Name: 의 시냅틱 변조 분석 노랑 초파리 장시간 빛에 노출 후 광수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 광수용기에서 시냅스 활성대 수와 공간 분포를 정량화하는 방법입니다. 장시간 빛 노출 후 시냅틱 변조를 분석하여 신경 가소성 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 원고에 도움이 수정, 토론 및 의견 T. Stürner에 감사하고 있습니다; 플라이 주식을 제공하는 SL Zipursky; 화상 처리를 행하는 M Schölling. 이미지 분석의 일부는 A. Kakita의 실험실에서 수행되었다. 이 작품은, 혁신적인 분야에 시동을위한 알렉산더 폰 훔볼트 재단과 JSPS 동호회 해외 연구 (AS), JSPS 휄로우 (SH-S.), 그랜트-IN- 원조 (24800024), (25110713), 모치다에 의해 지원되었다 다케다, 이나모리, 다이 이치 산쿄, 도레이 재단 (TS), DZNE 핵심 자금 (GT)과 DZNE 광학 현미경 시설 (CM).

이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 독점적으로 초파리와 함께 작동 것을 포함하고 독일과 일본에서 동물 복지 법률을 실시하지 않습니다. 1. 빛 노출 조건 <ol><li> 광 수용체 R8 뉴런 (의 R8)에 BRP-GFP를 시각화 sensless-flippase (SENS-FLP) 및 bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15를 가지고 파리를 준비합니다. 세균 인공 염색체 (BAC) 내의 게놈 궤적 인코딩 BRP이 BRP-FSF-GFP 구조를 생성하도록 수정되었습니다. 이 변형 BAC에게 BRP-GFP의 발현을 수행 파리에서 내인성 조절 서열의 제어하에, 그러나 FRT-STOP-FRT 카세트 (15)의 sensless-flippase - 매개 R8 제거한 후 광 수용체로 제한. SENS-FLP 거의 R7S에 flippase 없음을 표현합니다. </li><li> 12 시간 리에서 파리를 유지우화 (그림 1A)까지 유충 단계에서 25 ° C에서 GHT / 12 시간 다크 사이클 (LD). </li><li> 우화 후 6 시간과 비행 음식을 포함하는 새로운 유리 병에 그들을 배치 - 파리 0를 수집합니다. </li><li> 세 단계 (41cm, 높이 21 cm의 기재 4 cm의 두께와 각 단계 13cm 높이) (도 1B) 아크릴 수지의 투명 랙에 튜브를 설정한다. </li><li> 디지털 광 측정기 (도 1C)를 사용하여 1,000 룩스의 평균 강도로 조명을 제공하도록 랙과 LED 패널 사이의 거리를 조정한다. </li><li> 1 파리 유지 - 다음 조건 중 하나에 3 일을 : 작은 배양기에서 25 ° C에서 상수 어둠 (DD), 12 시간 조명 / 12 시간 다크 사이클 (LD), 또는 일정한 빛 (LL) (도 1a 및 1C). </li></ol> 2. 해부, 면역 및 이미징 <ol><li> , 집게와 플라이 뇌를 해부 4 % FO로 해결Chaoptin에 대한 일차 항체 (1시 50분) 이전 실험 절차 (25)에 따라 광 수용체의 시각화를위한 두 번째 항체 rmaldehyde 및 발현 사이. 간단히: <ol><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 (0.1 % PBT)를 준비한다. 이 용액을 항체 조직 침투를 개선하기 위해 사용된다. </li><li> 하는 CO 2 패드에 파리를 마취 정확한 유전자형을 분류하고 0.1 % PBT 가득 배양 접시로 전송. </li><li> 프로보 시스 아래에있는 집게를 스틱, 다른 집게로 각각 오른쪽과 왼쪽 눈을 떼어. </li><li> 프로보 시스 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다. </li><li> RT에서 0.1 % PBT 150 μL를 포함하는 1.5 ML의 튜브에 집게로 머리를 전송합니다. </li><li> 2.1.3에서 10 분 반복 내 - 2.1.5 가능한 한 많은 두뇌을 얻었다. </li><li> 튜브에 16 %의 포름 알데히드의 50 μL를 추가하고 피펫으로 혼합한다. </li><li> 방에서 정착액에 머리를 품어50 분 동안 온도. </li><li> 튜브에 머리를 떠나지주의를 기울이고, 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다. </li><li> 다음 마지막으로 세척 한 후, 제조 된 0.1 %의 PBT를 제거하고 차 항체 용액을 추가 0.3 % PBT (0.3 % PBS 트리톤 X-100) 안티 Chaoptin 항체 4 μL (최종 희석 한 196 μL 추가 : 광 수용체의 시각화를위한 50). </li><li> 4 ° CO / N에서 차 항체 용액에 머리를 품어. </li><li> 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL 씻을 배. </li><li> 마지막 세척 후, 0.1 % PBT를 제거하고 차 항체를 함유하는 0.3 % PBT 200 μL를 추가한다. </li><li> 4 ° CO / N에서 