Name: 세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템 결핵균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 루시퍼레이스 기반 고효율 스크리닝 시스템으로 인간 대식세포 내 Mycobacterium tuberculosis 생존율과 세포독성을 평가하는 방법입니다. 이 기법은 결핵 신약 개발에서 시간과 노동을 절약합니다.

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이 연구는 BC Lung Association과 Mitacs의 지원을 받았습니다.

1. 균주 및 성장 매체 <ol><li> 소 혈청 알부민 25 g, 덱 스트로스 10.0 g, 및 탈 이온수 460 ㎖의 염화나트륨 4.05 g을 가용화하여 알부민 스트로스 염화칼슘 원액 (ADS)을 만든다. 4 ° C에서 ADS 및 저장을 필터 소독. </li><li> 7H9 분말 4.7 g 및 정제수 900 mL의 글리세롤 2 mL를 첨가하여 7H9 국물을 만들기. 10 분 동안 121 ° C에서 7H9 액체 배지를 오토 클레이브가 진행하기 전에 실온으로 냉각시킨다. ADS 100㎖로 7H9 액체 배지 900 ㎖의 트윈 80을 0.5 mL를 첨가하여 7H9ADST합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 카나마이신 설페이트 50 mg의 무게를 측정하고 1 ㎖ 탈 이온수에 녹여; 최종 농도 50 ㎎ / ㎖이다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 보관. 7H9ADST의 1 L 당 원액을 카나마이신 0.5 ML을 추가합니다. 이 매체는 신선한해야한다, 그래서 문화의 크기에 따라 적절하게 볼륨을 확장 : 참고. </li><li> 7H에서 결핵균 성장9ADST 문화 서에서 카나마이신으로 보충. 매일 문화를 흔들어하고 OD600이 응집을 방지하기 위해 1.0에 도달하기 전에 희석. 주 :이 방법의 개발에 사용되는 결핵균 H37Rv 균주 pJAK2.A 12 플라스미드로 형질 전환 하였다. pJAK2.A은 Hsp60에 프로모터 반딧불이 루시퍼 라제 유전자의 높은 수준의 발현을 허용하고 카나마이신을 사용하여 선택 될 수 pMV361 벡터에 기초하여 통합 플라스미드이다. </li></ol> 2. THP-1 중간 및 유지 보수 <ol><li> RPMI를 완전 배지 (대략 10 % FBS와 2 mM의 글루타민)을 만들기 위해 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 및 RPMI 1640 500 ㎖ 내지 200 mM의 L- 글루타민 5 ㎖ 50 ㎖의 추가. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 13 THP-1 세포 배양 물을 유지한다. PAS 사이 배지 1 ㎖ 당 0.2 내지 1 백만의 셀 밀도를 유지하면서 간단하게, 완전 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 성장현인. </li></ol> 3. 높은 처리량 세포 내 검사 루시 페라 제 발현 M. 결핵 H37Rv 사용 <ol><li> 600 nm의 파장에서 분광 광도계에서 활발히 성장 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다. mL를 0.1 OD 600 = 3 × 107 세균의 변환 계수를 이용하여 박테리아의 밀도를 계산한다. </li><li> 새로운 원심 분리 튜브로 1 : 10의 감염 (MOI)의 다수 충분한 박테리아를 피펫. 10 분 동안 3,000 XG에서 펠릿 액체를 흡인. RPMI1640의 450 μL에 인간 혈청 50 μL를 추가합니다. 실험에 대한 값을 적절한하기 위해 볼륨을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 박테리아 opsonize 위해 10 % 인간 혈청을 함유하는 RPMI1640 500 μL 당 1 × 108 세균의 농도로 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 30 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수있다. 혈구와 반전 microsco 카운팅하여 THP-1 세포 배양 물 농도를 결정체육. </li><li> 100 XG에서 멸균 원심 분리 튜브에 세포 펠렛을 10 분간 37 ° C. 