Name: 포괄적 인 절차를 평가하는 생체 암 나노 의학의 성능 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 학습하세요 종양이 있는 면역능이 있는 생쥐에서 암 나노의약품의 생체내 거동을 체계적, 조직, 단일세포 및 세포내 수준에서 평가하는 방법을. 이중 표지 기법을 활용한 이 절차는 임상 적용 가능성이 있는 유망한 나노의약품 후보를 식별하는 데 도움을 줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 B16-F10-YFP 세포를 제공하고 흑색종 마우스 모델에 대한 전문적인 조언을 해준 마운트 시나이 아이칸 의과대학의 Helene Salmon 박사와 Miriam Merad 박사에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSK)의 Animal Imaging Core Facility, Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, Molecular Cytology Core Facility에 감사를 표합니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 NIH 1 R01 HL125703(W.J.M.M.), R01CA155432(W.J.M.M.), K25 EB016673(T.R.) 및 P30 CA008748(MSK Center Grant)의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 MSK의 CMINT(Center for Molecular Imaging and Nanotechnology)의 재정 지원(T.R.)에 감사를 표합니다.

절차는 나노 입자의 이중 방사성 형광 라벨, 생체 내 PET-CT 영상, 생체 생체 분포를 측정하고, 생체 면역 구성 및 유세포 분석. 모든 동물 실험은 메모리얼 슬론 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 이중 표지 된 리포좀 1. 준비 주 : 동계 B16 흑색 종 종양은 2 % -isoflurane 함유 산소를 흡입 마취로부터 C57BL / 6 마우스의 후방 측면에 30 B16-F10 세포를 주입함으로써 발생 될 수있다. 수술 중 멸균 작업 공간에서 멸균 시약 및 도구를 사용합니다. 수술 후주의 깊게 마취에서 그들의 회복 될 때까지 동물을 관찰한다. 그들은 전체 의식과 이동성을 회복하는 경우에만 다시 자신의 새장에 동물을 넣습니다. 이종 이식 종양 동물 용 살균 객실을 수용. 크기와 종양300mm의 3에 의한 나노 입자의 축적을 증가시킬 수 있습니다 자신의 발음 향상된 투자율 및 유지 효과 (EPR)에 나노 입자의 특성에 적합하다. 자세한 프로토콜은 아래에 제공됩니다. <ol><li> 둥근 바닥 플라스크에 들어있는 클로로포름 1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine (DPPC), 콜레스테롤, 1,2- disearoyl- SN -glycero- 2 ㎖에 지질의 20 mg의 혼합물을 용해 3 phosphoethanolamine - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE) DSPE-데페 록 사민 (DSPE-DFO) 8 및 1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5- 디설 폰산 ( DiIC12 [5]는 각각 61.3 %, 33.4 %, 5, 0.2 % 및 0.1 %의 몰비로) -ds. 참고 :이 지질 조성물은 현재 임상 2에 사용 된 독소루비신의 리포좀 제형과 매우 유사합니다. 우리의 과정에서 생성 된 리포좀은 밀접하게 임상 nanomedic의 생체 성능을 모방합니다오프라인. </li><li> 유기 용매를 제거하고, 실온에서 얇은 지질막을 형성하는 회전 증발기를 사용한다. PBS 20 mL를 넣고 30 분 동안 초음파 처리 얼음에 충분한 냉각과 3.8 mm의 초음파 팁 30 W의 진폭을 이용하여 나노 리포좀을 생성한다. </li><li> 원심 분리기 집계를 제거하고 세척 PBS는 원심 여과 (분자량 컷 - 오프 (MWCO 사용과 나노 입자 10 분 동안 4,000 XG에 리포좀 용액 : 어떤 것, 리포좀 무료 지질 및 잔류 유기 용매를 제거하기 위해 100 kDa의)을 집중. 상부 챔버 내에서 유지되고 새로운 튜브로 옮긴다. 리포좀은 후속 단계 전에 1 주 동안 PBS에서 냉장고에 저장 될 수있다. </li><li> 품질 관리, 동적 광산란 (DLS)으로 리포좀을 특성화. 특히, PBS 950 μL와 리포좀의 50 μL를 혼합 한 다음 크기 조정 큐벳에 혼합물을 전송합니다. 분석기에 큐벳을 놓고 입자를 측정크기 및 크기 분포. 각각 0.2 - 120 nm이고, 0.1 - 입자 크기 및 크기 분포 (다 분산도 지수 (PDI)가) 90이 될 것으로 예상된다. </li><li> 방사성 표지의 경우, (1.5 ㎖의 튜브에서 2 시간 동안 37 ° C에서 1 mCi의 89 ZR-옥살산 6.9와 7.1 사이의 pH에서 총 부피를 PBS 지질 2 ㎎에 상응 정제 리포좀, 혼합 ~ 100 μL). 1.3 단계와 유사 원심 여과 (MWCO = 100 kDa의)에 의해 자유, 미 반응 89 ZR을 제거합니다. 멸균 PBS와 잔류 물을 씻고 원하는 볼륨에 희석. 95 % - 방사 화학적 수율은 80해야한다. 주의! 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 조절된다. 금융 기관은 인증하고 필요한 시설, 인력 교육, 방사능 사용의 엄격한 모니터링을 제공해야합니다. 연구자들은 적절한 교육을 받고 방사능을 처리 할 때 개인 보호 장비 및 선량 반지 / 배지를 착용해야합니다. </li><li&gt; 일반적으로 98 % 10 이상이어야한다 크기 배제 라디오-HPLC에 의해 방사성 표지 된 리포좀의 방사 화학적 순도를 결정합니다. 95 %보다 낮은 방사 화학적 순도는 단계 1.5에 불충분 한 세척을 나타내는입니다. </li><li> 방사성 표지 한 후, 동적 광산란에 의한 나노 입자의 크기를 결정한다. 크기 및 PDI는 1.4 단계 (10)에서의 측정과 동일한 범위 내에있을 것으로 예상된다. 주 : 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 또는 형광 현미경을 허용하지 않는 경우, 비 - 방사성 NAT ZR-옥살 단계 1.5 리포좀 라벨을 사용할 수있다. 이러한 비 방사성 리포좀은 방사성 유사체와 동일한 특성을 갖는다. 이 절차의 묘사는도 2에 제공된다. </li></ol> 이중 표지 된 리포좀의 생체 PET-CT 영상 및 생체 분포 2. <ol><li> w 이중 표지 리포좀의 약 100 μL를 주입i 번째 구속 흑색 종 쥐에 방사능의 약 300 μCi를 - 약 10 mCi의 89 ZR / 체중 kg에서 자신의 꼬리 정맥을 통해 (C57BL / 6, 여성, 1016 주 이전). </li><li> 반감기를 결정하기 위해, 28-G 인슐린 주사기를 사용하여 2 % 이소 플루 란 하에서 산소 - 함유 마취 동물의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취. 2 분, 15 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 및 주입 후 48 시간에서 미리 칭량 튜브 - (20 μL 10)에 혈액을 수집한다. , 차에 의해 피 계량 감마 계수기를 사용하여 방사능 콘텐츠를 결정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 방사능 농도를 계산한다. 