어둠 속에서 그것을 품어. </li><li> 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다. </li></ol></li><li> 장착 약 2cm의 dista에서 현미경 슬라이드의 중심에 마이크로 피펫으로 장착 매체 (2 μL를 각각의) 두 개의 작은 방울을 넣어서로 NCE. </li><li> 각 드롭에 두 개의 커버 슬립, 하나를 놓고 약 0.2 mm의 커버 슬립 사이의 좁은 간격을 둡니다. </li><li> 커버 슬립의 상단에 장착 매체의 15 μL를 넣고 설치 매체에 마이크로 피펫으로 머리를 추가합니다. </li><li> 해부 현미경, 두 개의 커버 슬립 사이의 좁은 틈 (그림 2)에 최대 복부 측면과 두뇌를 놓습니다. </li><li> 상단에 커버 슬립을 놓고 시편 (그림 2)을 해결하기 위해 명확한 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. </li><li> 공 초점 현미경으로 뇌의 이미지를 얻습니다. 63X 기름 침지 대물 렌즈 (1.4 NA) 및 2.6 디지털 줌을 사용합니다. 0.5 ㎛의 스텝 사이즈를 상기 제 2 광섬유 신경절 수질 20 개 이상의 광 부분을 생성한다. </li></ol> 반점, 표면 개체, 시작 포인트 및 엔드 포인트의 3 세대 <ol><li> 의 DISTR을 수를 정량화하기ibution과 BRP-GFP의 puncta의 비편 재화의 레벨은, 이미지 분석 소프트웨어에 공 초점 현미경에 의해 얻어지는 스택을 열고 3D 영상 (도 3a)를 재구성한다. 이 연구의 단계가 Imaris 수행 하였다합니다. </li><li> 각 R8의 축삭 터미널 자리 검출 모듈에 의해 BRP-GFP의 puncta의를 식별합니다. <ol><li> &quot;새로운 관광 명소를 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 터미널을 선택합니다. </li><li> BRP-GFP 신호의 소스 채널을 선택합니다. 참고 : R7 및 R8 광 수용체의 축색 돌기가 반 Chaoptin (그림 3A)와 immunolabeled했다. 만 R8은, 그러나, BRP-GFP의 puncta에 포함되어있어 쉽게 (그림 3A) 구분 될 수있다. 또한, R8의 종점은 M3의 수질 층 진입 점에서 반 Chaoptin 양성 축삭의 씨닝에 의해 식별 될 수있다. </li><li> 추정 XY 직경 t 설정ㅇ 0.35 μm의 그 자리 검출에 &quot;배경 빼기를&quot;오프 확인합니다. </li><li> 필터 유형에서 &quot;품질&quot;을 선택하고 자동으로 필터링합니다. 다음 마침을 클릭합니다. </li><li> 다른 R 축삭 (그림 3B)에 대한 3.2.1 T-3.2.5에서 반복합니다. </li></ol></li><li> , R8 축삭의 BRP-GFP의 비편 재화 수준을 측정하는 각각의 축삭 (그림 3C)의 &quot;표면&quot;기능과 표면 객체를 생성합니다. <ol><li> &quot;새로운 표면 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 단자를 선택합니다. </li><li> 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다. </li><li> &quot;부드럽게&quot;오프 확인합니다. </li><li> 임계 값에 &quot;절대 강도&quot;를 선택합니다. </li><li> 확인 &quot;사용&quot;. &quot;씨 포인트 직경은&quot;0.5 μm의입니다. </li><li> 선택 필터 유형 &quot;품질&quot;과 &quot;복셀의 수&quot;를 선택한 후, 사설 필터링으. </li><li> &quot;편집&quot;로 이동 및 기타 비 흥미로운 축삭에서 발생하는 표면의 조각을 삭제합니다. </li><li> 다른 R 축삭 (그림 3C)에 대한 3.3.8 - 3.3.1에서 반복합니다. 주 표면 일부 개체 때문에 박형화 및 M2 층에서의 감광체의 약한 신호의 방해 되었으나, 이들은 여전히 ​​시작에서 끝 지점에 하나의 오브젝트로 간주 하였다. </li></ol></li><li> 수질의 neuropil의 각 신경 세포를 따라 BRP-GFP의 puncta의 분포를 확인하려면, 측정 지점 기능 (그림 3D)로 시작 지점과 끝 지점을 정의합니다. <ol><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 표면 객체의 상단과 교차하는 &quot;개체의 표면&quot;을 선택합니다. </li><li> 위해 M1 층에서 R 축삭의 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣습니다. 이 이제 시작 지점 (그림 3D)로 정의됩니다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다.그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 표면 객체의 바닥과 교차하는 &quot;개체의 표면&quot;을 선택합니다. </li><li> 위해서는 M3 층 R 축삭의 표면 물체의 저면에 측정점을 넣어. