Name: 말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 학습하세요 말 난모세포의 염색체 분리, 히스톤 아세틸화 및 스핀들 형태 분석 방법을. 초음파 유도 난자 채취(OPU) 기술을 활용하여 생식세포 조작의 안전성과 비복배우동물 번식력 연구에 기여합니다.

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저자들은 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 (LSCM) , Philippe Barrière 및 Thierry Blard의 매일 초음파 난소 스캐닝 및 hCG 주입에 대한 지원을 위해 Fabrice Vincent에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 &quot;Regione Sardegna and Regione Lombardia&quot;프로젝트 &quot;Ex Ovo Omnia&quot;(보조금 26096200에서 AML로)에 의해 지원되었습니다. &quot;L&#39; Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012&quot;Fellowship (2012 년 FF로 계약), FP7-PEOPLE-2011-CIG, 연구 집행 기관 (REA) &quot;Pro-Ovum&quot;(부여 번호 303640 - VL); 유럽 ​​사회 기금, 인적 자원 개발 부문 별 운영 프로그램 (2007-2013 년 계약 번호 : POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 in IM)이 공동으로 후원하는 농업 및 수의학 박사 과정이있다. in vivo oocyte collection은 Français du Cheval et de l&#39; Equitation에 의해 지원되었습니다.

