세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템

본 프로토콜의 전반적인 목표는 화합물이 인간 대식세포 내 M.tuberculosis의 생존에 미치는 영향에 대해 다차원적인 평가를 제공하는 것입니다. 이 방법은 루시페라아제(Luciferase) 기반의 효능 분석을 중심으로 합니다. 세포독성 및 MIC 분석과 결합하면 결핵 치료제 개발 과정에서 HIT 화합물의 수정에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.

본 방법의 주요 장점은 시간과 노동력을 절감할 수 있다는 것입니다. 이는 CFU(colony forming unit) 분석법을 루시퍼레이스(Luciferase) 기반 분석법으로 대체하는 것입니다. 일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 연구자는 자동화 대신 수동 피펫팅을 사용할 때 일관성을 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

일관된 피펫팅 기술이 매우 중요합니다. THP1 세포를 완전 배지가 포함된 RPMI에서 배양하십시오. 계대 배양 사이에는 배지 밀리리터당 0.2에서 100만 개의 세포 밀도를 유지하십시오.

분광광도계를 사용하여 활발하게 성장 중인 박테리아 현탁액의 OD600을 측정합니다. 그 다음, 0.1 OD600이 mL당 3 × 10⁷마리의 박테리아와 같다는 환산 계수를 사용하여 박테리아 밀도를 계산합니다. MOI 10:1에 해당하는 충분한 양의 박테리아를 피펫으로 취해 새로운 원심분리관에 넣습니다.

그런 다음 박테리아를 3,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 박테리아를 옵소닌화하기 위해, RPMI 1640 450 µL에 사람 혈청 50 µL를 첨가하고, 이를 사용하여 박테리아 펠렛을 배지 500 µL당 1 × 10⁸ bacteria의 밀도로 재부유시킵니다. 혼합물을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 혈구계수기(hemocytometer)와 도립 현미경을 사용하여 THP1 세포 배양 밀도를 측정합니다. 그다음, 멸균 원심분리관에 세포를 넣고 37 °C에서 100 ×g로 10분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 1 × 10⁶ cells/mL 밀도가 되도록 완전 배지가 포함된 RPMI에 세포를 재부유시킵니다.

PMA를 최종 농도가 40 nanograms per milliliter가 되도록 첨가하십시오. 이것이 분화 혼합액입니다. 옵소닌화된 M.tuberculosis와 THP1 분화 혼합액을 10:1의 MOI로 혼합하십시오.

최종 혼합물을 96웰 화이트 평저 플레이트의 웰당 100 µL씩 분주합니다. 그 다음 5% CO2가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 분화 및 감염을 위해 배양합니다. 다음 날, 100 µL의 RPMI를 사용하여 웰을 두 번 세척합니다.

그런 다음 원하는 농도로 희석한 화합물과 완전 배지가 포함된 RPMI를 첨가합니다. 플레이트를 3일 동안 배양합니다. 멀티채널 피펫을 사용할 때는 플런저를 천천히 그리고 일정하게 누르는 연습을 해야 하며, THP1 세포에 가해지는 자극을 최소화하기 위해 피펫 팁을 각 웰 내부의 항상 동일한 지점에 접촉시켜야 함을 유의하십시오.

배양 후, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 각 웰에 50 µL의 루시페레이스 분석 시약을 추가합니다. 그 다음 투명 접착 플레이트 씰러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 22 °C에서 5분 동안 배양한 후, 루미노미터를 사용하여 웰당 1초의 속도로 판독값을 얻습니다.

THP1 세포를 분화시키려면, 이 비디오의 앞부분에서 보여준 대로 분화 혼합물을 준비한 후, 세포가 담긴 투명한 96-well 플레이트의 각 웰에 분화 혼합물 100 µL를 분주합니다. 세포를 5% CO2가 공급되는 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 RPMI 1640을 사용하여 두 번 세척합니다.

RPMI incomplete에 희석한 화합물 100 µL를 웰에 첨가합니다. 그 다음, 세포를 3일 동안 배양합니다. PBS 100 mL에 MTT 0.5 g을 녹여 5 mg/mL 농도의 스톡 용액을 조제합니다.