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3D)로 정의됩니다. </li></ol></li><li> 는 GFP 채널에서 배경 신호를 빼 M6 층 (그림 3E)에 두 개의 R 축삭에 대해 표면 객체, 관광 명소, 시작 지점과 끝 지점을 생성합니다. <ol><li> &quot;새로운 표면 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동 M5와 M6 층 사이에 R7의 축삭 터미널을 선택합니다. </li><li> 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다. </li><li> &quot;부드럽게&quot;오프 확인합니다. </li><li> 임계 값에 &quot;절대 강도&quot;를 선택합니다. </li><li> 선택 필터 유형 &quot;품질&quot;과 &quot;복셀의 수&quot;, 자동으로 필터링 할 수 있습니다. </li><li> &quot;새로운 관광 명소를 추가&quot;를 선택;. </li><li> &quot;수동으로 편집, 자동 생성을 건너 뛰기&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;개체의 센터&quot;를 선택하고 3.5.1에서 발생하는 표면 객체의 내부 지역에 지점을 추가 - 3.5.6. </li><li> 다른 R7의 축삭 터미널 3.5.9 - 3.5.1에서 반복합니다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣어. 이 이제 시작 지점으로 정의된다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체의 바닥에 측정 지점을했습니다. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3E)로 정의됩니다. </li></ol></li></ol> 관광 명소의 번호 4. 계산, 스팟 주파수 및 배포 사용자 정의 된 이미지 데이터 분석 소프트웨어와 BRP-GFP의 농축 수준 <ol><li> 파일을 복사&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot;및 Imaris XT matlab에 폴더에 &quot;기능&quot;폴더. 이 연구에서 계산 matlab에 구현 된 사용자 정의 플러그인을 실시 하였다합니다. 웹 사이트 (에서 플러그인을 다운로드 <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> N 관광 명소, n은 표면이 측정 점 개체, (- 3.4 3.1에서 준비) 각각 포함하는 n 개의 측정 포인트 데이터 집합을 엽니 다. 제 1 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 시작 위치를 정의한다. 두 번째 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 끝 위치를 정의한다. 두 측정점 개체 측정점 동일한 수 (즉 축삭의 수이다)이 필요. </li><li> 실행 이미지 처리 &gt;&gt; CUSTOM는&gt; 시냅스 감지 6 대 atsushis. </li><li> 메타 데이터를 확인하고 정확하지 않은 경우 이미지 분석 소프트웨어의 픽셀 크기를 변경합니다. </li><li> 반환 한 선택 채널스폿 영역 및 세포질 영역 (BRP-GFP와 채널)의 강도를 분석 필요치 않는. </li><li> 결과를 내보낼 파일 이름을 정의합니다. </li><li> 백분율 빈들 및 엑손 길이의 수를 정의한다. &quot;10&quot;로 빈과 &quot;100 %&quot;(도 4a 및도 4b)와 같은 빈의 범위의 번호를 입력합니다. </li><li> BRP-GFP의 비편 재화 분석 스폿 다른 세포질 영역의 영역을 정의한다. 입력 반점은 &quot;0.35 μm의&quot;와 &quot;50 μm의&quot;로 주변 지역의 폭으로 반경. 스폿 반경 (하나 누점 중심 0.35 ㎛의 직경)을 puncta에의 GFP 신호를위한 영역을 정의한다. 주변 지역의 폭은 세포질 영역에서 GFP 신호를위한 영역 정의 (누점 중심 50㎛의 직경 있지만 R8 포함 세포질에서 모든 반점 영역을 제외하고) (도 4a 및도 4c). </li><li> 모든 신경 세포 마스크가 처리 될 때까지 기다립니다그리고 PDF 파일 (도 4b 및도 4c)와 스프레드 시트에 추가 분석을 위해 CSV 테이블로 수출했다. csv로 테이블 스폿의 수는 &quot;세포질 영역&quot;및 모든 R8 축삭 각 bin에 &quot;얼룩&quot;의 최대 신호 강도의 평균 신호 세기를 포함한다. </li><li> 배경 신호의 공제 3.5에서 제조 된 데이터 집합을 엽니 다. </li><li> 4.9-4.3에서 설명한 바와 같이 화상 처리를 수행한다. </li><li> 총 수의 평균 스프레드 시트 (도 4D 및 4E)의 BRP-GFP의 puncta의 분포를 계산합니다. </li><li> 상기 배경 신호의 평균 휘도 감산 &quot;스팟&quot;의 최대 강도로 나눈 &quot;세포질 영역&quot;의 평균 강도의 비에 의해 스프레드 BRP-GFP 신호의 비편 재화의 평균을 계산한다 (도 4F) . </li></ol>