모든 절차는 동물 보호 및 사용위원회 CEEA Val de Loire Number 19에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 난 모세포 수집 및 생체 외 성숙 <ol><li> 오옴 픽업 <ol><li> 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv). <ol><li> 주사를하기 전에 알코올로 부위를 닦고 경정맥을 찾은 다음 주사 부위 아래에 2 ~ 3cm 정도의 엄지 손가락을 대어 정맥이 올라 오도록하십시오. 바늘을 목에 거의 평행하게 삽입하고 바늘이 정맥에 있는지 확인하십시오 (혈액이 주사기로 들어갑니다). 이 시점에서 주사; hCG는우성 여포에있는 난 모세포의 발달. </li></ol></li><li> hCG 주사 35 시간 후 detomidine (15 μg / kg, iv), butorphanol tartrate (10 μg / kg, iv) 및 butylscopolamine bromure (0.2-0.3 mg / kg, 15 mL / mare, iv)로 수컷을 진정시킨다. </li><li> 바늘을 초음파 탐침에 연결하십시오. 초음파 프로브를 질식 삽입하고 초음파 프로브를 직면하도록 난소를 직립 상태로 유지하십시오. 한 명의 조작원에게 바늘을 조종하고 다른 하나는 초음파 프로브를 마주 보는 난자를 제자리에 놓습니다 . 우세한 난포가있는 난소에서 시작하십시오. </li><li> 질 벽과 지배적 인 여포의 벽을 바늘로 찔러 넣으십시오 (OPU 용 초음파 프로브에는 흡입 시스템에 연결된 바늘 용 채널이 있습니다). theneedle은 echographic 이미지에서 볼 수 있습니다. </li><li> 흡입 시스템에 연결된 50 ML 원추형 튜브에 follicular 유체를 대기음. 원추형의 내용물을 붓는다.튜브를 큰 배양 접시에 넣고 stereomicroscope를 사용하여 cumulus-oocyte complex (COC)를 찾는다. </li><li> COC는 항상 난포액으로 검색되지 않기 때문에, 5 IU / mL heparinat 37 ° C를 함유 한 Dulbecco의 변형 된 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 여포를 세척하십시오. 이미 1.1.5 단계에서 난포액에 대해 설명한대로 DPBS의 COC 존재를 검사하십시오. COC가 회수 될 때까지 여러 번 세척하십시오. </li><li> 지배적 인 여포에서 COC가 검색되면, 1.1.3-1.1.4 단계에서 지배적 인 여포에 대해 설명한 바와 같이 ≥ 5 및 ≤25mm의 모공을 뚫고 플러시하십시오. 5 개 이상 ≤25 개는 황체 형성 호르몬 / 콜리 오가 나도 트로 핀 수용체 (LHCGR)를 발현하지 않으므로 hCG에 반응하여 성숙하지 않으며 GV 단계 (미성숙)에서 수집됩니다. 여러 가지 완전한 층의 적운 세포와 갈색, 미세하게 과립 화 된 ooplasm으로 만 COC를 유지하십시오. 다른 사람들은 버립니다. </li><li> OPU가 끝날 때,감염을 방지하기 위해 수컷은 벤질 - 페니실린 15,000IU / 동물을 투여하십시오. </li><li> 최소한 2 시간 동안 조용하고 깨끗한 상태에서 암말을 입으십시오. 귀의 위치, 자극에 대한 반응 ( 예 : 소음)을 측정하고 암말을 다른 동물의 회사에 반환하기 전에 걸음 걸이로인지의 흔적을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 체외 성숙 <ol><li> 헤파린 1,790 IU / L, 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA), 페니실린 및 스트렙토 마이신을 보충 한 따뜻한 HEPES- 완충 된 TCM199 (20 mM Hepes) 37 ° C. 미리이 매체를 준비하십시오. 필터를 살균하고 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 50 NG / ML 상피 성장 인자 (EGF)와 20 % 송아지 혈청 7 NaHCO 3 - 보충 TCM199 (25 MM NaHCO 3 ) 보완하여 IVM 매체를 준비합니다. 새로운 병을 뗀 후 3 주 이내에 NaHCO 3 보충 TCM199를 사용하십시오. EGF를 미리 100x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 동결 시켜라.6 개월 이내에 사용하십시오. 최소한 2 시간 동안 38.5 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 가습 공기 중에서 4-well dish의 웰에 500 μL를 분배하고 배양하십시오. </li><li> 5 ~ 25 밀리미터 이상 모낭에서 COC를 회수 한 후 HEPES-TCM199 2 mL가 채워진 페트리 접시 (직경 3.5 cm)에 넣으십시오. 세포 파편을 씻어 내기 위해 COC를 접시의 다른 영역으로 옮기십시오. </li><li> COCs를 IVM 배지에 옮기고 38.5 ° C에서 5 % CO2의 가습 공기 중에서 28 시간 배양합니다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 형광 및 이미지 분석 <ol><li> 염색체 수 <ol><li> 우세한 모낭 또는 IVM의 끝에 수집 후, 38.5 ° C에서 5 % CO 2 와 가습 공기에서 1 시간 100 μm의 monastrol와 COC를 품어. monastrol을 미리 100x 축척으로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 적운 세포 제거0.5 % hyaluronidase로 치료하거나 부드럽게 pipetting; 0.2 % pronase에서 처리하여 투명대를 제거합니다. 