주 : 마취 시스템, 복구 케이지, 난방 및 생물 학적 후드가 장착 된 방에서 절차를 수행합니다. 동물이 완전히 복구하고 새장을 들고에 복구 케이지에서 그들을 전송하기 전에 시술 후 정상 이동성을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하우스 투여 동물 지정된 객실에서 종양 베어링 동물방사성 물질. </li><li> 24 또는 48 시간의 주입 후 작은 동물 MicroPET-CT 스캐너 (10) 리포좀, 이미지 마우스. 그 배에 수평으로 마취 된 동물을 놓고 마취를 유지. 코 콘을 통해 2 % 이소 플루 란 산소를 관리 할 수 ​​있습니다. 건조에서 그들을 방지하기 위해 스캔 전에 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 15 분의 대략적인 시간과 함께, 전신 PET 정적 스캔 기록 적어도 5000 만 일치하는 이벤트를 수행한다. 각각 350-700 keV의 6 ns의에서 에너지와 우연의 일치 타이밍 창을 설정합니다. 그 후, 5 분 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 검사를 수행합니다. 80 kV의 500 μA의 전류의 전압으로 X 선 튜브를 설정; 중부 표준시 스캔은 프레임 (10) 당 약 145 밀리로, 220도 총 120 회전 단계를 사용합니다. </li><li> 애완 동물-CT 검사 후 즉시 이산화탄소 질식하여 쥐를 희생하고 pinchi에 의해 죽음을 확인동물의 발을 ng를. 확인되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 먼저 좌심실에 20 mL의 PBS를 주입 한 후 우심방을 열고 절단하여 마우스 조직에서 혈액을 제거하고 이후 종양, 간, 비장, 폐, 신장, 근육, 등 16 관련 조직을 수집합니다. </li><li> 상기 조직 무게 (8, 9)를 계산하여 그 감마 방사능 함량을 측정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 조직 방사능 축적량을 계산한다. </li></ol> 3. 예 생체 유동 세포 계측법 및 면역 염색 주 : 체중 kg 당 0.5 mg의 염료의 투여 량으로 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 흑색 형광 리포좀 100 μL를 주입한다. 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 및 형광 현미경으로 허용되지 않는 경우, 비 - 방사성 리포좀이 사용되어야한다. <ol><li> 단계 2.5에서와 같이, 마우스 24 시간 후 주입을 희생하고 차가운 PBS에 저장해야 종양를 수집합니다. </li><li> 유동 세포 계측법에 대해 다음 단계 17를 따르십시오 <ol><li> 0.5 % BSA 및 1 (PBS 완충액 유세포에서 정제 된 콜라게나 제 I 및 II (4 U / ㎖), 히알루로 (60 U / ㎖)의 DNase I (60 U / ㎖)의 혼합물로 이루어진 효소 칵테일 준비 mM의 EDTA). </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 효소 칵테일 버퍼 200 μL와 종양 조직 100 mg의 혼합 및 미세 가위로 작은 조각으로 조직을 주사위. 튜브에 효소 칵테일의 또 다른 1.3 mL를 넣고 및 6 웰 플레이트에 그 내용을 전송합니다. </li><li> 60 rpm에서 60 분 동안 37 ℃로 오븐 내부에 배치 수평 진탕 기에서 6 웰 플레이트를 흔들어. </li><li> 단일 세포 현탁액을 얻었다 유세포 버퍼로 3 회 조직 파쇄 액을 씻는다. </li><li> 특정 CD45, CD11b를, Ly6C, 중 CD11c 포함하는 바이오 마커에 대한 항체의 칵테일 세포를 얼룩,CD64, CD3, MHCII와 CD31 (1 : 모든 항체 (200) 희석, 복제 정보가 재료 스프레드 시트에서 제공된다). 중요한 세포 유형을 확인하고 (5) 분석 소프트웨어 계측법 적절한 흐름 각 세포 집단에서 -ds DiIC12들의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다. </li></ol></li><li> 면역 염색의 경우, 다음 단계를 수행하십시오 : <ol><li> 최적의 절단 매체 OCT ()로 채워진 카세트에 종양을 놓고 드라이 아이스에 동결. </li><li> 종양 조직에서 6 μm의 냉동 섹션을 확인하고 조직학 유리 슬라이드에 배치; 섹션은 조직의 대표적인 정보를 제공하는 종양의 가장 큰 단면을 커버한다. </li><li> 바이오 마커를 얼룩 (예를 들어, 내피 세포에 대한 CD31)에 대응하는 항체 (예를 들어, 항 CD31, 복제 MEC13.3)에 관심. 파라 포름 알데히드와 섹션을 수정; 혈청 보조 항체의 종의 기원을 일치로를 차단; incub4 ° C에서 12 시간 동안 차 항체와 식사를 한 후 2 시간 동안 차 항체; 그리고 마지막으로, PBS로 씻어 커버 전표로 커버. 이미지 라이카 똑바로 공 촛점 SP5 현미경 (13), (16)와 스테인드 슬라이드. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxil%28R%29--the+first+FDA-approved+nano-drug%3A+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> J Control Release. 160, 117-134 (2012).</li>
<li>Green, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abraxane%2C+a+novel+Cremophor-free%2C+albumin-bound+particle+form+of+paclitaxel+for+the+treatment+of+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer.</a> Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).</li>
<li>Juliano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+is+the+wave+cresting%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: is the wave cresting?</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bankruptcy+filing+worries+developers+of+nanoparticle+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs.</a> Nature. 533, 304-305 (2016).</li>