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본 연구에서는 동일한 빛의 세기에 파리를 노출하는 조명 조건을 준비하는 방법을 보여 주었다. 우리는 단지 시냅스 마커 puncta의 수를 정량 아니라 축삭을 따라 공간적으로 시냅스의 밀도를 해결 세포질 영역에서 마커 단백질의 비편 재화 수준을 측정 할 수있다. 이 세 가지 평가는 우리가 다른 환경 조건에서 단일 신경 세포 수준에서 시냅스 역학의 세부 사항을 평가 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 서로 다른 시냅스 단백질뿐만 아니라 반점 신호를 포함하는 모든 데이터에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 뇌의 장착입니다. 초파리의 광 수용체는 두 번째 광학 신경절 수질에 자신의 축삭 전망이다. 장착 뇌 올바르게 현미경 슬라이드 상에 배치 된 경우, 각 감광체 엑손이 노골적 스캔 할 수있다. 올바른 장착 또한 화상 해석 softwa와 감광체의 선택을하게쉽게 기능을 다시. 각 수광 영역 puncta의 수와 비편 재화 레벨 카운트 수동으로 선택해야한...

<html> 시냅스 기능의 변조를 정확하게 대응 자극이나 환경 변화에 적응할 수있는 신경계의 놀라운 능력에 기여한다. 시냅스 소포 방출 확률을 조정 한 시냅스 강도를 제어하는 하나의 방법이다. 시냅스 소포 릴리스는 활성 영역 (AZ), 시냅스 막 2의 전문 영역에서 발생한다. AZ는 특정 단백질 (3)의 카세트, (4)에 의해 특징입니다. AZ 어셈블리에 기여하는 대부분의 단백질은 매우 선충, 곤충, 포유류 (5)에 보존되어있다. 최근의 연구는 신경 활동의 레벨이 차례로 모두 시험 관내 및 생체 내 (6, 7)의 출력 기능의 조절에 기여 AZ, 분자 조성을 조절하는 것을 제안&gt; 8. 우리는 이전에 광 수용체 AZS 자연 환경 광 (9)에 장시간 노출 된 후 초파리의 분자 리모델링을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 상태에서는 Bruchpilot (BRP) 양성 AZS 수가 감광체 축삭 감소되었음을 관찰 하였다. BRP / CAST / ELKS 가족 단백질은 척추 동물과 무척추 동물의 시냅스 (10) AZS의 기본 빌딩 블록입니다. 초파리 BRP 돌연변이 체에서 소포 자료, 12 (11)을 억제 유발. BRP 17의 C 말단 아미노산 잔기는 초파리 신경근 접합 (NMJ) (13) (14)에 연접 소포 클러스터링 필수적이다. 이 연구는 AZ의 조직과 기능에서이 분자의 중심 역할을 보여 주었다. 재조합 (STAR), BRP와 최근에 개발 된 유전 도구, 시냅틱 태그와내인성 발현 수준 번의 시냅스 해상도 15, 특정 유형의 세포에서 생체 내에서 관찰 할 수있다. 이 도구는 가능한 정량적 복소 중추 신경계의 시냅스 내인성 역학을 평가한다. 공 초점 현미경에서 얻은 정보에 기초하고 시냅스의 정량화를 포함한 여러 연구가 있었다. 시냅스 변화는 길이, 면적, 체적 밀도를 측정하고 정교한 소프트웨어 애플리케이션에 기초하여 상기 수를 계수하여 평가 하였다. 예를 들어, 프리웨어 ImageJ에 총 시냅스 영역 및 초파리 NMJ 16 시냅스 농도를 측정하는 정량 방법을 제공한다. 사전 및 시냅스 마커의 colocalization을 사이트의 수는 ImageJ에 소프트웨어 플랫폼 (17)에서 사용할 수있는 플러그인 &quot;puncta의 분석&quot;을 사용하여 정량화하고있다. 대안 적으로, 다중 파adigm 수치 컴퓨팅 환경을 기반으로 프로그램 시냅스 검출기 (신디케이트)는 자동 형광 마커로 표지 된 신경 돌기를 추적 한 다음, 전지 본체 (18)로부터의 거리의 함수로서 시냅스 단백질 수준을 정량화 할 수있다. 소프트웨어 시냅스 puncta의 분석 (SynPAnal)은, 공 초점 형광 현미경으로부터 취득 뉴런의 2 차원 영상의 신속한 분석을 위해 설계되었다. 이 소프트웨어의 주요 기능은 단백질 puncta의 (19)의 밀도 및 강도의 자동적이고 빠르게 정량화이다. 최근, 자동 학습 기반 시냅스 검출 알고리즘은 3 차원 시각화 이용한 분석 (Vaa3D) 소프트웨어 (21)을 활용 3D 20 시냅스 수 정량에 대해 생성되었다. 상용 이미지 분석 소프트웨어는 또한 시냅스 정량화를위한 ​​강력한 도구입니다. 예를 들어, 형광표지 된 신경 전달 물질 수용체 또는 시냅스 AZ 구성 요소는 C에서 단일 시냅스 해상도 22 엘레 간스 또는 시냅스의 수백을 허용 초파리 후각 시스템 23, 24, 빠르게 하나의 샘플에서 특징으로하는 세 차원으로 정량화되고있다. 여기서는 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어에 의한 방법을 제시 플러그 그들의 수, 분포 및 분자량 성분의 농축 수준으로 포함 AZS의 반자동 여러 양상을 분석 할 수있는 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에서 구현 AZ. 따라서,이 복잡한 분석은 서로 다른 환경 조건 하에서 축삭 터미널에서 시냅스 구성 요소의 역학을 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 성인 플라이 광 수용체의 출력 시냅스에 빛 노출의 효과를 조사 하였다. 프로 시저가 세 단계로 수행된다 : 1)노광, 2) 해부, 면역 조직 화학 및 공 초점 이미징, 3) 이미지 분석을위한 준비.