상등액을 흡인하고 불완전 mL의 1 개 백만 세포의 밀도로 RPMI에서 세포를 재현 탁. 40 NG / ㎖ 최종 농도 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA)를 추가한다. 참고 :이이 분화 믹스라고한다. </li><li> 10의 MOI에서 THP-1 분화 믹스 옵 소닌 결핵균 결합 : 1, 96- 웰 평면 바닥 플레이트에서 흰색 웰 당 100 μL의 최종 믹싱 나누어지는. 정기적 균일 성을 보장하기 위해, 혼합물을 교반한다. 분화 및 감염 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용. </li><li> RPMI 각 100 μL로 두 번 우물을 씻으십시오. 완전 RPMI에서 원하는 농도로 희석 된 화합물을 첨가하고 3 일 동안 배양한다. </li><li> 웰로부터의 배지를 흡인. 각 웰 루시퍼 라제 분석 시약 50 μL를 추가한다. t와 플레이트를 밀봉ransparent 접착제 플레이트 씰러. 22 ° C에서 배양 5 분을 허용 한 후 1 초에 루미의 판독을 얻기 웰당. </li></ol> 4. 세포 독성 분석 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하여 검정 (14) <ol><li> RPMI에서 THP-1 세포 분화 불완전 맑은 96 웰 플레이트에서 40 NG PMA / ㎖로 보충. 셀 mL의 1 백만의 밀도와 나누어지는 잘 당 100 μL를 유지한다. 분화가 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용. </li><li> 웰에 완전 RPMI에 희석 된 화합물을 추가 웰로부터 배지를 흡인하고 RPMI 1640 회 씻는다. 3 일 품어. </li><li> 5 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)을 100 mL의 MTT 0.5 g을 녹이고. 광 거리에서 -20 ° C에서 살균 필터 및 저장; 그것은이 솔루션 신선하게하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 2.5 시간을 befor전자 3 일간의 잠복기의 끝, 각 웰에 MTT 용액 25 μL를 추가하고 잠복기를 완료합니다. </li><li> 50 % N을 준비 N의 디메틸 포름 아미드 (DMF), 탈 이온수 250ml를 DMF 250ml의 혼합함으로써. </li><li> 다음 MTT 추출 버퍼 준비 : 500 ㎖의 병 SDS 100g의 무게를 재고 50 % DMF 300 mL를 첨가. SDS 용해 할 수 있도록 낮은 열을 적용합니다. 순수한 아세트산 10 mL의 1 M 염산 12.5 mL를 넣고. 50 % DMF와 500mL의 마크까지 채우고; 추출 완충액의 최종 조성물은 50 %의 DMF, 20 % SDS, 2.5 % 아세트산, 2.5 %, 1 개 M 염산이다. </li><li> 처리 기간의 마지막에, 각 웰에 (모든 결정을 용해 45 ℃로 가온) 추출 완충액 100 μL를 추가한다. 혼합물을 37 ℃에서 밤새 배양 허용 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 C를 °. 570 nm에서 흡광도를 읽어보십시오. 주 : 세포 독성 분석을 가장 잘 인트라 셀에 병렬로 수행THP-1 세포의 동일 배치 나이를 사용하여 울라 화면. </li></ol> 5.에서-국물 활동 분석은 레사 주린 분석 (3)를 사용하여 <ol><li> 미드 로그 상 (- OD 600 0.8 ~ 0.5)로 7H9ADST에서 결핵균 성장. 0.01 OD 600에 7H9ADST로 배양을 희석. 각 웰에 희석 된 화합물을 각각의 시험 농도 및 100 μL 분취를 2 배 7H9ADST의 화합물을 희석한다. </li><li> 각 웰에 희석 된 세균 현탁액 100 ㎕를 옮긴다. 플레이트를 5 일 동안 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양 할 수있다. 탈 이온수 및 살균 필터 100 mL에 레사 주린 10 ㎎을 용해. </li><li> 30 μL 레사 주린 용액에 추가하고 48 시간 후 색상 변화를 모니터링; 세균의 성장은 분홍색 파란색에서 색 변환으로 표시됩니다. 주 : 정량 분석도 530에서 여기와 590 nm에서의 형광 중 하나를 측정함으로써 수행 될 수있다 - 560나노 미터 또는 570 nm에서의 흡광도와 600 nm의 15. </li></ol>

