의 시냅틱 변조 분석 노랑 초파리 장시간 빛에 노출 후 광수

이 실험 절차의 전반적인 목표는 다양한 활성화 조건에서 단일 뉴런의 시냅스 역학을 이해하는 것입니다. 이 방법은 뉴런 활동의 성숙에 따른 시냅스의 분자 구성 변화를 밝히는 것과 같은 시냅스 가소성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시냅스의 수, 분포 및 시냅스 후 분자 구성 요소의 농축 수준을 포함하여 시냅스의 여러 측면을 반자동으로 분석할 수 있다는 것입니다.

이 실험에서는 밀폐 후 6시간 이내에 파리를 일반 바이알에 수집합니다. 수집 바이알을 투명 아크릴 랙에 넣습니다. 섭씨 25도로 설정된 소형 인큐베이터에서 빛 노출이 평균 1000lux인 LED 패널에서 정확한 거리에 랙을 배치합니다.

그런 다음 후방은 지속적인 어둠, 12시간의 빛 후 12시간의 어둠 또는 지속적인 빛 조건 중 하나를 사용하여 1일에서 3일 동안 비행합니다. 나중에 표준 기술을 사용하여 뇌를 해부하고 염색합니다. 플라이 브레인을 장착하려면 장착 매체가 있는 마이크로파이펫을 로드하고 약 2cm 떨어진 현미경 슬라이드 중앙에 2마이크로리터 방울 2개를 놓습니다.

각 방울에 커버 슬립을 놓고 약 0.2mm 사이의 간격을 만듭니다. 그런 다음 15마이크로리터의 장착 매체를 커버 슬립 위에 넣고 틈새로 넣습니다. 해부 현미경으로 뇌를 마이크로피펫의 틈새에 넣습니다.

그런 다음 복부 쪽이 위로 향하도록 뇌를 배치합니다. 마지막으로 커버 슬립을 부착하고 투명한 매니큐어를 사용하여 가장자리를 따라 밀봉합니다. 그런 다음 표준 기술을 사용하여 뇌를 이미지화하여 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다.

이 경우, GFP 발광은 star 방법을 사용하여 활성 Brp 발현이 있는 세포에서 문서화됩니다. 또한 이 예시에서, R7 및 R8 광수용체 축삭돌기는 안티키아옵틴으로 면역화되었으며, 이는 RFP-표지된 2차 항체를 사용하여 관찰되었습니다. Brp GFP puncta의 수, 분포 및 탈편소화 수준을 정량화하기 위해 먼저 이미지 스택으로 만든 뇌의 3D 이미지를 재구성했습니다.

Brp puncta는 흰색으로 표시됩니다. 이제 관심 영역을 찾습니다. 이 경우, R8 축삭돌기의 말단은 M3 수질층으로의 진입점에서 anticiaoptin positive axons의 얇아짐을 따라 위치합니다.

각 R8 축삭 말단에서 스폿 감지 모듈을 사용하여 Brp GFP 반점을 식별합니다. Add new spots(새 스폿 추가)를 선택한 다음 알고리즘 설정에서 segment only region of interest(관심 영역만 세그먼트)를 선택합니다. 분석 영역이 정의되면 소스 채널을 Brp GFP로 설정한 다음 예상 XY 지름을 0.35미크론으로 설정합니다.

그런 다음 스팟 감지에서 배경 빼기를 확인하십시오. 그런 다음 필터 유형으로 품질을 선택하면 puncta가 자동으로 필터링됩니다. 마침을 클릭하여 이 단계를 완료합니다.

데이터 세트의 모든 R8 축삭에 대해 반점 감지 방법을 반복합니다. 다음으로 확인할 영역은 축삭 세포질(axon cytoplasm)입니다. 먼저, surface 함수를 사용하여 surface 객체를 생성합니다.

그런 다음 Add new surfaces(새 표면 추가)를 선택하고 algorithm settings(알고리즘 설정)에서 segment only region of interest(관심 영역만 세그먼트)를 토글합니다. 이제 관심 영역을 수동으로 선택합니다. 다음으로 계산 둘레를 설정합니다.

광원으로 광수용체 채널을 찾으려면 smooth(매끄러운) 옵션을 선택합니다. 임계값의 경우 절대 강도를 선택합니다. split touching objects 옵션을 활성화합니다.

시트 포인트 지름을 0.5미크론으로 설정하고 복셀의 품질과 수에 대한 기본 필터 설정을 사용합니다. 그러면 필터가 자동으로 적용됩니다. 이제 편집으로 이동하여 관심 영역 외부에서 생성된 표면 조각을 삭제합니다.