사전에 hyaluronidase와 pronase를 10x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 보관하십시오. </li><li> 4 ° C에서 추가로 45 분 후 38.5 ° C에서 15 분 동안 DPBS의 4 % paraformaldehyde에 난 모세포를 수정. 주의! 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. </li><li> 0.1 % 폴리 비닐 알콜 (PVA)을 보충 한 DPBS 500 μL로 채워진 3 개의 웰에 순차적으로 옮겨 난 모세포를 세척한다. 실온 (RT)에서 10 분 동안 0.3 % Triton X-100에서 침투. </li><li> RT에서 적어도 30 분 동안 1 % 소 혈청 알부민 (DPBS-1 % BSA)과 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단하십시오. 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 blocking 용액에 보관할 수 있습니다. </li><li> 기본 얼룩 들어, 4 ° C 하룻밤 1 % BSA (희석 1시 50 분)로 보충 DPBS의 토끼 방지 오로라 B phospho - Thr232에 oocytes를 품어. </li><li> 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes를 씻으십시오. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 tetra - methylrhodamine isothiocyanate (TRITC) - 결합 당나귀 안티 - 토끼 IgG (DPBS - 1 % BSA에 1 : 100)의 oocytes을 품어. </li><li> 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes을 씻어 다음 유리 슬라이드에 20 μm의 YOPRO1 보충 비 경화, 안티 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓으십시오. 모든 난 모세포가 장착 될 때까지 절차를 반복하십시오 (슬라이드 당 3-4 개의 난 모세포). </li><li> oocytes가 장착 매체에 약 10 분 동안 정착 수 있도록하고 coverslip으로 그들을 커버. oocytes을 분쇄하지 않도록, 유리 슬라이드에 coverslip을 배치하기 전에 양면 테이프 두 스트립을 적용합니다. 참고 :이 예방 조치는 모든 샘플이 유리 슬리드 coverslip. 유리 슬라이드는 -20 ° C에서 얼 수 있으며 다음 2-3 일 동안 이미지화됩니다. </li><li> 적색 (centromeres) 및 녹색 (염색체) 채널 7 , 13 , 14 , 20 , 21을 사용하여 60X 목적과 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에 샘플을 이미지. 0.35 μm 간격으로 z 축에 전체 metaphasic 플레이트에 걸친 샘플을 스캔하십시오. 모든 단일 계획의 디지털화 된 이미지를 저장하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html에서 구할 수 있음)의 셀 카운트 기능을 사용하여 직렬 공 촛점 절에서 센트로 메어를 센다. 참고 : 숫자 코드가있는 순차적 섹션에서 나타나고 머물러 있고 사라지는 중심체를 식별하여 인접한 섹션에 나타나는 centromeres의 반복 횟수를 피하십시오. </li><li> 염색체를 반복한다.독립 운영자에게 2.1.11 절에서 unting. 참고 : euploid (32 염색체), 과잉 배수 (&gt; 32) 또는 저배수 (&lt;32)로 난 모세포를 분류하십시오. </li></ol></li><li> 스핀들 형태와 히스톤 아세틸 화 <ol><li> 지배적 인 여포 또는 IVM의 끝에 수집 후, 단계 2.1.2에서 설명한대로 0.5 % hyaluronidase 또는 부드러운 pipetting으로 치료하여 cumulus 세포를 제거합니다. </li><li> 단계 2.1.4에서와 같이 DPBS - PVA의 oocytes을 씻고 38 ° C에서 20 분 동안 2.5 % 파라 포름 알데히드에 그들을 수정. 단계 2.1.4에서 설명한대로 광범위하게 씻어서 0.1 % Triton X-100에서 5 분간 RT에서 투과 시키십시오. 참고 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. </li><li> 2 % 소 혈청 알부민 (DPBS - 2 % BSA), 0.05 % 사포닌 및 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단RT에서 2 시간. 