그런 다음 용액을 여과 멸균합니다. 3일간의 배양 기간이 끝나기 2시간 30분 전에 각 세포 웰에 25 µL의 MTT 용액을 첨가하고 배양 기간을 완료합니다. 250 mL의 DMF를 250 mL의 탈이온수와 혼합하여 50% NN dimethylformamide 또는 DMF를 준비합니다.

MTT 추출 버퍼를 다음과 같이 준비합니다. 500 milliliter 병에 SDS 100 grams를 넣고 50%DMF 300 milliliters를 추가합니다. 낮은 열을 가하여 SDS를 용해시킵니다.

순수 아세트산을 10 milliliters와 1 molar 염산을 12.5 milliliters 첨가하십시오. 그 다음, 50%DMF를 사용하여 병의 500 milliliter 표시선까지 채우십시오. 처리 기간이 끝나면, 각 웰에 추출 버퍼 100 microliters를 첨가하십시오.

혼합물을 5% carbon dioxide가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 570 nm에서 흡광도를 측정하십시오. resazurin assay를 수행하려면, M.tuberculosis를 7H9 ADST에서 mid-log phase까지 배양하십시오.

배양액을 7H9 ADST로 희석하여 OD600을 0.01로 맞춥니다. 7H9 ADST를 사용하여 화합물을 테스트 농도의 2배가 되도록 희석합니다. 그리고 희석된 각 화합물 100 microliters를 투명한 96 well plate의 각 웰에 분주합니다.

희석된 박테리아 현탁액 100 µL를 각 웰에 분주합니다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37 °C로 5일 동안 배양합니다. resazurin 10 mg을 탈이온수 100 mL에 녹입니다.

그리고 용액을 필터 멸균합니다. 웰에 resazurin 용액 30 µL를 첨가합니다. 그런 다음 세포를 48시간 동안 배양합니다.

세균의 성장은 청색에서 분홍색으로의 색상 변화로 나타납니다. 텍스트 프로토콜에 따라 정량 분석을 수행하십시오. 이 산점도는 M.tuberculosis 및 THP1 세포에 다양한 농도의 rifampicin을 처리했을 때 상대 발광 단위로 측정된 원시 발광 데이터를 보여줍니다.

이 그래프는 처리되지 않은 웰(well)과 비교하여 처리된 웰의 발광량 및 감소율을 보여줍니다. Rifampicin은 0.1 micrograms per milliliter 농도에서 세포 내 M.tuberculosis로부터 발생하는 상대 발광 단위(RLUs)를 99.9% 감소시킬 수 있습니다. 이는 이전에 CFU로 측정하여 발표된 결과와 유사합니다.

이 그림에서는 MTT 분석에 사용된 G1-1H의 농도 증가에 따른 세포독성을 나타냈습니다. 10 $\mu\text{M}$ 및 3 $\mu\text{M}$ 농도는 $\text{IC}_{50}$ 컷오프보다 분명히 낮습니다. 이 그림은 다양한 농도의 항생제 apramycin이 M.tuberculosis의 resazurin 전환에 미치는 영향을 보여줍니다.

배지 내 MIC90은 2.5에서 5 µg/mL 사이였습니다. 이는 이전에 발표된 값인 1.5 µg/mL보다 약간 높은 수치입니다. 하지만 여전히 허용 범위 내에 있습니다.

여기에서 입증된 바와 같이, 배양 시간이 길어지는 모든 실험에서는 증발 현상이 중요하게 작용합니다. 따라서 결과의 불일치를 방지하기 위해 배양기 내 습도를 적절하게 유지하도록 주의해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 최소 4일 만에 신뢰할 수 있는 세포 내 데이터를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 THP1 세포를 조심스럽게 다루는 것이 중요하며, 자동화 장비 없이 수행하는 경우에는 피펫팅을 일관되게 해야 한다는 점을 기억하십시오. 본 절차 이후에는 고함량 스크리닝(high content screening)과 같은 다른 방법을 사용하여 히트 화합물이 정균성인지 또는 살균성인지 판단할 수 있습니다. 이 프로토콜은 개발 이후 결핵 치료제 발굴 분야의 연구자들이 인간 대식세포 내 MTB에 대한 화합물의 효능을 신속하게 평가할 수 있는 길을 열어주었습니다.

microbacterium tuberculosis를 다루는 것은 위험하다는 점을 잊지 마십시오. 이 미생물을 취급할 때는 주의 사항을 준수하고 적절한 장비를 사용하십시오.