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</ol>

저자는 이 작업에 대해 경쟁적인 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 연구의 목적은 결핵균에 대한 인간의 세포 내 감염 모델을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 HTS 방법을 만드는 것이 었습니다. 결핵은 M. 결핵하여 폐포 대 식세포의 감염에 의해 특징 인간의 질병이다. 때문에 바이오 안전성 문제, 박테리아 및 숙주 세포 모두의 생물학적 모델을 포함하는 연구는 과거에 사용되어왔다. 그러나,이 대리 박테리아와 인간이 아닌 모델의 사용은 약물 검사가 가장 결핵균 19, 20에 감염된 인간 세포로 이루어집니다 나타내는 약물 개발의 히트를 리드 성공의 가난한 예측 것으로 나타났다, (21, 22). 이 방법에서는, 고급 인간 대 식세포 등 THP-1 세포주에 대한 현재의 최...

결핵균, 결핵 (TB)의 원인이되는 에이전트는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 약물에 민감한 TB 6 개월의 기간 동안 여러 항생제를 필요로하는 치료가 가능한 질환입니다. 치료 가능한 질병 임에도 불구하고, 결핵 사망률은 2015 일에서 150 만 것으로 추정되었다. 지난 10 년 동안, 약제 내성 결핵균의 유병률에 대한 우려가 증가하고있다. 다제 내성 결핵 (MDR-TB)가 적어도 이소니아지드 (INH) 리팜피신 (RMP), 가장 MDR-TB 균주 따라서 치료 옵션을 제한 두번째 선 TB 약물을 선택하는 것이 내성에 강한 TB로 정의된다 . 약제 내성의 효과는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 환자의 공동 치료를위한 큰 도전을 생성; 40 환자는 전 세계적으로 2,015 1 HIV 관련 결핵으로 사망. 실망, 미국 식품의 약국 Administ배급은 지난 40 년 2, MDR-TB, bedaquiline에 대한 하나의 새로운 결핵 약을 승인했다. 더 짧은 TB 치료를 찾는의 발전이 시급히 TB와 MDR-TB의 싸움에 앞서 유지하기 위해 필요하다. 전통적으로, TB 약물 스크린 화합물은 성장 배양에 첨가하여 미생물의 박멸에 그 효과는 고체 배지에서 집락 형성 단위 (CFU)을 계산하여 결정함으로써 성장 배지에서 체외 성장 조건 하에서 수행된다. CFU 카운트는 노동 집약적, 시간 소모, 비용이 많이 드는만큼, 다양한 간접 방법이 문제를 완화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법들은하는, Alamar 블루 생존 분석 3, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼 라제를 발현하는 박테리아에서 형광 발광 5 (4)의 결정 및 총 아데노신 삼인산의 추정 (A 포함TP) 6,7. 전형적인 TB는 박테리아 상주 폐포 대 식세포 (8)의 내부 phagosomes 복제 폐,의 결핵균 감염에 의해 특징된다. 간단한에서 국물 표현형 화면이 세포 외 병원균에 맞게 할 수있다; 그러나, 역사적 관점에서이 방법을 사용하여 식별 결핵균에 대한 화합물은 종종 감염 모델에서 다운 스트림 검증 단계에서 기대에 부응하는 데 실패했다. 우리는 결핵 약물이 가장 세포 내 숙주 세포 감염 모델에서 수행되는 것을 제안한다. 그럼에도 불구하고, 세포 내 모델은 높은 처리량 스크리닝 (HTS) 개발에 많은 기술적, 생물학적 장벽을 가지고있다. 큰 장애물은 여러 단계와 세정 사이에 의하여 세포 외 박테리아의 정교한 제거 예로, 악성 프로세스의 복잡성이다. 두 번째 주요 장애물은 긴 시간 재quirements는 일반적으로 CFU 문화 판에 계산에 의해 수행 성장 탐지으로 완료하는 데 3 주 이상 걸리는 과정이다. CFU 카운트를 대체하는 하나 개의 솔루션은 형광 박테리아와 함께 자동 형광 현미경으로 제공되었습니다. 그러나,이 솔루션은 많은 연구 실험실의 손이 닿지이다 초기 설비 투자를 필요로한다. 간단하고 저렴한 비용, 질병 관련 HTS 방법은 크게 신약 개발 프로세스를 향상시킬 것입니다. 본 연구에서는 세포 내 결핵균에 대한 화합물의 활성을 결정하기에 적합한 빠른, 높은 확장 성이면서 경제적 인 분석을 제공하는 것을 목적으로, 새로운 모듈 형 HTS 시스템에보고한다. (나) 세포, (ⅱ) 세포 독성, 및 (iii)의 국물 분석법 :이 시스템은 세 개의 모듈로 구성된다. 합한 최종 결과는 액션의 전위 모드와 같은 추가 정보, 화합물 성질의 포괄적 인 설명을 제공한다. 이 SC시스템 reening하는 것은 약물 시너지 (9)의 분석을 포함한 행동 모드를 대상으로 다양한 화합물 라이브러리, 여러 프로젝트에서 사용되고, 자식 작용 (10)의 자극, 및 결핵균의 억제 독성 인자 (미공개) -secreted. 행동의 알 수없는 모드의 화합물은 또한 11 연구되고있다. 이 방법의 수정 된 버전은 또한 세포 내 결핵균 (11)에 대해 새로운 화합물을 식별 차 스크리닝 방법으로서의 산업 파트너가 채택되었다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>알부민, 소 pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>, 피셔 사이언티픽</td>, <td>BP350</td><td></td></tr>, <tr><td>염화나트륨</td>, <td>피셔 사이언티픽</td>, <td>BP358</td><td></td></tr>, <tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>, 피셔 사이언티픽</td><td>BP906</td><td></td></tr>, <tr><td>PMA,</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>P8139</td><td></td></tr>, <tr><td>MTT</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>M2128</td><td></td></tr><tr><td><>N,N- 디메틸포름아미드(DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M 하이드로콜로릭산(HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>레사주린</td><td>알파 Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. 결핵 H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플랫 바닥 화이트 플레이트</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95웰 플랫 바닥 투명 플레이트</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>투명 플레이트 씰러</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>Applied Biosystems</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