이 경우 다른 축삭돌기입니다. 데이터 세트의 모든 R8 축삭에 대해 축삭 영역 감지를 반복한 후 모든 Brp 반점 및 R8 축삭돌기가 일련의 별점 개체로 식별됩니다. 그리고 해당 세포질 영역은 표면 물체로 식별됩니다.

이제 각 축삭의 방향과 공간을 수동으로 정의하여 진행합니다. 이는 나중에 수질 신경필의 각 뉴런을 따라 Brp GFP 밀도를 정량화하는 데 중요합니다. 이렇게 하려면 먼저 시작점과 끝점을 정의합니다.

새 측정 점 추가를 선택한 다음 편집을 선택한 다음 표면 개체의 맨 위에서 작업할 개체의 표면을 선택합니다. 시작점을 정의하려면 M1 레이어에 있는 R 축삭의 모든 표면 개체에 측정 점을 배치합니다. 이러한 점을 체계적이고 재현 가능한 순서로 배치합니다.

다음으로 끝점을 정의합니다. 새 측정 점 추가를 선택하고 개체의 표면을 다시 편집합니다. 그런 다음 동일한 체계적인 순서를 반복하여 M3 층의 R 축삭 하단에 측정 점을 배치합니다.

Brp 배경 강도를 정량화하려면 두 R7 축삭돌기의 세포질 영역을 분석합니다. Add new surfaces(새 표면 추가)를 선택하고 R8 축삭에 대해 수행된 것처럼 R7 축삭의 영역을 수동으로 정의합니다. Enable split touching objects(터치 개체 분할 활성화) 옵션을 토글하지 않는 것을 제외하고는 동일한 설정을 사용합니다.

이건 놔둬. 다음으로, 정의된 R7 축삭 영역 내에 더미 스팟 객체를 추가합니다. 새 스폿 추가를 선택하고 자동 생성 건너뛰기를 선택하고 수동으로 편집합니다.

그런 다음 물체의 중심을 선택하고 표면 물체를 클릭하여 더미 스폿 물체를 R7 축삭 내부에 배치합니다. 이제 두 번째 R7 축삭에 대해 표면 및 반점 감지 단계를 반복합니다. 그런 다음 R8 축삭돌기와 마찬가지로 R7 축삭돌기의 시작점과 끝 단자점을 정의합니다.

이 해석을 위해서는 올바른 소프트웨어가 설치되어 있는지 확인하십시오. 스폿 데이터, 표면 데이터 및 각각 동일한 수의 측정 점을 포함하는 두 개의 측정 점 개체가 포함된 데이터셋을 엽니다. 데이터를 검사합니다.

계산이 작동하려면 두 측정 지점 개체 모두 동일한 수의 측정 지점을 가져야 합니다. 스폿, 축삭 영역, 시작점과 끝점이 정의되면 플러그인을 시작합니다. 먼저 메타데이터, 특히 복셀 크기를 확인합니다.

편집에서 이미지 속성을 연 다음 지오메트리의 좌표 아래에서 복셀과 미크론의 3차원을 확인합니다. 다음으로, 강도 분석을 위한 채널을 선택합니다. 이 경우 Brp GFP를 표시하는 채널이 선택됩니다.

그런 다음 결과의 파일 이름을 정의합니다. 다음으로, 빈 수를 10으로 정의하고 축삭 길이를 100%로 설정한 다음 반점 반경을 0.35미크론으로, 주변 세포질 영역을 50미크론으로 설정하여 반점 영역을 정의합니다. 마지막으로 synapse detection 명령을 실행하고 나중에 출력을 통계적으로 분석합니다.

설명된 프로토콜에 따라, Brp GFP 반점은 일정한 어둠, 일정한 빛 또는 정상적인 빛/어두운 주기에 노출된 파리의 R8 시냅스에서 분석되었습니다. Brp puncta의 수는 일정한 빛에 유지되는 파리의 R8 광수용체에서 현저히 감소했습니다. 푼크타의 분포는 사용자 정의 플러그인을 사용하여 계산되었습니다.

R8 시냅스는 M1에서 M3 층까지 축삭축을 따라 전체적으로 분포되어 있었지만 밀도는 M1 및 M3 층에서 더 높았습니다. 마찬가지로, puncta의 비편소화 수준(delocalization levels)이 계산되었습니다. 그들은 모든 조건에서 변하지 않았지만 Brp GFP의 비편소화 수준은 일정한 빛 아래에서 명확하게 해체되는 Brp-short-cherry와 같은 다른 보고자와 달랐습니다.

AZ에서 디스어셈블한 후 Brp short fragment의 부적절한 처리가 있을 수 있습니다. 이 비디오를 시청하고 나면 단일 뉴런에서 시냅스 가소성 특성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 소성 특성에는 시냅스 수, 분포 및 시냅스 이후의 특정 분자 성분의 농축 레이블이 포함됩니다.