참고 : 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 블로킹 용액에 보관할 수 있습니다. </li><li> 기본 얼룩 들어, 밤새 4 ° C에서 0.05 % 사포닌과 DPBS - 2 % BSA에서 마우스 anti-alpha-tubulin (1 : 150) 및 토끼 anti-acH4K16 (1 : 250)에서 oocytes를 품어. </li><li> 단계 2.1.4와 같이 oocytes을 씻으십시오. 0.05 % 사포닌을 함유 한 DPBS-2 % BSA에서 녹색 형광 염료 - 접합 당나귀 항 마우스 IgG (1 : 500) 및 TRITC- 결합 당나귀 항 - 토끼 IgG (1 : 100)의 용액에서 난 모세포를 1 시간 동안 항온 배양한다 어둠 속에서 RT. </li><li> 단계 2.1.4에서와 같이 난 모세포를 씻어 낸 다음 1 μg / ML 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)을 보충 한 비 경화, 안티 - 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓습니다. 유리 슬라이드에. </li><li> 단계 2.1.8에서 설명한대로 유리 슬라이드에 oocytes를 탑재합니다. </li><li> 빨간색 (acH4K16), 녹색 (알파 - 튜 불린) 및 파란색 (DNA) 채널을 사용하여 60x 대물 렌즈로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 샘플을 이미지화하십시오. 참고 : 모든 샘플을 수집하는 동안 빨간색과 파란색 채널에 대한 레이저 설정을 일정하게 유지하십시오. 모든 감광 스핀들과 metaphasic 플레이트에 걸쳐 0.35 μm 간격으로 z 축에서 샘플을 스캔하십시오. 디지털화 된 이미지 (단일 계획 및 투사 된 3D 이미지)를 저장하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30)의 측정 기능을 사용하여 투영 된 이미지의 최대 너비에서 pole-to-pole 스핀들 길이와 스핀들 직경을 측정하십시오. .html). 각 3 번 반복하고 평균을 계산하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html)의 통합 밀도 기능을 사용하여 acH4K16의 상대적 형광을 정량화하십시오. DAPI 염색의 통합 밀도를 위해 표준화하십시오. </li></ol></li></ol> 3. mRNA 발현 분석 <ol><li> 5 ~ 25 mm 모낭에서 COC를 회수 한 후 육아종 세포를 수집합니다페트리 접시에 남아 uspension 및 2 분 10,600 XG에서 원심 분리하여 차가운 DPBS에서 두 번 씻으십시오. 액체 질소에서 급히 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오. 세포는 표준 곡선을 위해 봉사 할 것이다. </li><li> 미숙 (GV), 체외에서 성숙 및 생체 내에서 성숙 oocytes에서 단계 2.1.2에서 설명한대로 모든 cumulus 세포를 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 2.1.4에 설명 된대로 oocytes을 DPBS - PVA에서 씻어, 1 μL 볼륨에서 그들을 수집하고 위에 2 μL RNALater 누워. 액체 질소에서 급속 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오. </li><li> 루키 페라 제 RNA 2 μg을 각 시료에 스파이크 인 (spike-in)으로 첨가하십시오. oocytes 2 X 2 풀과 작은 샘플에서 RNA를 복구하는 데 적합한 실리카 멤브레인 필터 기반 키트를 사용하여 전체 RNA를 추출하십시오. </li><li> 37 μM에서 1 시간 동안 0.25 μg 무작위 hexamers 및 마우스 Moloney 백혈병 바이러스 역전사 효소와 10 μL에서 RNA 역전사 -<html> 176 ℃. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 샘플을 보관하십시오. </li><li> RNAse없는 물에서 granulosa 세포에서 cDNA를 50 NG / μL로 희석. 이 용액을 1:10으로 희석하여 5 ng / μL, 0.5 ng / μL, 0.05 ng / μL 및 0.005 ng / μL 용액을 얻으십시오. </li><li> 기질로서 0.05 oocytes에 해당하는 cDNA 또는 granulosa 세포 cDNA의 연속 희석액 5 μL, SYBR 녹색 supermix 10 μL 및 각 특정 프라이머의 0.3 μm의를 사용하여 반응 당 총 20 μL의 총 볼륨에서 triplicate로 반응을 조립 표 1 ). </li><li> 3 단계 프로토콜을 사용하여 열 순환 장치에서 반응을 실행하십시오 : 95 ° C 30 초, 60 ° C 30 초 및 72 ° C 20 초, 40 회 반복. 마지막으로, 60 ° C부터 시작하여 용융 곡선을 얻고 95 ° C까지 20 ° C마다 0.5 ° C 씩 온도를 올립니다. </li><li> 표준 곡선을 사용하여 oocyte 샘플에서 특정 mRNA의 시작 수량 (SQ)을 평가granulosa 세포 샘플을 기준으로 계산 된 f&gt; 15. 해당 유전자의 SQ와 하우스 키핑 유전자의 SQ 사이의 비율로 데이터를 표현하십시오. </li></ol>