<li>Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+so+many+papers+and+so+few+drugs%21%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs!</a> Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).</li>
<li>Dunphy, M. P., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiopharmaceuticals+in+preclinical+and+clinical+development+for+monitoring+of+therapy+with+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET.</a> J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+of+Tumor-Associated+Macrophages+with+89Zr-Labeled+High-Density+Lipoprotein+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles.</a> J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+labeling+strategy+for+in+vivo+PET+and+near-infrared+fluorescence+imaging+of+nanoparticle+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting.</a> J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/ncomms11838">Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy.</a> Nature communications. , (2016).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+macrophage+proliferation+suppresses+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+advances%22%5BJournal%5D)">Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation.</a> Science advances. , (2015).</li>
<li>Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticles+for+the+accurate+detection+of+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).</li>
<li>Gianella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+nanoemulsion+platform+for+imaging+guided+therapy+evaluated+in+experimental+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer.</a> ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44, 924-938 (2016).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+PET+Imaging+of+HDL+in+Multiple+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).</li>
<li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature communications. 5, 3065(2014).</li>
<li>Carney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+PET+Imaging+of+PARP1+Expression+in+Glioblastoma+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models.</a> Mol Imaging Biol. , (2015).</li>
<li>Salinas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodinated+PARP1+tracers+for+glioblastoma+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging.</a> EJNMMI Res. 5, 123(2015).</li>
<li>Carlucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Modality+Optical%2FPET+Imaging+of+PARP1+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma.</a> Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+screening+of+a+nanoparticle+library+improves+atherosclerosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).</li>
<li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).</li>
<li>Goodwill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-space+MPI%3A+magnetic+nanoparticles+for+safe+medical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging.</a> Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개할 내용이 없습니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 : 이중 표지 된 리포좀의 높은 품질이 장기간에 걸쳐 일관된 결과를 생성하는 열쇠이다. 무료 형광 염료 또는 (89) 지르코늄 이온은 완전히 다른 타겟팅 패턴을 생성 할 수있는 완전히 정제 단계 동안 제거되어야한다. 면역계는 훨씬 실험 암 나노 의학 성능에 영향을 미치는지 또한, 면역 적격 마우스 모델의 사용은이 프로토콜에서 사용 된 C57BL / 6 마우스에서의 B16-F10 흑색 종 모델로서 바람직 할 것이다. 종양 미세 환경이나 유전자 변이의 특정 조합이 중요한 요소 인 경우, 환자 유래의 종양 이종 이식 모델은 최적의 선택이 될 것이다. 수정 및 문제 해결 : 우리의 절차에 나노 의학의 생체 성능을 평가하는 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 종양 베어링imals. 이 절차는 다른 응용 프로그램에 대한 암 나노...

