털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

이 실험의 전반적인 목적은 잠재적인 혈관 활성 약물이 생체 내 미세혈관 혈전 형성에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 패혈증 및 조직 이식 과정의 주요 합병증 중 하나인 미세혈관 혈전 형성을 예방하는 데 도움이 될 수 있는 새로운 항혈전 물질을 식별하는 등 혈전 형성과 관련된 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무모 쥐의 귀 모델을 통해 검사 대상 미세혈관층에 대한 사전 수술적 준비 없이도 생체 내 형광 현미경 관찰과 광독성 혈전 유도가 가능하다는 점입니다.

먼저 마우스의 체중을 측정하고 기록합니다. 그다음 인슐린 주사기에 적절한 부피의 시험 물질을 충전합니다. 혈전 유도 30분 전에 약물을 투여합니다.

혈전 유도 15분 전에 마우스를 마취시킨 후, 마취가 시작될 때까지 마우스를 다시 케이지에 넣습니다. 충분한 마취 여부를 확인하기 위해 포셉으로 꼬리를 집어 반응이 없는지 확인합니다. 다음으로, 해동된 50 Dextran 0.05 ml를 인슐린 주사기에 넣습니다.

주사기를 채운 후, 정맥으로 투여되는 작은 공기 방울조차 동물에게 치명적일 수 있으므로 공기 방울이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 마취된 마우스를 가열판이 내장된 acroglass 패드 위에 엎드린 자세로 놓습니다. 가열판의 온도를 37 °C로 조절하십시오.

마우스의 각막에 안연고를 도포합니다. 그다음 폴리프로필렌 7.0 봉합사를 사용하여 오른쪽 귀의 전단(cranial edge)과 후단(caudal edge)에 두 군데를 봉합합니다. 봉합사는 가능한 한 가장자리에 가깝게, 그리고 기저부에 최대한 근접하게 배치합니다.

마우스를 배측으로 향하게 배치합니다. 모든 다리를 접착 밴드를 사용하여 플랫폼에 고정합니다. 앞니 아래에 봉합사를 걸고, 봉합사를 접착 밴드로 플랫폼에 고정하여 머리를 배측 굴곡 상태로 위치시킵니다.

동물을 실체 현미경 아래의 플랫폼 위에 놓습니다. 10배 배율을 사용하십시오. 오른쪽 귀를 현미경으로 관찰하려면, 먼저 목 피부를 머리에서 꼬리 방향으로 5 mm 절개하여 왼쪽 경정맥을 준비합니다.

그 다음 마이크로포셉과 마이크로가위를 사용하여 피하 조직을 절개합니다. 그런 다음 혈관에 닿지 않게 주의하며 외막으로부터 정맥을 분리합니다. 이제 미리 준비한 인슐린 주사기를 사용하여 형광 염료를 주입합니다.

정맥을 천공하지 않도록 마이크로포셉으로 혈관벽을 조심스럽게 잡습니다. 팽창된 혈관벽에 주사기 바늘을 찔러 50 Dextran을 정맥 내로 주입합니다. 바늘을 뽑고 면봉을 사용하여 지혈합니다.

귀 부위에 혈액이나 염료가 오염되지 않도록 주의하십시오. 가열판이 들어갈 틈과 귀 위치 고정을 위한 0.5 cm 높이의 평면이 있는 아크로 글라스 구조물 위로 가열판에 있는 동물을 옮깁니다. 접착 밴드를 사용하여 동물을 가열판 위에 복와위로 고정합니다.

귀의 정점 부분이 평면에 평평하게 놓일 수 있도록, 볼록한 연골을 귀용 평면 옆의 귀 기저부에 배치합니다. 상온의 aqua 한 방울을 acro glass 플레이트에 첨가합니다. 면봉을 사용하여 aqua 한 방울을 흡수시키고, 모세관력에 의해 귀 평면이 acro glass에 부착되도록 합니다.

연골로 인해 이개는 볼록한 형태를 띠지만, 가능한 한 평평하게 배치해야 합니다. 따라서 이개의 부분 중 더 유연한 원위부만을 아크릴 유리판 위에 놓아야 합니다. 조직 손상과 액체 및 염료의 유출을 방지하기 위해, 핀셋으로 귀를 만지는 횟수를 최소화하십시오.

다음으로, 귀의 볼록한 등쪽에 aqua를 한 방울 떨어뜨립니다. 귀로 들어가는 기저 혈관이 압착되지 않도록 주의하며 귀 위에 커버 슬립 하나를 덮습니다. 면봉을 사용하여 커버 슬립 아래에서 가능한 한 많은 aqua를 제거함으로써, 커버 슬립과 대상 귀 혈관 사이의 거리를 최소화합니다.

먼저 50 Dextran 시각화를 위해 생체 내 형광 현미경을 조정합니다. 준비된 동물을 생체 내 형광 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 5X, 10X 및 20X 배율과 20% 광도를 사용하여 직경 50~60 µm이며 순방향 혈류가 흐르는 정맥 혈관을 찾습니다.

63X 배율 대물렌즈의 수침(water immersion)을 위해 커버 슬립에 실온의 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 물방울을 떨어뜨린 직후, 직경과 혈류의 기선(baseline) 평가를 위해 20초 동안 혈관을 녹화하기 시작합니다. 50 Dextran 주입 5분 후에 혈전 유도를 시작합니다.

이를 위해 광도를 100%로 높입니다. 광독성 혈전 유도 과정 동안, 30초 간격으로 현미경의 조리개를 2초 동안 닫아 혈류 폐쇄 여부를 확인합니다. 혈류가 계속 유지되면 조리개를 다시 엽니다. 혈류가 30초 이상 정지하거나 혈류가 역행하는 경우, 해당 혈관을 폐쇄된 것으로 분류합니다.

50 Dextran 주입 후 1시간 이내에 귀당 5개의 혈관을 선택하여 폐쇄합니다. 본 실험에서는 혈전 유도 전 50 Dextran 주입 이전에 동물에게 vehicle 또는 칸나비노이드인 anandamide, WIN 155, 212-2 또는 cannabidiol을 투여하였습니다. vehicle 대조군과 비교했을 때, CBD는 그렇지 않았으나 anandamide와 WIN 155, 212-2는 1회 투여 후 혈전 성장을 유의미하게 가속화했습니다.

다른 실험 환경에서, anandamide를 indomethacin과 병용 투여하여 cyclooxygenase 의존적 생성물이 anandamide를 통한 혈전 형성에 미치는 영향을 평가하였습니다. indomethacin을 함께 투여했을 때 anandamide의 혈전 형성 촉진 효과가 상쇄되었습니다. 따라서, anandamide에 대한 급성 노출은 in vivo에서 cyclooxygenase 의존적인 혈전 형성 촉진 효과를 유발합니다.

숙달되면 준비 시간을 포함하여 좁은 혈관 내 혈전 유도를 90분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 액체와 염료의 혈관 외 유출을 방지하기 위해 귓바퀴를 만질 때마다 매우 주의해서 다루는 것이 중요합니다. 이 방법은 혈전 형성에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 상처 치유, 플랩 괴사 및 혈관 신생과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 생체 내 광독성 혈전 유도를 수행하기 위한 정맥 내 형광 염료 투여, 이개(auricle)의 위치, 그리고 특정 혈관의 조명법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.