Unchelated 가돌리늄위한 앱 타머 기반 센서 (III)

이 형광 기반 분석의 전반적인 목표는 자기 공명 영상 조영제가 포함된 수용액에서 독성 킬레이트되지 않은 가돌리늄 이온의 존재를 검출하는 것입니다. 이 방법은 합성된 제제의 높은 패리티를 보장하는 수단을 제공함으로써 가돌리늄 기반 MRI 조영제를 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 생물학적 금속 양이온에 비해 상대적으로 높은 선택성으로 킬레이트화되지 않은 독성 가돌리늄의 서브마이크로몰 농도를 감지할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석 버퍼를 준비합니다. 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 그런 다음 0.2미크론 PES 멤브레인이 있는 멸균 일회용 병탑 필터를 통해 버퍼를 필터링합니다.

다음으로, 497마이크로리터의 분석 버퍼를 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1마이크로리터의 준비된 가돌리늄 압타머 원액과 2마이크로리터의 준비된 QS 원액을 추가합니다. 이 2X 가돌리늄 센서 용액 50마이크로리터를 9개의 PCR 튜브 각각에 전달합니다.

그런 다음 튜브를 열 순환기에 넣습니다. 열 순환기를 설정하여 s를 가열합니다.amps를 섭씨 95도까지 5분 동안 가열한 다음 용액을 15분에 걸쳐 섭씨 25도까지 천천히 냉각합니다. 2X 가돌리늄 센서 용액을 95도로 가열한 다음 가돌리늄 이온 용액을 추가하기 전에 실온으로 천천히 냉각하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

먼저 분석 버퍼에 고체 삼염화가돌리늄을 용해시켜 원하는 농도의 가돌리늄 3원 용액을 생성합니다. 연속 희석을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 6개의 100마이크로리터 가돌리늄 3가지 용액을 준비합니다. 그 후, 테스트 할 조영제를 분석 버퍼에 용해시킵니다.

직렬 희석을 사용하여 세 가지 다른 농도를 준비합니다. 그런 다음 열 순환기에서 2X 가돌리늄 센서 용액이 들어 있는 PCR 튜브를 제거합니다. 각 가돌리늄 3 용액 50마이크로리터를 별도의 PCR 튜브로 옮깁니다.

각 용액을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 각 조영제 용액을 나머지 PCR 튜브에 개별적으로 옮깁니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

9가지 용액을 모두 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 용액의 45마이크로리터를 384웰 플레이트에 중복으로 옮깁니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 데이터를 기록하고 분석합니다.

본 연구에서는 형광 기반 방법을 사용하여 수용액에서 킬레이트화되지 않은 3가 가돌리늄 이온을 검출합니다. 형광 센서는 압타머에 형광단을 부착하여 개발됩니다. 그런 다음 센서는 담금질 가닥과 혼성화되며, 이 가닥은 어두운 담금질 분자로 태그가 지정됩니다.

가돌리늄 3 호의 첨가는 압타머에서 담금질 가닥을 대체하여 형광 방출을 증가시킵니다. 검량선은 100 나노몰 가돌리늄 압타머 및 200 나노몰 QS를 사용하여 얻어지며 원시 형광 또는 형광 폴드 변화를 플롯합니다. 두 곡선 모두 1마이크로몰 미만의 3가지 농도인 가돌리늄과 3마이크로몰 이상의 농도에서 신호의 포화도에 대한 선형 범위를 보여줍니다.

그런 다음 두 가지 다른 배치의 gadoteric acid를 0 밀리몰에서 20 밀리몰 범위의 농도로 분석합니다. 고순도 샘플의 형광 방출은 이 범위에서 눈에 띄게 증가하지 않지만, 5밀리몰의 낮은 농도에서 킬레이트화되지 않은 가돌리늄 3을 포함하는 샘플에서 상당한 변화가 관찰됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 마이크로플레이트의 웰에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 형광 판독값을 변경하므로 합니다.

이 절차를 사용하면 조영제가 포함된 용액에서 소량의 계산된 가돌리늄 이온도 검출할 수 있습니다. 이것은 약제의 순도를 결정하는 좋은 방법이 될 것입니다. 화학 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.