나노 의학은 암 치료 개발 한 패러다임 시프트된다. 이러한 liposome- 및 알부민 기반 nanotherapies 2, 3 등의 이전 암 나노 의학의 엄청난 임상 적 충격에 의해 영감을 많은 새로운 제형은 지난 10 년간 생산되고있다. 그러나, 이들 나노 의학 암의 임상 변환 성공의 최근의 분석은 이들 중 일부만 임상 -4,5- 승인 된 것을 나타낸다. 새로운 암 나노 의학의 임상 번역 한 주요 장애물이없는 치료 학적 화합물 (6)의 직접 투여와 비교하여 치료 지수의 제한된 개량이다. 전임상 동물 모델에서 전신 조직에 나노 의학 및 세포 수준의 생체 내 성능 등 정확한 평가로서 IDENTIF에 필수적인Y 미래 임상 번역에 대한 최적의 치료 지수 가진 사람. 나노 물질은 모든 임상 이미징 양식 (7) 중 뛰어난 감도와 재현성을 가지고 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상으로 살아있는 동물에서 양적 특성에 대한 방사성 표지가 될 수 있습니다. 예를 들어, 89 나노 의학 암 (8, 9), (10)뿐만 아니라 다른 질병 모델 (11)에 대한 마우스 모델에서 특성화되었다 긴 순환 ZR은 표지. 또한, 나노 의학의 혈중 반감기 및 생체 분포는 광범위 개별 조직 8 생체 방사능을 측정하여 평가할 수있다. 따라서, 방사성 표지는 체계적이고 조직 수준에서 나노 의학의 정량적 평가를 할 수 있습니다. 중요한 것은, radiolabeleD 나노 의학은 일반적으로 인한 방사성 신호의 제한된 공간 해상도로 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 분석 될 수 없다. 따라서, 형광 표식은 유동 세포 계측법 및 형광 현미경 (12)와 같은 광학 이미징 기술과 나노 입자의 평가 상보 양상 것을 안다. 이를 위해, 방사성 동위 원소 및 형광 태그로 표지 된 나노 입자는 정량적 핵 촬상하여 생체 내에서 평가 될 수 있고, 생체 방사능 계수에 의해, 이들은 광범위하게 결상에 의한 세포 수준에서 특성화 될 수있다. 이전에는, 고밀도 지단백질 (HDL) (11), 리포좀 (9), (10) 고분자 나노 입자, 항체 단편, 및 nanoemu 등 다양한 나노 입자에 방사성 형광 라벨을 포함하는 모듈 식 절차를 개발lsions 10, 13. 이 라벨이 나노 입자는 특정 응용 프로그램에 대해 이러한 나노 물질의 최적화를 유도 서로 다른 수준에서 관련 동물 모델에서 양적 특성 허용했다. 현재 연구에서, 그 목적은 가장 확립 나노 의학 플랫폼 14 이중 표지 된 나노 입자를 생성하는 광범위한 방법을 설명하는 일례를 가득 차거나 철저히 고전 동계 흑색 종 B16-F10의 마우스 모델 (15)을 특성화하는 리포좀 - 더 나노 입자를 사용하는 . 결과로부터, 우리는이 나노 입자를 특성화 방법 관련 마우스 모델에서 다른 암 나노 의학 평가하도록 구성 될 수 있다고 확신한다.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Home made</td><td>110634</td><td>Perez-Medina et al., JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>원심 필터</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC 2 LC-10AT 펌프</td><td>포함 N/A</td><td></td></tr><tr><td>89Zr-oxalate</td><td>MSKCC</td><td>사내에서 합성</td><td>TR19/9 가변 빔 사이클로트론(Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>감마 카운터</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>모든 다중 매개변수 유세포 분석기는</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP 흑색종 세포</td>로 충분합니다. 집에서 <td>만든</td><td>N/A</td><td>연어 et al., Immunity, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C(클론 HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII(M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45(30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64(X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b(M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) 형광단 없음</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

