가속된 동맥 경화의 토끼 모델: 장 골 동맥 풍선 상해의 방법 론 적 관점

이 실험 절차의 전체적인 목표는 토끼의 왼쪽 장골동맥 내피를 외과적으로 손상시키고 죽상경화성 식단을 제공함으로써 죽상경화성 플라그 형성을 유도하는 것입니다. 토끼에서의 단독 손상은 플라그 조성을 연구하기 위해 주로 대동맥에서 수행됩니다. 하지만 장골동맥은 인간의 관상동맥과 매우 유사하여 죽상경화성 플라그 모델링을 위한 매력적인 부위입니다.

토끼 장골동맥의 근육 함량 균일 병변, 안구 조직 인자 활성 및 일관된 혈관 크기는 모두 인간의 관상동맥과 유사합니다. 결과적으로, 이는 상업적으로 제조된 장치들을 형태측정학적 및 혈관조영술적 종점과 비교하여 평가할 수 있게 합니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 협력자인 Aurelien Frobert가 진행하겠습니다.

유리 구슬 멸균기 등을 사용하여 모든 수술 도구를 반드시 멸균하십시오. 다음으로, 두 개의 풍선 카테터 어셈블리를 준비하고 점검합니다. 각 어셈블리에 생리식염수를 채운 1 mL Luer lock 주사기를 연결한 후, 풍선 팽창 기전을 사용하여 내부에 이물질이 끼어 있는지 확인하십시오.

다음으로, 수술 플랫폼의 온도 조절 패드를 37 °C로 설정합니다. 그런 다음 토끼의 체중을 측정합니다. 이어서 buprenorphine을 투여하고, 5% isofluorane을 분당 5 L의 속도로 10~15분 동안 투여하여 토끼를 마취합니다.

이제 마취된 토끼를 수술대 위의 가열 패드 위에 놓습니다. 토끼의 체온과 호흡을 모니터링하고 심전도를 수집하기 위해 센서를 부착합니다. 다음으로, 4% isofluorane을 분당 2.5 liters로 공급하기 위해 페이스 마스크를 착용시킵니다.

그런 다음 구역 반사와 각막 반사 소실 여부를 테스트하여 적절한 마취 수준을 확인합니다. 전신적인 근육 긴장도 완화 또한 깊은 마취의 지표가 됩니다. 다음으로, 양쪽 눈에 아토닉 연고를 도포합니다.

다음으로, 동물용 털 깎이 기구를 사용하여 무릎 관절 바로 아래의 복측 부위 털을 제거합니다. 그다음, 떨어진 털을 제거하고 70% ethanol과 betadine을 번갈아 가며 세 번 문질러 노출된 피부를 세척한 뒤, 하지가 노출되도록 제외하고 동물에게 드레이프를 씌웁니다. 수술을 시작하기 위해 saphenous artery의 위치를 확인하고 1.5 centimeter 절개합니다.

그 다음, 작은 곡선 핀셋을 사용하여 복제정맥동맥(saphenous artery)의 일부를 조심스럽게 노출시킵니다. 이때 대퇴정맥이나 대퇴신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이 노출 과정 동안 동맥을 철저하게 세척하는 것이 매우 중요합니다.

다음으로, 복제정맥 동맥 아래에 두 개의 느슨한 결찰 루프를 배치하고 동맥의 원위단 근처에서 한 개의 결찰 루프를 묶습니다. 그런 다음 결찰 부위 위쪽의 동맥을 따라 미세 혈관 클램프를 배치하고 클램프를 닫아 혈류를 차단합니다. 즉시 파파베린 한 방울을 도포하여 동맥을 확장하고 혈관 경련을 방지합니다.

다음으로, 결찰사를 사용하여 복재정맥동맥을 들어 올리고 24게이지 바늘을 이용해 작은 동맥 절개창을 만듭니다. 그런 다음 절개된 플랩을 들어 올리고 정맥 픽(vein pick) 또는 가이드 바늘을 동맥의 내강 안으로 천천히 삽입합니다. 이제 동맥 색전 제거 카테터를 복재정맥동맥 내로 조심스럽게 삽입합니다.

파열이 발생하지 않도록 조심스럽게 다루십시오. 그런 다음 정맥 픽을 제거하고 동맥의 미세 혈관 클램프를 해제합니다. 손상을 유발하기 위해, 먼저 풍선 카테터를 세 번째 표시까지 전진시킵니다.