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비록 IVM이 20 년 이상 말에서 수행되었지만, 우리는 인간에게 제안 된 것처럼 난 모세포가 배아 이수 배체의 기원이 될 수 있는지 여부를 아직 모른다. 그 이유는 염색체 계수를위한 난 모세포의 준비가 상당한 표본 손실을 초래할 수 있기 때문일 것입니다. 이를 염두에두고 염색체 분리의 오류를 조사하는 데 사용 된 방법을 조사하여 말의 난 모세포에 적용 할 수있는 가장 적합한 기술을 찾아 냈습니다. 과학 문헌에서 네 가지 주요 기술이 발견되었습니다 : 1) 염색체 확산 5 , 18 , 19 , 2) 형광 in situ hybridization (FISH) 4 , 6 , 17 <su...

여성, 동반자 동물 및 멸종 위기에 처한 종의 불임 치료를 위해 광범위한 재현 기술이 개발되었습니다. 임상 환경에서 가장 보편적 인 절차 중 하나는 초음파 유도 질식 흡입, 난자 채집 (OPU) 1 에 의한 난소에서 난태 (metaphase) II (MII) 단계 난 모세포를 회수하는 것입니다. 이 난 모세포는 수용체 자궁에 이식 된 배아와 함께 시험 관내 (IVF)에서 수정된다. MII- 단계 (성숙한) 난 모세포는 외인성 생식선 자극 호르몬의 투여 후에 회수된다. 그러나이 치료법은 일부 환자에서 난소과 자극 증후군 (OHSS) 2 의 발병과 관련이 있습니다. 한 번 모낭에서 분리 된 자발적으로 감수 분열을 재개하기위한 완전히 성장한 미숙 난 모세포 (GV-stage)의 내재적 인 능력을 이용하여, 관리자없이 성숙한 난 모체를 얻을 수 있습니다gonadotropin 조율 3 . 이 과정은 난자 시험관 내 성숙 (IVM)이라고 불리우며 생식 기술을 돕는 데있어 덜 약물 지향적이고 덜 비싸며 환자 친화적 인 접근 방식을 의미합니다. 그러나 체외 에서 성숙 된 난 모세포 를 이용한 배아 발달의 성공은 일반적 으로 생체 내에서 성숙한 난 모세포보다 더 낮다. 가능한 설명은 체외에서 성숙한 난 모세포가 염색체 분리의 오류에 더 영향을 받고, 결과 배수체가 정상 배아 발생을 저해한다는 것이다. IVM 동안의 염색체 오 분류의 분자 적 기초를 이해하는 것은 궁극적으로이 기술의 잠재력을 밝혀 줄 것입니다. 이 정맥 에서 in vitro에서 성숙한 난 모세포의 형태 학적 및 생화학 적 특징을 생체 내 성숙과 비교하는 실험 접근법ed oocytes는 7 , 8에 기술되어 있다. 구체적으로, 미성숙 및 성숙 난 모세포의 OPU 및 미성숙 난 모세포의 IVM 절차는 실험 모델로서 성인 및 자연 사이클링 말을 사용하여 설명됩니다. 그런 다음 immunofluorescence 및 이미지 분석은 염색체 분리, 스핀들 형태 및 이러한 배우자의 히스톤 아세틸 화의 전체적인 패턴을 조사하는 데 사용됩니다. 마지막으로 mRNA 발현 분석을 위해 역전사 및 정량적 PCR 프로토콜을 설명합니다. 설치류 동물 모델과 비교하여 말은 유전자 조작을 허용하지 않으며 조작하기가 쉽지 않으며 값 비싼 유지 관리가 필요합니다. 그러나이 모델은 난 모세포 생리학과의 유사성으로 인해 난 모세포의 성숙에 대한 연구에 상당한 관심을 보이고있다 9 , 10 &lt;/ sup&gt;. 더욱이, 말에서 IVM-IVF의 신뢰할 수있는 프로토콜의 개발은 높은 유전 적 가치의 암말로부터의 새끼의 수를 증가시킬 수 있기 때문에 상당한 경제적 이익을 갖는다. 난 모세포 (oocytes), 특히 독성이있는 종에서 실험을 수행하는 데있어 한계 중 하나는 제한된 샘플 가용성입니다. 이 한계는 샘플 손실을 최소화하는 염색체 계수를 수행하기 위해 이전에 생쥐에서 개발 된 접근법을 말 난 모세포 13 , 14 로 조정하여 여기서 극복되었습니다 (다른 가능한 기술과의 비교에 대한 설명 참조). 또한, 트리플 형광 얼룩 프로토콜은 동일한 샘플에 대한 여러 분석을 수행하기 위해 최적화되었으며, q - PCR 분석은 2 oocytes의 수영장에서만 수행되었습니다. 전반적으로, 본 연구는 형태 학적 및 생화학 적으로 cha낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기가 극히 어려운 세포 유형 인 말 oocyte를 괴롭 히고 있습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족의 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>초음파 프로브</td><td>Aloka</td><td>UST-5820-7,5</td><td></td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>중심</td><td>CHO004</td><td>1,500 단위/동물 IV</td></tr><tr><td>데토미딘</td><td>중심</td><td>MED010</td><td>9 - 15 &마이크로; g/kg IV</td></tr><tr><td>부틸스코폴라민 브로무어</td><td>센트라벳</td><td>EST001</td><td>0.2 mg/kg IV</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td></td><td>NIKON SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>부토르파놀</td><td>센트라벳</td><td>DOL003</td><td>10&micro; g/kg IV</td></tr><tr><td>벤질-페니실린</td><td>센트라벳</td><td>DEP203 IM</td><td>15,000 UI/동물</td></tr><tr><td>TCM199</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3769 10X1L</td><td>분말 헤페스 완충 TCM199</td></tr><tr><td>헤페스 나트륨염</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3784-100G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>헤파린&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3-buffered TCM199</td><td>IVM 중간</td>표피 성장 인자용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154-500ML</td> 액체</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4웰 접시</td><td>NUNCLON</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>헤레우스</td><td>BB6060</td><td></td></tr><tr><td>모나스트롤</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>M8515</td><td></td></tr>, <tr><td>히알루로니다아제</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>H3506</td><td></td></tr>, <tr><td>프로나제</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>P5147</td><td></td></tr>, <tr><td>파라포름알데히드</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>P6148</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리비닐 알코올</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>341584</td><td></td></tr>, <tr><td>트리톤-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 오로라 B phospho-Thr232</td><td>BioLegend</td><td>636102</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 결합 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Vecta-Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YOPRO1</td><td>써모피셔 과학</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>LSM 780</td><td>자이스</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>LSM 700</td><td>자이스</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>rsb.info. nih.gov/ij/download.html</td><td>무료 리소스</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 알파 튜불린</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T8203</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 acH4K16</td><td>업스테이트 생명 공학</td><td>07-329</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-coniugated 당나귀 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 분리 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>무작위 헥사머</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사 효소</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린 슈퍼믹스</td><td>BioRad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>특이적 프라이머</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>특정 프라이머는 Primer3Plus 소프트웨어(무료 리소스)를 사용하여 설계되었으며,</td></tr> <tr><td>thermal-cycler</td>, <td>BioRad</td>, <td>MyiQ</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항CENPA Abcam</td><td></td><td>ab13939</td><td></td></tr>, <tr><td>마우스 단클론 항 Aurora B</td>, <td>Abcam</td><td>ab3609</td><td></td></tr></tbody></table>

