말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

이 실험적 접근 방식의 전반적인 목표는 첫째, 말의 난모세포를 형태학적, 생화학적으로 특성화하고, 둘째, 시험관 내 또는 생체 내에서 처리된 동일한 동물의 배우자를 비교하는 것입니다. 이 실험적 접근 방식은 난모세포 생물학 및 단배란 종의 생식력에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 배우자 조작 절차의 안전성을 향상시킬 수 있습니다.

이 접근법은 특히 단배란 종에서 난모세포의 제한된 샘플 가용성을 극복하기 위해 개발되었습니다. 리에주 대학의 슈테판 들뢰즈(Stefan Deleuze) 교수, 제 연구실의 실험실 관리자인 세실 두에(Cecile Douet), 그리고 INRA 센터 발 드 루아르(Val de Loire)의 말 부서 관리자인 파브리스 라이그너(Fabrice Reigner)가 OPU 절차를 시연할 것입니다. 매일 초음파를 사용하여 성인 암말 코호트에서 난포 직경을 평가합니다.

직경이 33mm보다 큰 큰 난포를 찾습니다. 일단 발견되면, 1, 500 단위의 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 주입하여 난모세포의 성숙을 우성 여포로 유도할 준비를 합니다. 다음으로, 경정맥 고랑을 찾아 주사 부위에 알코올을 면봉으로 닦습니다.

그런 다음 정맥이 올라가도록 주사 부위 2-3cm 아래에 약간의 힘을 가하십시오. 바늘을 목과 거의 평행하게 삽입하고 바늘이 정맥에 있는지 확인하기 위해 약간 흡인하고 호르몬을 주입합니다. 질 접근을 위한 초음파 프로브를 준비합니다.

그런 다음 바늘을 흡입 시스템에 연결합니다.hCG 주입 35시간 후 OPU용 기구를 설치하고 암말을 진정시킵니다. 좋은 진통제는 동물과 작업자의 안전을 위해 매우 중요합니다.

통증이나 불편함을 느끼지 않는 동물은 난소를 조작할 수 있어 구멍을 뚫고 세척을 더 쉽게 할 수 있습니다. 바늘 프로브가 삽입되면 한 작업자는 프로브를 향하도록 난소를 조작해야 하고 다른 작업자는 바늘을 조작해야 합니다. echographic image에서 우성 여포를 찾습니다.

그런 다음 바늘을 사용하여 질벽과 우성 난포 벽을 뚫습니다. 난포 공간에 접근하면 난포액을 흡인합니다. 바늘을 돌려 여포 벽을 긁어내고 적운-난모 세포 복합체를 부착합니다.

그런 다음 액체를 큰 페트리 접시에 붓습니다. 그리고 스테레오스코프 아래에서 COC를 검색합니다. 한편, 헤파린이 함유된 따뜻한 Dulbecco의 변형된 PBS로 모낭을 씻어냅니다.

COC를 수집하려면 여러 번 플러시해야 할 수 있습니다. COC가 발견되면 바늘을 이중 루멘 바늘로 변경하고 직경이 5mm에서 25mm 사이인 모든 난포에서 미성숙 COC를 수집합니다. 이들은 체외 성숙에 사용됩니다.

한 난소의 모든 난포를 흡인하면 동일한 절차를 반복하여 다른 난소에서 미성숙한 COC를 수집합니다. 이제 COC 중에서 선택합니다. 여러 개의 완전한 적운 세포 층과 갈색의 미세한 과립형 난형이 있는 COC만 보관하십시오.

나머지는 버립니다. 절차의 끝에, 감염을 방지하기 위하여 15, 벤질 페니실린의 000 단위로 암말을 주사하십시오. 그런 다음 암말이 회복하는 동안 최소 2시간 동안 조용하고 깨끗한 마구간에 기르십시오.

OPU가 시작되기 전에 보충제가 첨가된 HEPES 완충 TCM-199 한 병을 섭씨 37도까지 가열합니다. 다음으로 IVM 매체를 준비합니다. 500 마이크로리터의 보충제 중탄산나트륨 완충 TCM-199를 4웰 접시의 웰에 분배합니다.

그런 다음 섭씨 38.5도에서 최소 2시간 동안 접시를 배양합니다. 회수된 미성숙 COC를 2밀리리터의 예열된 HEPES TCM-199로 채워진 3.5cm 접시에 옮깁니다. 접시의 다른 영역을 통해 COC를 이동하여 주변 이물질을 부드럽게 씻어냅니다.