병원에서 이전 암 나노 의학의 성공에 의해 영감을, 연구진은 지난 10 년간 새로운 제형의 큰 숫자를 생성했다. 임상 개발중인 나노 의학의 대부분 실망스러운 결과를 생산하는 반면, 나노 의학의 단지 소수의 임상 사용이 승인되었다. 새로운 암 나노 의학의 성공적인 임상 번역 한 주요 장애물은 생체 내 성능의 정확한 이해의 부족이다. 이 문서는 양전자 방출 단층 촬영 - 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT), 방사능 정량 방법의 통합을 통해 조직, 조직, 단일 세포 및 세포 내 수준에서 종양 베어링 마우스의 나노 의학의 생체 내 동작을 특성화하기 위해 엄격한 절차를 제공합니다 , 유동 세포 계측법 및 형광 현미경. 이 방법을 사용하여, 연구자들은 정확하게 cance의 중요한 마우스 모델에서 신규 한 나노 조성물을 평가할 수있다아르 자형. 이러한 프로토콜은 높은 병진 전위 가장 유망한 암 나노 의학을 식별하거나 미래 번역 암 나노 의학의 최적화를 도울 수있는 능력을 가질 수있다.

그림 1은 절차의 개요를 보여줍니다. 도 2는 단계 1 내지 10에 기술 된 이중 표지 된 리포솜의 개략적 인 합성 방법을 제시한다. 그림에서 2 단계에 설명 된대로 3 표시 대표적인 PET-CT 이미지 (그림 3a), PET 영상 (그림 3B), 혈중 반감기 (도 3c), 방사성 나노 입자의 생체 분포 (그림 3 차원)에서 방사능 정량을, 도 3a는, 리포좀 매우도 3b에서의 촬상 결과의 정량 분석에 의해 확인 된 종양에 축적된다. 또한, 리포좀은도 3c에 약 10 시간의 혈중 반감기를 표시합니다...