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

보조 생식 분야는 여성, 동반자 동물 및 멸종 위기 종의 불임 치료를 위해 개발되었습니다. 말의 보조 생식은 또한 스포츠 경력을 방해하지 않고 높은 수행자의 배아 생산을 허용하고 높은 유전 적 가치의 암말로부터 도태 한 새끼 수의 증가에 기여합니다. 본 원고는 난자 채취 (OPU)를 이용하여 말의 난소에서 미성숙 및 성숙 난 모세포를 채취하는 과정을 설명한다. 이 난 모세포는 마우스에서 이전에 개발 된 프로토콜을 적용하여 이수 배수 체의 발병률을 조사하는데 사용되었다. 특히, 중기 II 세포 (MII) 난 모세포의 염색체와 중심체 (centromeres)는 공 촛점 레이저 현미경 검사 후 순차적 초점 계획에서 형광으로 분류되고 계수되었다. 이 분석은 미성숙 난 모세포가 난포에서 채취 되고 생체 외에서 성숙되었을 때 이수 배수체 비율에서 더 높은 발병률을 나타냈다.생체 내. 특정 라이신 잔기에서 튜 불린 및 히스톤 4의 아세틸 화 형태에 대한 면역 염색 또한 감수 분열의 형태 및 히스톤 아세틸 화의 전체 패턴에서의 차이를 나타냈다. 마지막으로, 역전사 및 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 및 아세틸 트랜스퍼 라제 (HAT)를 코딩하는 mRNA의 발현을 조사 하였다. 시험 관내 및 생체 내에서 성숙한 난 모세포 사이 에서 전사 물의 상대적인 발현에 차이는 관찰되지 않았다. oocyte 성숙 동안 전사 활동의 일반적인 침묵과 일치하여 총 전사 양의 분석은 mRNA 안정성 또는 분해를 나타낼 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 다른 번역 및 번역 후 규정이 영향을받을 수 있음을 나타냅니다. 전반적으로,이 연구는 형태학 및 생화학 적으로 말의 난 모세포, cell 유형은 낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기 매우 어렵습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족에 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.