이제 COC를 IVM 배지로 옮기고 섭씨 38.5도에서 28시간 동안 배양합니다. 성숙한 COC에 대한 염색체 수를 계산하려면 섭씨 38.5도에서 한 시간 동안 100마이크로몰 모나스트롤에서 배양합니다. 다음으로, HEPES 완충 TCM-199에서 0.5% 히알루로니다아제로 COC를 처리하여 적운 세포를 제거합니다.

섭씨 38도로 설정된 가열된 스테이지에서 이 반응을 모니터링합니다. 약 5분 이내에 모든 셀을 제거합니다. 부드러운 피펫팅을 사용하여 마지막 몇 개의 완고한 세포를 제거합니다.

다음으로, HEPES 완충 TCM-199에서 0.2% 프로나제를 사용하여 투명대(zona pellucida)를 제거합니다. 가열된 스테이지에서도 이 반응을 모니터링하십시오. 완료하는 데 약 5분 정도 걸립니다.

그런 다음 DPBS의 4%파라포름알데히드에 있는 난모세포를 섭씨 38.5도에서 15분 동안 고정한 다음 섭씨 4도에서 45분 더 고정합니다. 고정 후 DPBS에서 0.1% 폴리비닐 알코올이 함유된 3개의 웰 사이에 난모세포를 순차적으로 옮겨 난모세포를 세척합니다. 웰당 약 반 밀리리터의 용액을 사용하십시오.

그런 다음 PBS에 0.3%Triton X-100이 채워진 우물에 난모세포를 옮기고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 비특이적 신호를 차단하려면 DPBS의 세포를 1%BSA와 10%의 정상 당나귀 혈청으로 목욕시킵니다. 실온에서 최소 30분 동안 세포를 배양합니다.

30분 후, 1차 항체를 바르고 밤새 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다. 다음 날, 난모세포를 세척하고 2차 항체를 빛에 노출되지 않도록 실온에서 한 시간 동안 적용합니다. 2차 난모세포를 도포한 후 난모세포를 다시 세척합니다.

그런 다음 장착하기 전에 양면 테이프 스트립을 슬라이드에 부착하여 커버슬립 지지대 역할을 합니다. 이제 20마이크로몰의 YO-PRO-1이 보충된 비경화, 페이드 방지 장착 매체 한 방울에 슬라이드당 3-4개의 난모세포를 장착합니다. 난모세포가 약 10분 동안 가라앉을 때까지 기다린 다음 커버슬립을 바릅니다.

OPU가 우성 여포에서 회수한 32개의 COC 중 28개는 중기 II에 있었습니다.시험관 내 성숙을 사용하여 비우성 여포에서 채취한 44개의 COC 중 37개를 중기로 성숙시켰습니다. 체외에서 성숙한 난모세포는 종종 이수성(aneuploidy)의 영향을 받았으며, 대부분 과배체성(hyperploidy)이었습니다. 이것은 생체 내에서 성숙한 난모세포에서는 관찰되지 않았습니다.

다음으로, 극 간 스핀들 길이와 최대 스핀들의 직경을 모두 측정했습니다. 체외에서 성숙한 난모세포는 생체내에서 성숙한 난모세포보다 훨씬 길고 넓었습니다. 동일한 샘플에서 H4K16의 전체 아세틸화 수준을 측정했습니다.

결과는 예상대로였습니다. H4K16의 아세틸화는 생체 내에서 성숙한 난모세포보다 시험관 내에서 성숙한 난모세포에서 유의하게 낮았습니다. 잘 훈련된 팀은 OPU 아침에 5마리의 암말을 처리할 수 있으며, 배란 전 난모세포는 80%, 미성숙한 난모세포는 50-60%의 회수율을 보일 수 있습니다.

OPU 기간 동안 항상 동물의 ess와 웰빙을 모니터링하고 필요한 경우 적절한 수의학적 치료를 제공할 준비가 되어 있어야 합니다. 이 실험적 접근법은 다른 종의 난모세포에도 적용할 수 있으며, 특히 인간과 같이 샘플 가용성이 문제가 되는 경우에 적용할 수 있습니다. 우리의 결과를 바탕으로 적절한 염색체 분리 및 후성유전학적 변화에 필요한 배양 조건을 더 잘 이해하기 위한 연구가 수행되어야 합니다.

가장 중요한 목표는 수의학과 인간 불임 치료 모두에서 체외 성숙 효율성을 개선하는 것입니다.