Name: 마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 다발성 경화증 EAE 마우스 모델에서 생체 발광 및 근적외선 영상을 활용한 시신경염과 뇌 염증의 실시간 정량 분석 방법을. 이 기술은 약물 효과 평가와 질병 진행 관찰에 탁월합니다.

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이 연구는 독일 연구 협회 (CRC1039 A3) 및 연구 자금 지원 프로그램 헤센, 중개 의학 및 약학 TMP 연구 센터의 주 &quot;Landesoffensive 주르 ENTWICKLUNG wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot;(LOEWE)과 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 지원 (EKFS), 연구 교육 그룹 중개 연구 혁신 - 제약 (TRIP).

SJL 1. EAE 유도 / J 마우스 <ol><li> 마우스 <ol><li> 11 주 된 여성 SJL / J 마우스를 사용하고이 약 7 일 동안 실험 방으로 길들 할 수 있습니다. 그룹 당 N = 10 마우스를 사용합니다. </li><li> 약물 효과의 평가를 위해 연속적으로 식수 통하거나 3 오일 면역화 후 (N = 그룹당 10)을 출발 음식 펠릿 통해 대조군 약물 위약을 투여. 질병의 피크 동안 우유 또는 3 % 설탕 물에 젖은 콘플레이크와 약물 또는 위약을 관리 할 수 ​​있습니다. </li></ol></li><li> 면역 물질 <ol><li> 완전한 프로 인트 보조제 (CFA, 열 사망 결핵균 H37 Ra)가 2 병 (5 μg의 각)와 에멀젼에 EAE 유도 키트 항원으로 구성된 (테오 단백질의 펩티드, PLP139-151, 1 ㎎ / ㎖ 에멀젼)를 사용하여 동결 건조 백일해 독소 (PTX). </li><li> 1X 인산염 완충 식염수에서 PTX (2 μg의 / ㎖) (PBS를 녹이고, 즉, &lt;/ EM&gt;에서) 같은 피펫 팁과 제거, 잘 혼합하고, 50 mL의 튜브에 PBS 1 ㎖에 추가하는 각 PTX 튜브에 PBS 1.5 mL를 넣어; 잘 섞다. </li></ol></li><li> 면제 <ol><li> 꼬리의 기부에,이 부분의 각 100 μL를 모두 PLP / CFA 피하 주입한다. 상단 뒤쪽이나 목의 피부에있는 면역 반응이 머리와 척수의 영상을 방해하기 때문에, 목에의 뒷면에 삽입하지 마십시오. </li><li> 접종 후 2 시간 및 24 시간의 초 - 당 두번 마우스 복강 PTX (IP) 100 μL, 상기 제 1 주입한다. </li><li> 제어 생쥐 들어 PLP없이 PLP없이 CFA (100 μL의 두 부분) 플러스 PTX 주입. </li></ol></li><li> 마우스 예방 접종 후 처리 <ol><li> 쥐에게 하루 7 매일 최대의 무게를 측정 한 다음 매일을 무게. 주 : 마우스 1 잃게 - EAE 동안 체중을 2g. 감소는 EAE의 발병을 표시합니다. </li><li> 7 일 협정 매일 임상 증상을 평가운동 기능의 명백한 변화를 0.5 점수 : 표준 점수 시스템에 보내고 (즉, 0 점수 없습니다 꼬리의 말단 마비 1 점수 : 전체 꼬리 마비를 1.5 점수 : 하나 또는 두 뒷다리의 가벼운 마비 2 점수 : 뒷 다리의 심한 마비, 점수 2.5 : 하나의 뒷 다리의 완전 마비; 골 3 : 두 뒷다리의 완전한 마비, 3.5 점수 :. 뒷다리 하나 앞 다리의 마비의 완전 마비는 3.5 이상의 점수에 대한 함께 쥐를 안락사 &gt; 12 시간. </li></ol></li><li> EAE 코스와 영상의 시간 <ol><li> 접종 후 12 - 마우스는 10 일째 주위 발생 점수&gt; 1에 도달하면,이 질병의 발병에 제 1 이미징을 수행한다. </li><li> 삼일 - 초기 증상이 후 1 ~ 2 일에 도달되며, 1 동안 지속됩니다 피크에서 두 번째 영상을 수행합니다. 참고 : 그 후, 쥐가 완전히 7 ~ 10 일 이내에 복구합니다. 간격 동안의 이미지는 여전히 혈관 누수를 표시 할 수 있습니다하지만 염증 지표는 음수가 될 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 발광 생물과 시신경염 및 뇌 염증의 근적외선 영상 <ol><li> 촬상 시스템의 설치 <ol><li> 생물 발광 근적외선 신호의 분석을 가능하게하는 장치와 생체 내 영상에 수행한다. </li><li> 모든 이미징 과정에서 2.5 %의 이소 플루 란 마취 - 2에서 쥐를 유지합니다. </li><li> 위치 하나 중간에 가스 공급 장치를 사용하여 장치에서 서로 옆에 두 개의 마우스. 중앙의 상부 척추를 놓습니다. </li><li> 약물 치료 효과의 평가가 쌍을 비교하기 위해, 동시에 두 개의 마우스, 그룹 당 하나를 사용하십시오. 이 생물 발광 이미징을위한 중요합니다. </li><li> 검은 천으로 예방 접종의 사이트를 보호하고 마우스 / 마우스의 정확한 위치를 평가하기 위해 사진과베이스 라인 이미지를 촬영합니다. 모든 이미지를 카메라에 6.5 cm의 거리를두고 B-초점을 사용합니다. </li></ol></li><li> 주입 및 생물 발광 염증 프로브 이미징 <ol><li> 생체 내 이미징 시스템 설정을 사용 : 8 비닝 에피 BLI는, 엠가 열려 필터링, 전 필터 블록, FSTOP 1, B = 6.5 cm, 광고 노출 (120)의 초점; 베이스 라인 이미지를 촬영. </li><li> 즉시 사용 가능한 화학 발광 시약 (40 ㎎ / ㎖)의 100 μL의 IP를 주입한다. 