나노 의약품의 생체 내 성능에 대한 이해가 부족하여 임상 번역이 지연됩니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 마우스에서 전신, 조직, 단세포 및 세포 내 수준에서 암 나노의약품의 생체 내 거동을 평가하는 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 이 접근 방식은 연구자가 임상 번역을 위한 유망한 암 나노의약품을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

본 절차의 전반적인 목표는 종양을 가진 면역 정상 마우스의 전신, 조직, 단일 세포 및 세포 하위 수준에서 암 나노 의약품의 in vivo 거동을 평가하는 것입니다. 이 방법은 암 나노 의약품 분야의 핵심 질문인 '생체 내 동물 모델의 서로 다른 조직에서 시간이 경과함에 따라 나노 의약품이 정량적으로 어떻게 축적되는가?'에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 이러한 이중 표지법을 통해 거시적 수준에서 미시적 수준까지 나노 의약품의 in vivo 특성 분석이 가능하다는 점입니다. 리포좀은 현재 임상에서 사용되고 있을 뿐만 아니라 실험적 나노 의약품의 일반적인 플랫폼이므로, 본 절차를 시연하기 위한 예시로 리포좀을 선택하였습니다. 절차를 시작하려면, 0.1% mol의 친지질성 양이온 형광 염료가 포함된 지질 혼합물 20 milligrams를 클로로포름 2 milliliters에 녹입니다.그 후, 회전 증발기를 사용하여 지질을 건조합니다. 건조된 지질에 20 milliliters의 인산염 완충 식염수를 첨가합니다. 3.8 millimeter 프로브 초음파 처리기로 30 watts에서 30분 동안 얼음 위에서 혼합물을 초음파 처리하며, 처리 과정 전반에 걸쳐 혼합물의 온도를 4 및 20 °C 사이로 유지합니다.생성된 리포좀 나노입자 현탁액을 4,000 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 제거하고 100 kilodalton MWCO 원심분리 필터 유닛을 사용하여 4000 G에서 PBS로 리포좀을 세척합니다. 농축된 리포좀을 상단 챔버에서 새 원심분리 튜브로 옮깁니다. 리포좀은 PBS에 담아 냉장고에 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.정제된 리포좀 현탁액 50 µL와 PBS 950 µL의 혼합물에 대해 동적 광산란(dynamic light scattering)을 수행합니다. 입자 크기를 측정하고 크기 분포를 결정합니다. 방사성 표지 절차를 시작하려면, 지질 2 mg을 확보할 수 있도록 필요한 양의 정제된 리포좀과 PBS를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.여기에 zirconium-89 oxalate 1 mCi를 첨가하여 최종 부피 100 µL, pH 6.9~7.1로 맞춥니다. 혼합물을 37 °C에서 2시간 동안 교반합니다. 그 다음, 100 kDa 필터 유닛을 사용하여 4,000 ×g에서 원심분리 여과로 유리 zirconium-89를 제거합니다. 잔류물을 멸균된 PBS로 4,000 ×g에서 3회 세척합니다. 이후 잔류물을 주사용으로 약 3 µCi/µL가 되도록 희석합니다.방사선 검출기와 결합된 크기 배제 HPLC를 사용하여 방사성 표지 리포좀의 방사화학적 순도를 결정하십시오. 방사화학적 순도가 95% 미만인 경우 투여량을 다시 조제하십시오. 동적 광산란법을 사용하여 입자 크기와 분포 값이 비방사성 표지 리포좀의 값과 모두 유사한지 확인하십시오.영상 촬영 절차를 시작하려면, 보정된 흑색종 마우스의 꼬리 정맥에 약 300 microcurie의 방사성 표지 리포좀을 주입하십시오. 주입 2분 후, 28게이지 인슐린 주사기를 사용하여 마우스의 꼬리 정맥에서 10~20 microliter의 혈액을 채취하십시오. 채취한 혈액 샘플을 미리 무게를 측정한 계수관으로 옮기십시오.혈액 샘플의 무게를 측정하고 감마 카운터를 사용하여 방사능 수치를 측정합니다. 주입된 용량의 그램당 백분율로 방사능 농도를 계산합니다. 주입 15분 후에 동일한 방법으로 또 다른 혈액 샘플을 채취하여 측정합니다.그런 다음, 노즈콘을 통해 2% isoflurane과 산소를 투여하여 마우스를 마취합니다. 