<table><tbody><tr><td>Vial</td><td>Hightech, 일본</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>플러그</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, 미국</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 수지로 만든 맞춤형 투명 랙&nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, 일본</td><td></td><td>높이 41cm, 기부 21cm, 두께 4cm 및 각 단계 높이 13cm</td></tr><tr><td>쿨 인큐베이터</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, 일본</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED 패널</td><td>MISUMI, 일본</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>디지털 조도계</td><td>CEM DT-1301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라이 패드</td><td>Tokken, 일본</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (35 x 10mm)</td><td>Greiner Bio-One International, 독일</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Takara, 일본</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, 일본</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Sarstedt, 독일</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 16%</td><td>NEM, 일본</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>항 chaoptin 항체</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated anti-mouse 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td><td>Zeiss, 독일</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>산업용 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경 조명</td><td>Olympus, 일본</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Zeiss</td><td>, 독일</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, 스위스</td><td></td><td>버전 7.6.4 이상</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel, Mac&nbsp;</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

신경계는 적응하고 다양한 자극에 반응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 이 신경 조정은 크게 시냅스 수준에서 소성을 통해 달성된다. 활성 영역 (AZ)는 신경 전달 물질 방출을 매개과 골격 단백질의 조밀 한 컬렉션으로 구성되어 시냅스 막에서의 영역이다. 노랑 초파리의 AZS은 (초파리) 광 수용체 자연 주변 광에 장시간 노출 된 후 분자 리모델링을 받다. 따라서, 신경 세포 활성도의 레벨은 AZ의 분자 성분을 재 배열하여 출력 기능의 조절에 기여할 수있다. 면역 조직 화학에 빛을 노출 설정 준비에서 시작,이 프로토콜은 수, 공간적 분포 및 초파리의 광 수용체에 AZS에서 시냅스 분자의 비편 재화 수준을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이미지 분석 SOF 사용tware의 GFP 융합 AZ 구성 요소 Bruchpilot의 클러스터는 각 R8의 광 수용체 (R8) 축삭 터미널 확인되었다. 감지 Bruchpilot 명소가 자동으로 개별 R8의 축삭에 할당되었다. 축삭을 따라 자리 주파수의 분포를 계산하기 위해, 우리는 사용자 정의 소프트웨어 플러그인을 구현했습니다. 각 축삭의 시작 지점과 끝 지점을 수동으로 정의 된 각 Bruchpilot 지점의 위치는 시작과 끝 지점 사이의 연결 라인에 투영되었다. Bruchpilot 클러스터의 수 외에, 우리는 또한 클러스터 내의 Bruchpilot-GFP의 비편 재화 수준을 정량화. 이러한 측정은 서로 다른 환경 조건 하에서 단일 신경 세포의 공간적 해결 시냅스 역학 자극에 구체적으로 반영합니다.

초파리의 겹눈은 ~ 780 ommatidia, 개안을 포함, 광 수용체 각각 포함 8 종류 (R1-8). R7 및 R8 프로젝트가 층 M6와 M3, 각각 26 시냅스를 형성하는 두 번째 광학 신경절, 수질, 그들의 축삭. 광 수용체 R8 활성 영역의 분자 구성에 빛에 장시간 노출의 영향을 조사하기 위해, 우리는 별 방법 (15)을 이용했다. BRP의 내생 발현 수준은 형광 영상 축적 FLP에서 파생 된 R8의 광 수용체 표현 된 flippase와 BRP-FSF-GFP의 종결 코돈을 뒤집기로 표시 하였다. 25 ° C (그림 1A)에서 시간의 같은 기간 LL, LD 또는 DD의 우화 후 3 일 - 파리 1 동안 유지되었다. 1000 룩스의 빛에 노출시키기 파리, 파리는 아크릴 수지 랙 (도 1b...