결핵(TB)의 원인원인인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 다제내성결핵(MDR-TB)의 확산이 증가함에 따라 다발성 결핵 감염에 대한 새로운 치료 전략을 개발해야 하는 시급성이 급박해졌습니다. 전통적으로 화합물은 육즙의 시험관 내 성장 조건에서 항균 활성을 기반으로 평가됩니다. 그러나 M. tuberculosis와 같은 세포 내 병원체에 대한 결과는 종종 오해의 소지가 있는데, 이는 배양 내 표현형 스크리닝 조건이 인체 내 실제 질병 상태와 크게 다르기 때문입니다. 대식세포 내부에서 작용하는 억제제를 선별하는 것은 전통적으로 M. tuberculosis의 복잡성, 감염의 가변성 및 느린 복제 속도로 인해 어려웠습니다. 이 연구에서는 대식세포 감염 모델에서 M. tuberculosis의 생존력에 대한 화합물의 효과를 신속하게 평가하기 위한 새로운 접근 방식을 보고합니다. 세포 독성 분석법과 배설물 M. tuberculosis viability assay의 조합을 사용하여 관심 화합물에 대한 포괄적인 분석을 생성하는 스크리닝 시스템을 만들 수 있었습니다. 이 시스템은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있는 저렴한 비용으로 정량적 데이터를 생성할 수 있지만 대규모 산업 환경에 맞게 확장성이 뛰어납니다.