주사 후 1시간이 지나면 세 번째 혈액 샘플을 채취하고 측정합니다. 그 후, 마우스가 정상적인 운동 능력을 회복할 때까지 회복 케이지에서 안정을 취하게 합니다.주입 후 4, 8, 24, 48시간에 추가 샘플을 수집하십시오. 주입 사이에 마우스가 완전히 회복되도록 하십시오. 방사성 물질이 투여된 동물을 위한 지정된실에 마우스를 사육하십시오.리포좀 주입 24시간 또는 48시간 후에 2% isoflurane과 산소로 마우스를 마취시킵니다. 마우스를 소동물 microPET-CT 스캐너 베드 위에 배를 대고 엎드린 자세로 놓습니다. 노즈콘을 통해 2% isoflurane과 산소를 계속 공급합니다.마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포하십시오. 그 다음, 스캐너 베드를 장비 내부로 이동시킵니다. 에너지 범위 250~700 keV, 동시 계수 시간 창 6 ns 조건에서 최소 5,000만 건의 동시 계수 이벤트가 확보되도록 15분간 전신 PET 정적 스캔을 수행하십시오.다음으로, 프레임당 약 145 ms의 속도로 220도 범위에서 120 회전 단계로 5분 동안 CT 스캔을 수행합니다. 스캔이 완료되면 즉시 이산화탄소 질식법으로 마우스를 희생시킵니다. 동물의 발을 꼬집어 사망을 확인한 후, 경추 탈구를 수행합니다.혈액을 제거하기 위해 PBS로 조직을 관류하고, 해당 조직 샘플을 채취합니다. 수집한 조직의 무게를 측정하고 그 활성도를 측정합니다. 조직 내 방사성 표지 리포좀의 축적량을 주입량 대비 그램당 백분율(% injected dose per gram)로 계산합니다.종양 조직을 차가운 PBS에 보관하십시오. 수확한 종양 조직에 대해 ex vivo 유세포 분석 및 면역형광 이미징을 수행하여 세포군에 따른 축적량을 측정하십시오. zirconium-89로 표지된 나노입자를 주입한 종양 함유 마우스의 PET/CT 이미징 결과, 주입 24시간 후 종양 조직에서 상당한 나노입자 축적이 확인되었습니다.나노입자의 혈중 반감기는 약 10시간으로 측정되었습니다. 주입 24시간 후의 ex vivo 생체 내 분포 측정 결과는 in vivo PET/CT 측정 결과와 일치했습니다. 이후 면역 염색 기법을 사용하여 단일 세포 수준에서 나노입자의 축적을 조사하였습니다.유세포 분석 결과, 나노입자가 종양 관련 대식세포에 우선적으로 축적되는 것으로 나타났습니다. 종양 샘플의 면역형광 이미징 또한 나노입자가 내피세포를 특이적으로 표적으로 삼음을 보여주었습니다. 이 기술은 연구자가 임상 적용을 위한 유망한 나노 의약품을 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 나노의약품의 방사성 표지를 수행할 때는 높은 수준의 품질 관리 기준을 적용하는 것이 중요합니다. 본 절차를 따라 나노에멀전, 고분자 나노입자, 마이셀, 항체 및 항체 단편과 같은 다른 나노의약품을 표지함으로써, 종양 유발 마우스 모델에서 이들의 체내 성능을 측정할 수 있습니다.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vivo-performance-cancer

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

polymalic 산계 나노 약물의 예는 암에 적용 가능하다 맞춤 의학의 합리적인 디자인으로 제시된다. 그것은 누드 마우스에 HER2가 긍정적 인간 유방암을 치료하는 나노 약물의 합성을 설명한다.

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

맞춤형 전달 시스템을 사용한 자성 나노입자 온열요법의 체외 및 생체 내 전달

표준 프로토콜은 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 IL-1α의 항종양 활성 및 관련 독성을 연구하기 위해 설명된다.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

학습하세요 종양이 있는 면역능이 있는 생쥐에서 암 나노의약품의 생체내 거동을 체계적, 조직, 단일세포 및 세포내 수준에서 평가하는 방법을. 이중 표지 기법을 활용한 이 절차는 임상 적용 가능성이 있는 유망한 나노의약품 후보를 식별하는 데 도움을 줍니다.

포괄적 인 절차를 평가하는

더 많은 동영상 탐색