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 서로 다른 활성화 조건 하에서 단일 뉴런의 시냅스 동역학을 이해하는 것입니다. 이 방법은 뉴런 활성의 성숙에 따른 시냅스의 분자 조성 변화를 밝히는 것과 같이 시냅스 가소성 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시냅스의 수, 분포, 그리고 시냅스 후 분자 성분의 농축 수준을 포함한 시냅스의 다양한 측면을 반자동으로 분석할 수 있다는 점입니다.본 실험을 위해, 우화 후 6시간 이내에 파리들을 일반 바이알에 수집하십시오. 수집된 바이알을 투명 아크릴 랙에 넣습니다. 25 °C로 설정된 소형 인큐베이터 내에서, 빛 노출량이 평균 1000 lux가 되는 LED 패널로부터 정확한 거리에 랙을 배치하십시오.그런 다음, 지속적인 암흑, 12시간 명기/12시간 암기, 또는 지속적인 명기의 조건 중 하나를 선택하여 초파리를 1~3일 동안 사육합니다. 이후 표준 기술을 사용하여 뇌를 적출하고 염색합니다. 초파리 뇌를 마운팅하려면, 마이크로피펫에 마운팅 용액을 채운 뒤 현미경 슬라이드 중앙에 2 µL 방울 두 개를 약 2 cm 간격으로 떨어뜨립니다.각 방울 위에 커버슬립을 덮고 틈새를 약 0.2 mm 정도로 유지합니다. 그다음 커버슬립 위와 틈새 사이로 15 µL의 마운팅 용액을 넣습니다. 해부 현미경 하에서 마이크로피펫을 사용하여 뇌 조직을 틈새 안으로 옮깁니다.그런 다음 뇌의 복측 면이 위로 오도록 배치합니다. 마지막으로 커버슬립을 덮고 투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다. 이후 표준 기술을 사용하여 뇌를 촬영함으로써 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다.본 사례에서는 star 방법을 사용하여 Brp 발현이 활발한 세포에서 GFP 발광을 기록하였습니다. 또한, 이 예시에서는 R7 및 R8 광수용기 축삭을 anticiaoptin으로 면역 표지하였으며, 이는 RFP가 표지된 2차 항체를 사용하여 관찰하였습니다. Brp GFP puncta의 수, 분포 및 탈국소화 수준을 정량화하려면, 먼저 이미지 스택으로 제작된 뇌의 재구성된 3D 이미지를 불러옵니다.Brp puncta가 흰색으로 표시됩니다. 이제 관심 영역을 찾습니다. 이 경우, M3 medulla 층으로 진입하는 지점에서 anticiaoptin 양성 축삭이 가늘어지는 경로를 따라 R8 axon의 말단을 찾을 수 있습니다.각 R8 축삭 말단에서 스폿 검출 모듈을 사용하여 Brp GFP 펑타(puncta)를 식별합니다. 'add new spots'를 선택한 다음, 알고리즘 설정에서 'segment only region of interest'를 선택합니다. 분석 영역이 정의되면 소스 채널을 Brp GFP로 설정하고, 예상 XY 직경을 0.35 microns로 설정합니다.그다음, 스팟 검출(spot detection)에서 배경 감산(background subtraction) 항목을 선택하십시오. 이어서 필터 유형으로 품질(quality)을 선택하면 펑크타(puncta)가 자동으로 필터링됩니다. 완료(finish)를 클릭하여 이 단계를 마무리하십시오.데이터셋에 있는 모든 R8 axons에 대해 스팟 검출 방법을 반복합니다. 다음으로 식별할 영역은 axon cytoplasm입니다. 먼저, surface 함수를 사용하여 표면 객체를 생성합니다.그런 다음, 새로운 표면 추가(add new surfaces)를 선택하고, 알고리즘 설정에서 관심 영역만 분할(segment only region of interest) 옵션을 활성화하십시오. 