이렇게 하면 장골 분지(iliac bifurcation) 상단 약 2~5cm 지점에 위치하게 됩니다. 다음으로, 0.1 milliliters의 생리식염수로 풍선을 팽창시키십시오. 이제 카테터를 클립으로 고정하고, 조직에 손상을 주기 위해 회전시키면서 6 centimeters 뒤로 당기십시오.

풍선을 후퇴시킨 후, 공기를 뺍니다. 내피세포가 완전히 확장되도록 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 카테터를 제거하고, 출혈을 막기 위해 동맥 절개 부위 바로 윗부분의 결찰 루프를 즉시 묶습니다.

다음으로, 상처의 천공 부위 주변에 적절한 소독제를 도포하고 혈전들을 닦아냅니다. 마지막으로 피부 절개 부위를 봉합하고 포비돈-요오드 용액으로 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 두 번째 카테터를 사용하여 반대쪽 장골 동맥에 동일한 수술 절차를 반복합니다.

수술 후, 먼저 토끼의 옆면에 묻은 복부 연고를 닦아냅니다. 그다음 sulfadoxine과 trimethoprim을 투여합니다. 이후 헤딩 패드를 착용한 토끼를 깨끗한 회복 케이지로 옮기고 모니터링 패치와 클립을 부착합니다.

동물이 다시 스스로 일어서서 보행할 수 있게 되면 홈 케이지로 돌려보냅니다. 통증 관리를 위해 buprenorphine을 투여합니다. 이제 필요한 기간 동안 동물에게 atherogenic diet를 급여하기 시작합니다.

수술 후 2주 또는 4주가 지난 시점에서 초기 박막 아마(thin flax)를 수확하려면, 먼저 토끼를 마취한 후 심장 내 절개를 통해 안락사시킵니다. 다음으로 복부를 열어 후복막을 노출시킵니다. 그런 다음 대동맥을 따라 장골 분지점(iliac bifurcation)까지 추적하여 분지점 윗부분을 묶습니다.

주변 조직을 조심스럽게 제거하고 양측 장골동맥을 분리합니다. 이제 두 동맥을 모두 적출하여 얼음처럼 차가운 PBS에 담급니다. 그 상태에서 핀셋을 사용하여 혈전들을 제거하고 각 동맥을 46개의 분절로 나눕니다.

그 후 즉시 OCT 화합물이 포함된 몰드에 분절을 매몰시키고 액체 질소에서 조직을 급속 냉동시킨다. 조직을 -80 °C에서 보관하고, 이후 표준 방법론을 사용하여 5 µm 두께의 절편을 염색한다. 장골 동맥의 풍선 손상은 1시간 이내에 합병증 없이 성공적으로 수행되었다.

토끼들은 1시간 이내에 회복되었으며, 유의미한 체중 감소 없이 건강한 상태를 보였다. 수술 후 합병증은 발생하지 않았다. 또한, 4주간의 죽상경화성 식단 급여 후, 모든 토끼에서 고콜레스테롤혈증이 나타났다.

풍선 손상과 콜레스테롤 식단의 조합은 혈관벽의 구조적 변화를 유발하여 2주 만에 죽상경화성 플라크를 형성하게 했습니다. 동일한 동물에서 손상되지 않은 장골동맥과 풍선 손상된 장골동맥을 분리하여 비교하였습니다. 플라크는 지질 침윤뿐만 아니라 평활근 세포의 이동 및 증식으로 특징지어집니다.

손상된 혈관 내에서 플라크는 계속 성장하는 반면, 내강 크기는 계속해서 줄어듭니다. 이러한 결과적 변화는 4주 차에 매우 뚜렷하게 나타났습니다. 2주 및 4주 후 형태학적 정량 분석 결과, 내막-중막 두께의 증가, 플라크 면적의 증가, 내강 면적의 감소, 그리고 최종적으로 지질 축적의 증가가 확인되었습니다.

alpha smooth muscle actin 항체를 이용한 염색은 근육 액틴과 반응하여 혈관 평활근 세포를 식별합니다. 반면, more 11 단클론 항체 염색은 대식세포의 세포질을 나타냅니다. 이 두 염색을 통해 손상된 혈관의 죽상경화성 플라크 내로 평활근 세포와 대식세포가 어느 정도까지 증식했는지 확인할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 자동차 안전에 대해 충분히 이해하고, 토끼의 장골동맥에 인위적인 손상을 용이하게 유발할 수 있게 될 것입니다. 죽상경화성 식이요법과 함께 수행하는 이러한 손상은 장골동맥 내에 균일한 시간 경과에 따른 플라크 형성을 유도합니다.