루시퍼 라제 유전자를 발현 결핵균을 이용하여 높은 처리량 스크리닝 세포 도 2a 및 표 1은 루미 의해 수집 된 원시 데이터, THP-1 세포 안에 결핵균의 TB 약물 리팜피신의 농도 증가의 효과를 나타내는, 상대적 형광 단위 (RLU)에서 발현 함유한다. 도 2a는 리팜피신의 다양한 농도에 대한 측정 RLU 원시 발광의 산포도이다. 오류 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 도 2b는 비 처리 웰에 비해 처리 된 웰의 발광의 % 감소를 나타낸다. 데이터 리팜피신은 0.1 ㎍ / ml의 농도에서 세포 내 결핵균으로부터의 RLU&gt; 99.9 %로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 ...

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 화합물이 인간 대식세포 내 M.tuberculosis의 생존에 미치는 영향에 대해 다차원적인 평가를 제공하는 것입니다. 이 방법은 루시페라아제(Luciferase) 기반의 효능 분석을 중심으로 합니다. 세포독성 및 MIC 분석과 결합하면 결핵 치료제 개발 과정에서 HIT 화합물의 수정에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.본 방법의 주요 장점은 시간과 노동력을 절감할 수 있다는 것입니다. 이는 CFU(colony forming unit) 분석법을 루시퍼레이스(Luciferase) 기반 분석법으로 대체하는 것입니다. 일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 연구자는 자동화 대신 수동 피펫팅을 사용할 때 일관성을 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.일관된 피펫팅 기술이 매우 중요합니다. THP1 세포를 완전 배지가 포함된 RPMI에서 배양하십시오. 계대 배양 사이에는 배지 밀리리터당 0.2에서 100만 개의 세포 밀도를 유지하십시오.분광광도계를 사용하여 활발하게 성장 중인 박테리아 현탁액의 OD600을 측정합니다. 그 다음, 0.1 OD600이 mL당 3 × 10⁷마리의 박테리아와 같다는 환산 계수를 사용하여 박테리아 밀도를 계산합니다. MOI 10:1에 해당하는 충분한 양의 박테리아를 피펫으로 취해 새로운 원심분리관에 넣습니다.그런 다음 박테리아를 3,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 박테리아를 옵소닌화하기 위해, RPMI 1640 450 µL에 사람 혈청 50 µL를 첨가하고, 이를 사용하여 박테리아 펠렛을 배지 500 µL당 1 × 10⁸ bacteria의 밀도로 재부유시킵니다. 혼합물을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 혈구계수기(hemocytometer)와 도립 현미경을 사용하여 THP1 세포 배양 밀도를 측정합니다. 그다음, 멸균 원심분리관에 세포를 넣고 37 °C에서 100 ×g로 10분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 1 × 10⁶ cells/mL 밀도가 되도록 완전 배지가 포함된 RPMI에 세포를 재부유시킵니다.PMA를 최종 농도가 40 nanograms per milliliter가 되도록 첨가하십시오. 이것이 분화 혼합액입니다. 옵소닌화된 M.tuberculosis와 THP1 분화 혼합액을 10:1의 MOI로 혼합하십시오.최종 혼합물을 96웰 화이트 평저 플레이트의 웰당 100 µL씩 분주합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항생제 효능을 결정하기 위한 육체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 배양액은 다양한 농도의 살균 항생제로 배양됩니다. 살균 효능은 레사주린(resazurin) 분석을 사용하여 생존 가능한 박테리아의 존재를 평가하여 측정됩니다.

국물 내 마이코박테리아에 대한 테스트 컴파운드의 효과 평가

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

c harcoal agar resazurin assay(CARA)는 복제, 비복제 또는 둘 다인 마이코박테리아에 대한 테스트 에이전트의 활성을 평가하기 위한 반정량, 중간 처리량 방법입니다.  CARA를 사용하면 시간 및 농도에 따른 활성을 신속하게 평가할 수 있으며 CFU(Colony Forming Unit) 분석을 통해 추적할 매개변수를 식별할 수 있습니다.

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

배우세요 루시퍼레이스 기반 고효율 스크리닝 시스템으로 인간 대식세포 내 Mycobacterium tuberculosis 생존율과 세포독성을 평가하는 방법입니다. 이 기법은 결핵 신약 개발에서 시간과 노동을 절약합니다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템

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