포괄적 인 절차를 평가하는

본 절차의 전반적인 목표는 종양을 가진 면역 정상 마우스의 전신, 조직, 단일 세포 및 세포 하위 수준에서 암 나노 의약품의 in vivo 거동을 평가하는 것입니다. 이 방법은 암 나노 의약품 분야의 핵심 질문인 '생체 내 동물 모델의 서로 다른 조직에서 시간이 경과함에 따라 나노 의약품이 정량적으로 어떻게 축적되는가?'에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 이러한 이중 표지법을 통해 거시적 수준에서 미시적 수준까지 나노 의약품의 in vivo 특성 분석이 가능하다는 점입니다. 리포좀은 현재 임상에서 사용되고 있을 뿐만 아니라 실험적 나노 의약품의 일반적인 플랫폼이므로, 본 절차를 시연하기 위한 예시로 리포좀을 선택하였습니다. 절차를 시작하려면, 0.1% mol의 친지질성 양이온 형광 염료가 포함된 지질 혼합물 20 milligrams를 클로로포름 2 milliliters에 녹입니다.

그 후, 회전 증발기를 사용하여 지질을 건조합니다. 건조된 지질에 20 milliliters의 인산염 완충 식염수를 첨가합니다. 3.8 millimeter 프로브 초음파 처리기로 30 watts에서 30분 동안 얼음 위에서 혼합물을 초음파 처리하며, 처리 과정 전반에 걸쳐 혼합물의 온도를 4 및 20 °C 사이로 유지합니다.

생성된 리포좀 나노입자 현탁액을 4,000 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 제거하고 100 kilodalton MWCO 원심분리 필터 유닛을 사용하여 4000 G에서 PBS로 리포좀을 세척합니다. 농축된 리포좀을 상단 챔버에서 새 원심분리 튜브로 옮깁니다. 리포좀은 PBS에 담아 냉장고에 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.

정제된 리포좀 현탁액 50 µL와 PBS 950 µL의 혼합물에 대해 동적 광산란(dynamic light scattering)을 수행합니다. 입자 크기를 측정하고 크기 분포를 결정합니다. 방사성 표지 절차를 시작하려면, 지질 2 mg을 확보할 수 있도록 필요한 양의 정제된 리포좀과 PBS를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

여기에 zirconium-89 oxalate 1 mCi를 첨가하여 최종 부피 100 µL, pH 6.9~7.1로 맞춥니다. 혼합물을 37 °C에서 2시간 동안 교반합니다. 그 다음, 100 kDa 필터 유닛을 사용하여 4,000 ×g에서 원심분리 여과로 유리 zirconium-89를 제거합니다. 잔류물을 멸균된 PBS로 4,000 ×g에서 3회 세척합니다. 이후 잔류물을 주사용으로 약 3 µCi/µL가 되도록 희석합니다.

방사선 검출기와 결합된 크기 배제 HPLC를 사용하여 방사성 표지 리포좀의 방사화학적 순도를 결정하십시오. 방사화학적 순도가 95% 미만인 경우 투여량을 다시 조제하십시오. 동적 광산란법을 사용하여 입자 크기와 분포 값이 비방사성 표지 리포좀의 값과 모두 유사한지 확인하십시오.

영상 촬영 절차를 시작하려면, 보정된 흑색종 마우스의 꼬리 정맥에 약 300 microcurie의 방사성 표지 리포좀을 주입하십시오. 주입 2분 후, 28게이지 인슐린 주사기를 사용하여 마우스의 꼬리 정맥에서 10~20 microliter의 혈액을 채취하십시오. 채취한 혈액 샘플을 미리 무게를 측정한 계수관으로 옮기십시오.

혈액 샘플의 무게를 측정하고 감마 카운터를 사용하여 방사능 수치를 측정합니다. 주입된 용량의 그램당 백분율로 방사능 농도를 계산합니다. 주입 15분 후에 동일한 방법으로 또 다른 혈액 샘플을 채취하여 측정합니다.

그런 다음, 노즈콘을 통해 2% isoflurane과 산소를 투여하여 마우스를 마취합니다. 주사 후 1시간이 지나면 세 번째 혈액 샘플을 채취하고 측정합니다. 그 후, 마우스가 정상적인 운동 능력을 회복할 때까지 회복 케이지에서 안정을 취하게 합니다.

주입 후 4, 8, 24, 48시간에 추가 샘플을 수집하십시오. 주입 사이에 마우스가 완전히 회복되도록 하십시오. 방사성 물질이 투여된 동물을 위한 지정된실에 마우스를 사육하십시오.

리포좀 주입 24시간 또는 48시간 후에 2% isoflurane과 산소로 마우스를 마취시킵니다. 마우스를 소동물 microPET-CT 스캐너 베드 위에 배를 대고 엎드린 자세로 놓습니다. 노즈콘을 통해 2% isoflurane과 산소를 계속 공급합니다.

마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포하십시오. 그 다음, 스캐너 베드를 장비 내부로 이동시킵니다. 에너지 범위 250~700 keV, 동시 계수 시간 창 6 ns 조건에서 최소 5,000만 건의 동시 계수 이벤트가 확보되도록 15분간 전신 PET 정적 스캔을 수행하십시오.

다음으로, 프레임당 약 145 ms의 속도로 220도 범위에서 120 회전 단계로 5분 동안 CT 스캔을 수행합니다. 스캔이 완료되면 즉시 이산화탄소 질식법으로 마우스를 희생시킵니다. 동물의 발을 꼬집어 사망을 확인한 후, 경추 탈구를 수행합니다.

혈액을 제거하기 위해 PBS로 조직을 관류하고, 해당 조직 샘플을 채취합니다. 수집한 조직의 무게를 측정하고 그 활성도를 측정합니다. 조직 내 방사성 표지 리포좀의 축적량을 주입량 대비 그램당 백분율(% injected dose per gram)로 계산합니다.

종양 조직을 차가운 PBS에 보관하십시오. 수확한 종양 조직에 대해 ex vivo 유세포 분석 및 면역형광 이미징을 수행하여 세포군에 따른 축적량을 측정하십시오. zirconium-89로 표지된 나노입자를 주입한 종양 함유 마우스의 PET/CT 이미징 결과, 주입 24시간 후 종양 조직에서 상당한 나노입자 축적이 확인되었습니다.

나노입자의 혈중 반감기는 약 10시간으로 측정되었습니다. 주입 24시간 후의 ex vivo 생체 내 분포 측정 결과는 in vivo PET/CT 측정 결과와 일치했습니다. 이후 면역 염색 기법을 사용하여 단일 세포 수준에서 나노입자의 축적을 조사하였습니다.

유세포 분석 결과, 나노입자가 종양 관련 대식세포에 우선적으로 축적되는 것으로 나타났습니다. 종양 샘플의 면역형광 이미징 또한 나노입자가 내피세포를 특이적으로 표적으로 삼음을 보여주었습니다. 이 기술은 연구자가 임상 적용을 위한 유망한 나노 의약품을 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 나노의약품의 방사성 표지를 수행할 때는 높은 수준의 품질 관리 기준을 적용하는 것이 중요합니다. 본 절차를 따라 나노에멀전, 고분자 나노입자, 마이셀, 항체 및 항체 단편과 같은 다른 나노의약품을 표지함으로써, 종양 유발 마우스 모델에서 이들의 체내 성능을 측정할 수 있습니다.