이제 관심 영역을 수동으로 선택하십시오. 다음으로, 계산 매개변수를 설정하십시오.광수용체 채널을 소스로 찾으려면 smooth 옵션을 선택하십시오. 임계값으로는 absolute intensity를 선택하십시오. split touching objects 옵션을 활성화하십시오.시트 포인트(seat points) 직경을 0.5 µm로 설정하고, 품질 및 복셀 수에 대한 기본 필터 설정을 사용하십시오. 그러면 필터가 자동으로 적용됩니다. 이제 편집(edit) 메뉴로 이동하여 관심 영역(region of interest) 외부에 생성된 표면 조각들을 삭제하십시오.이 경우에는 다른 축삭들에 대해서도 동일하게 적용합니다. 데이터셋의 모든 R8 축삭에 대해 축삭 영역 검출을 반복한 후, 모든 Brp puncta와 R8 축삭은 스팟 객체(spot objects) 세트로 식별됩니다. 그리고 이에 대응하는 세포질 영역은 표면 객체(surface objects)로 식별됩니다.이제 각 축삭의 방향과 공간을 수동으로 정의하십시오. 이는 나중에 medulla neuropil 내의 각 뉴런을 따라 Brp GFP 밀도를 정량화하는 데 중요합니다. 이를 위해 먼저 각 축삭의 시작점과 끝점을 정의하십시오.'새 측정점 추가'를 선택한 다음, '편집'을 선택하고 이어서 '객체 표면 선택'을 선택하여 표면 객체의 상단부 작업을 수행합니다. 시작점을 정의하려면 M1 층의 R 축삭(axons)에 있는 모든 표면 객체에 측정점을 배치하십시오. 이 점들은 체계적이고 재현 가능한 순서로 배치해야 합니다.다음으로, 끝점들을 정의합니다. '새 측정 지점 추가(add new measurement points)', '편집(edit)', 그리고 다시 '객체 표면(surface of object)'을 선택하십시오. 그 다음, 동일한 체계적 순서를 반복하여 M3 층에 있는 R axons의 바닥 부분에 측정 지점들을 배치하십시오.Brp 배경 강도를 정량화하려면 두 R7 축삭의 세포질 영역을 분석하십시오. '새 표면 추가(add new surfaces)'를 선택하고, R8 축삭에서 수행한 것과 동일하게 R7 축삭 영역을 수동으로 정의하십시오. '접촉하는 객체 분할 활성화(enable split touching objects)' 옵션을 켜지 않는 것 외에는 동일한 설정을 사용하십시오.이 설정은 끕니다. 다음으로, 정의된 R7 axon 영역 내에 더미 spots 객체를 추가합니다. 'add new spots'를 선택하고, 'skip automatic creation'을 선택한 후 수동으로 편집합니다.그 다음, 객체의 중심을 선택하고 표면 객체를 클릭하여 R7 축삭 내부에 더미 스팟 객체를 배치합니다. 이제 두 번째 R7 축삭에 대해 표면 및 스팟 검출 단계를 반복합니다. 그런 다음 R8 축삭에서 했던 것과 같이 R7 축삭의 시작 및 종료 말단 지점을 정의합니다.이 분석을 위해 올바른 소프트웨어가 설치되어 있는지 확인하십시오. 스팟 데이터, 표면 데이터, 그리고 동일한 수의 측정 지점을 포함하는 두 개의 측정 지점 객체가 포함된 데이터셋을 엽니다. 데이터를 점검하십시오.계산이 정상적으로 작동하려면 두 측정 지점 객체의 측정 지점 수가 동일해야 합니다. 스팟, 축삭 영역, 시작점 및 종료점이 모두 정의되면 플러그인을 시작하십시오. 먼저 메타데이터, 특히 복셀 크기를 확인하십시오.편집 메뉴에서 이미지 속성을 열고, 기하학(geometry)의 좌표(coordinates) 항목에서 복셀(voxel)의 3차원 크기와 마이크론(microns) 수치를 확인하십시오. 다음으로, 강도 분석을 수행할 채널을 선택합니다. 본 사례에서는 Brp GFP가 나타나는 채널을 선택하였습니다.