이 실험에 대한 최초의 발견은 앞서 깊이있게 설명되었으며 본원에서 기술 된 프로토콜을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예로서보고되었다. 성숙 비율 지배 모낭으로부터 OPU에 의해 회수 된 32 개의 COC 중 28 개 (88 %)가 MII 단계에 있었다. 크기가 5-25mm 인 모낭으로부터 수집 된 58 개의 COC 중 14 개는 mRNA 발현 연구를 위해 미성숙 난자로 즉각적으로 동결되었다. 나머지 44 명은 시험 관내에서 성숙되었고, 37 명은 MII 단계 (85 %)에 도달했다. 성숙 효율은 두 군에서 유의 한 차이가 없었다 (Fisher &#39;s exact test P&gt; 0.05). <p class="jove_step" ...

이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

이 실험적 접근 방식의 전반적인 목표는 첫째, 말 난모세포의 형태학적 및 생화학적 특성을 규명하고, 둘째, 동일한 동물로부터 얻어 체외 또는 체내에서 처리된 생식세포를 비교하는 것입니다. 이러한 실험적 접근 방식은 단배란 종의 난모세포 생물학 및 가임력에 관한 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이는 생식세포 조작 절차의 안전성을 향상시킬 수 있습니다.이 접근법은 특히 단배란 종의 난자 샘플 확보가 제한적이라는 점을 극복하기 위해 개발되었습니다. OPU 절차를 시연할 인원은 리에주 대학교의 Stefan Deleuze 교수, 제 실험실의 랩 매니저인 Cecile Douet, 그리고 INRA Centre Val de Loire의 말 단위 매니저인 Fabrice Reigner입니다. 매일 초음파를 사용하여 성마 코호트의 난포 직경을 평가하십시오.지름이 33 밀리미터보다 큰 대형 여포를 찾습니다. 여포가 발견되면, 우성 여포로의 난자 성숙을 유도하기 위해 1,500 units의 human chorionic gonadotropin을 주입할 준비를 합니다. 다음으로 경정맥구를 찾아 주사 부위를 알코올로 닦아냅니다.그 다음, 정맥이 솟아오르게 하려면 주사 부위에서 2~3cm 아래 지점에 약간의 압력을 가합니다. 바늘을 목과 거의 평행하게 삽입하고, 바늘이 정맥 내에 있는지 확인하기 위해 살짝 흡인한 후 호르몬을 주입합니다. 질 접근을 위한 초음파 프로브를 준비합니다.그 후, 바늘을 흡입 시스템에 연결합니다. hCG 주입 35시간 후에 OPU를 위한 기기를 준비하고 암말을 진정시킵니다. 동물의 안전과 시술자의 안전을 위해 적절한 진통 처리가 매우 중요합니다.통증이나 불편함을 느끼지 않는 동물은 난소 조작이 가능하므로, 천자와 세척을 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 니들 프로브가 삽입되면, 한 명의 작업자는 난소가 프로브를 향하도록 조작하고 다른 작업자는 니들을 조작해야 합니다. 초음파 영상에서 우성 난포의 위치를 찾으십시오.그 다음, 바늘을 사용하여 질 벽과 우성 난포의 벽을 뚫습니다. 난포 공간에 진입하면 난포액을 흡입합니다. 바늘을 회전시켜 난포 벽을 긁어내어 난구-난자 복합체를 부착시킵니다.그 다음, 액체를 큰 페트리 접시에 붓습니다. 그리고 실체 현미경 아래에서 COC를 찾습니다. 그동안 헤파린이 포함된 따뜻한 Dulbecco's modified PBS로 난포를 세척합니다.COC를 수집하

analysis-chromosome-segregation-histone-acetylation-spindle

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

우리는 편광광 현미경 검사법을 사용하여 인간 계란 성숙도의 비침범성 평가를 위한 임상 프로토콜의 개요를 제공합니다.

인간 계란 성숙도 평가 및 임상 적용

근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다.

마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

학습하세요 말 난모세포의 염색체 분리, 히스톤 아세틸화 및 스핀들 형태 분석 방법을. 초음파 유도 난자 채취(OPU) 기술을 활용하여 생식세포 조작의 안전성과 비복배우동물 번식력 연구에 기여합니다.

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

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