전 시각화)

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

배우세요 털이 마우스 귓불 모델을 이용한 생체 내 현미경 및 혈전 유도 방법을. 이 기술은 미세혈관 혈전 형성과 혈관활성 약물의 영향을 실시간으로 관찰하여 패혈증 및 조직 이식 합병증 연구에 활용됩니다.

털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

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