그런 다음 결과 파일 이름을 정의합니다. 다음으로 빈(bin) 수를 10으로 정의하고, 축삭 길이를 100%로 설정합니다. 그 후 스팟 반경을 0.35 microns로, 주변 세포질 영역을 50 microns로 설정하여 펑타(puncta) 영역을 정의합니다. 마지막으로 시냅스 검출 명령을 실행하고, 이후 출력 결과에 대해 통계 분석을 수행합니다.설명된 프로토콜에 따라, 지속적인 암흑, 지속적인 빛 또는 정상적인 명암 주기에 노출된 초파리의 R8 시냅스에서 Brp GFP puncta를 분석하였습니다. 지속적인 빛 조건에서 유지된 초파리의 R8 광수용체에서 Brp puncta의 수가 유의미하게 감소하였습니다. puncta의 분포는 커스텀 플러그인을 사용하여 계산하였습니다.R8 시냅스는 M1에서 M3 층까지의 축삭 전 구간에 분포되어 있었으나, 그 밀도는 M1 및 M3 층에서 더 높았습니다. 마찬가지로 펑크타(puncta)의 탈국소화 수준을 계산하였습니다. 모든 조건에서 탈국소화 수준은 변하지 않았으나, Brp GFP의 탈국소화 수준은 지속적인 빛 조사 하에서 명확하게 확산되는 Brp-short-cherry와 같은 다른 리포터들과는 차이가 있었습니다.AZ에서 분리된 후 Brp 짧은 단편(short fragment)에 부적절한 가공이 일어났을 가능성이 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 뉴런에서 시냅스 가소성 특성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 가소성 특성에는 시냅스 수, 시냅스의 분포, 그리고 시냅스 형성 후 특정 분자 성분의 농축 표지가 포함됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를...

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

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빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

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Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Longlonged Light (장시간 빛에 노출된 후 초파리의 시냅스 조절)

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Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

여기에 우리가 초파리 유충에 대한 빛 어두운 환경 테스트를 설명합니다. 이 분석은 빛을 감지하고 처리 photobehavior의 타고난 및주기 조절에 대한 정보를 제공합니다.

에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 프로토콜은 초파리 애벌레 광전술 행동을 조사하기 위해 빛 점 분석기를 소개합니다. 이 분석에서, 광 반점은 빛 자극으로 생성되고, 애벌레 광 회피의 과정은 적외선 광 기지를 둔 화상 진찰 시스템에 의해 기록됩니다.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

배우세요 Drosophila melanogaster 광수용기에서 시냅스 활성대 수와 공간 분포를 정량화하는 방법입니다. 장시간 빛 노출 후 시냅틱 변조를 분석하여 신경 가소성 연구에 활용할 수 있습니다.

의 시냅틱 변조 분석

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