마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

이 절차의 전반적인 목표는 간 급성기 반응 매개체에 반응하여 CRP 및 IL6와 같은 염증성 사이토카인의 발현과 분비를 연구하기 위해 기능적인 마우스 간세포를 성공적으로 분리하는 것입니다. 이 방법은 간세포의 기능과 만성 신장 질환에서 발견되는 지속적인 염증 환경에 대한 간 사이토카인의 기여도라는 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간 대사체학 및 염증뿐만 아니라 약물 반응에 대해 단순하고 빠르며 재현 가능한 분석을 위한 강력한 도구를 제공한다는 점입니다.

먼저, 간 관류 배지와 간 소화 배지를 37°C 항온수조에서 예열합니다. 여기에 표시된 것과 같이 관류 펌프를 설치합니다. 그런 다음 간 관류 배지를 사용하여 펌프의 튜빙 시스템을 조심스럽게 미리 채웁니다.

시스템 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 관류 절차를 위해 정위 현미경을 준비합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 공여자 마우스를 마취시킨 후, 마취된 동물을 흡수 패드 위에 놓습니다.

접착 테이프를 사용하여 마우스의 사지를 고정합니다. 다음으로, 마우스의 복부를 제모하고 소독합니다. 그런 다음 끝이 뭉툭하고 날카로운 외과용 가위를 사용하여 치골부터 간의 앞쪽 경계까지 복부 정중선을 따라 개복술을 시행합니다.

횡격막의 미측 위치에서 복벽의 양측을 절개합니다. 멸균 면봉을 사용하여 장을 오른쪽으로 조심스럽게 밀어 하대정맥(IVC)을 노출시킵니다. 끝이 날카로운 미세 수술 가위를 사용하여 간상횡격막을 가로질러 외측 절개를 가하고 흉강을 엽니다.

그 다음 5-0 수술용 실크를 사용하여 흉부 하대정맥(IVC)을 결찰합니다. 쉴드형 IV 카테터를 사용하여 신장 하부 하대정맥(IVC)에 캐뉼라를 삽입합니다. 관류 펌프를 연결하고 간 관류를 시작합니다.

정확하게 수행되었다면 간이 즉시 창백해지며 부풀어 오르기 시작해야 합니다. 다음으로, 미세 수술 가위를 사용하여 간문맥을 절단함으로써 혈액과 관류액이 적절히 배출되도록 합니다. 약 30 milliliters의 간 관류액으로 간을 관류한 후, 관류 펌프를 정지시킵니다.

간 소화 배지로 교체하고 펌프를 다시 작동시킵니다. 관류가 완료되면 캐뉼라를 제거합니다. 간의 중앙 부위를 조심스럽게 노출시키고 간엽을 연결하는 결합 조직의 위치를 확인합니다.

중앙 연결 섬유를 잡고 간을 고정하고 있는 모든 조직을 조심스럽게 박리합니다. 그런 다음 간을 부드럽게 제거합니다. 즉시 해당 장기를 15 mL의 간 소화 배지가 들어 있는 50 mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

세포 배양 후드 내에서 50 milliliter 폴리프로필렌 원추형 튜브에 들어있는 간을 멸균 조직 배양 접시로 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 간의 4개 엽을 부드럽게 찢어줍니다. 적절하게 수행되었다면, 간에서 간세포가 분리됨에 따라 소화 배지가 탁해져야 합니다.

25 mL 멸균 피펫 팁을 사용하여, 탁한 소화 배지를 70 µm 나일론 세포 스트레이너로 걸러 새로운 50 mL 폴리프로필렌 원심 분리관에 담아 소화되지 않은 조직 입자와 세포 파편을 제거합니다. 혼합 여과액을 4 °C에서 50 ×g로 2분 동안 원심 분리한 다음, 과잉 세포 파편이 포함된 상층액을 흡입하여 제거하고 25 mL의 차가운 1X William's Medium E를 사용하여 세포를 부드럽게 재부유시킵니다. 간세포의 여과 및 세척 과정을 3회 반복한 후, 상층액을 흡입하여 과잉 세포 파편을 제거합니다.

일차 간세포 해동 및 플레이팅 보충제가 포함된 따뜻한 1X William's Medium E 25 milliliters에 세포를 재부유시키고, 새로운 70 micrometer 나일론 세포 스트레이너를 통해 50 milliliter 원추형 튜브로 현탁액을 여과합니다. 세포 수를 측정한 후, 일차 간세포 해동 및 플레이팅 보충제가 포함된 William's Medium E 2 milliliters를 사용하여 콜라겐 코팅된 6웰 세포 배양 클러스터에 세포를 플레이팅합니다. 세포를 완전히 기아 상태로 만들기 위해 배지를 두 번 교체한 후, 무혈청 배지에서 대조군으로서의 PBS, 25 nanograms per milliliter의 FGF23, 100 micrograms per milliliter의 LPS 또는 50 nanograms per milliliter의 IL6로 세포를 처리합니다.

배양물을 24시간 동안 배양합니다. 제조사의 지침에 따라 스핀 컬럼 키트를 사용하여 RNA를 준비한 후, 분리된 RNA 200 nanograms를 PCR 튜브에 넣습니다. 그다음, endonuclease-free water 14 microliters와 역전사효소 4 microliters를 튜브에 추가합니다.

PCR 튜브를 써모사이클러에 넣고 다음 역전사 프로그램을 실행하여 cDNA를 생성합니다. 정량 PCR을 수행하려면, 얼음 위에서 튜브에 다음 QPCR 마스터 믹스 성분들을 혼합합니다. 마스터 믹스를 볼텍싱합니다.

그 다음 96-well 플레이트의 각 웰에 용액 9 µL씩을 분주합니다. 각 웰에 cDNA 1 µL를 조심스럽게 첨가하며, 샘플당 3개의 웰을 준비합니다. 마지막으로, 실시간 PCR 기기로 샘플을 분석하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.

분리 및 배양된 일차 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 면역세포화학 분석 결과, 분리된 간세포는 albumin뿐만 아니라 fibroblast growth factor receptor 4를 높게 발현하는 것으로 나타났습니다. 본 실험에서는 분리된 일차 간세포를 FGF23, LPS 또는 IL6로 24시간 동안 처리한 후, quantitative real-time PCR을 통해 CRP 및 IL6의 mRNA 수준을 분석하였습니다.

LPS, IL6 및 FGF23는 CRP와 IL6의 발현을 유의하게 증가시켰습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 분리된 일차 간세포의 세포 배양 상청액을 ELISA로 분석하여 CRP 수치를 측정하였습니다. QPCR 분석 결과에서 나타난 것처럼, LPS, IL6 및 FGF23 처리 시 PBS 처리 세포와 비교하여 세포 상청액 내 CRP 수치가 유의하게 증가하였습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 단 몇 시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 멸균 환경을 유지하는 것이 중요합니다. 일차 배양(primary culture)을 다루기 때문에, 최적의 결과를 얻기 위해서는 가능한 오염 위험을 최소화하는 것이 가장 중요합니다.

이 영상을 시청하고 나면, 간 사이토카인의 발현 및 분비와 같은 다양한 간세포 기능을 연구하기 위해 마우스 간세포를 성공적으로 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.