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다. </li><li> 생물 발광 이미지를 5, 10, 및 주입 후 15 분 캡처. 생물 발광 피크의 시간 경과 동물간에 다르다. 주 : 최대 5 발생합니다 - 주입 후 10 분; 15 분에서 감소는 더 이상 이미지가 필요하지 않습니다 나타냅니다. 때문에 서로 다른 시간의 과정에 약간의 편견을 제거하기 위해 제어 및 치료 그룹의 마우스 쌍을 사용합니다. </li><li> 실험에 관련된 설명을 입력합니다. 자동 팝업 대화 상자를 관찰; 이 마우스 변형, 성별, 시점, 프로브 주입, 그룹 등의 시간 등의 정보를 포함한다. 파일 모두 O를 저장북동 폴더; 그들은 시간 태그와 모든 설명을해야합니다. </li></ol></li><li> BBB 무결성을위한 근적외선 형광 나노 입자의 주입 및 이미징 <ol><li> B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. 페 길화 된 형광 나노 입자의 여기 / 발광 최대 값은 690분의 675 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 2의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라. </li><li> 꼬리 정맥을 통해 페 길화 된 형광 적외선 나노 입자의 70 μL 정맥 주사하고 쥐 3 시간과 위의 설정을 사용하여 주사 후 24 시간을 상상한다. 주사기를 채우기 전에 용액을 잘 섞는다. </li><li> 신호의 특이성을 평가하기 위해 필요하다 대조군 마우스에 0.9 % 염화 나트륨 주입한다. </li></ol></li><li> 주입 및 MMP 활성을위한 근 적외 형광 프로브의 이미징 <ol><li> 면도를하거나 머리를 털을 뽑다 및 유베이스 라인 이미지를 복용하기 전에 조심스럽게 일일 pper 척추 영역입니다. 피부가 손상되지 않아야합니다. </li><li> B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. MMP를 기동 프로브의 여기 / 발광 최대 값은 700분의 680 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 1의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라. </li><li> 이 마우스 (10)에 충분하게되도록 즉시 사용 가능한 용액 (1X PBS 20을 nmol / 1.5 mL)을 1.5 ㎖의 튜브에 200 μL의 PBS 1X에 추가; 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다. 참고 : 제공된 볼륨이 약간의 볼륨이 주사기 충전 및 주입시 손실을 고려하지 않습니다. </li><li> 촬상 전에 꼬리 정맥을 통해 24 시간 프로브 IV 150 μL를 주입한다. 신호의 특성을 평가하는 경우에만 대조군으로 PBS를 주입한다. </li><li> 주사 후 24 시간에서, 적어도 2 개의 파장, Ex640 / Em700 및 예 675 / E에 에피 FL 이미지를 가지고m720은 설정 (8 및 FSTOP 2 비닝 1의 노출, 초점 B) 위 설명했다. 주의 : 2 개의 파장의 사용이 비특이적 신호를 감산하여 스펙트럼 unmixing 허용한다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 <ol><li> 생물 발광 분석 (BLI) <ol><li> 를 열 수있는 소프트웨어를 두 번 클릭합니다. </li><li> 상단 메뉴 바에서 실험의 폴더의 디렉토리로 이동을 선택, 파일 브라우저 아이콘을 클릭; 이 테이블에있는 폴더의 모든 파일을 엽니 다. </li><li> 실험에 관련된 설명을 표시하는 열을 구성합니다. </li><li> 품질 관리의 경우, EAE 신호의 특이성을 확인 EAE 및 / 또는 순진한 마우스의 증상없이 비 응답자 마우스의 파일을 더블 클릭합니다. 참고 : 순진 마우스와 비 응답자 마우스에서 최소한의 신호에는 신호가 없어야합니다. <ol><li> 프로의 주입하기 전에 기본 이미지를 확인신호의 특이성을 추가 대조군으로서 각 마우스 일; 그것은 부정적인해야합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 선택하려면 첫 번째 EAE 마우스의 첫 번째 파일을 더블 클릭하고 생물 발광 강도 (LUT 바 범위) 및 현지화를 확인합니다. 모든 이미지를 하나씩 확인합니다. 각 마우스의 낮은 강도로 파일을 닫습니다 (즉, 각 마우스 2 3 중 이미지를 유지). </li><li> 이미지 조정 및 수출 <ol><li> 정량화 할 수있는 첫 번째 파일을 두 번 클릭합니다. 새 창 팝 업을 준수하십시오. &quot;옵션&quot;(상위 메뉴)에서 각 이미지에 표시 할 라벨을 사용자 정의 할 수 있습니다. </li><li> 오른쪽 도구 팔레트에서 이동 &quot;이미지 조정.&quot; 기본적으로 최소 및 최대 강도는 &quot;자동&quot;으로 설정하고 무지개 사색에 표시됩니다. 필요한 경우 설정을 변경하려면 &quot;사용 설명서&quot;를 선택합니다. 참고 : 예를 들어, 모든 내 보낸 이미지가 동일한 LUT 바 (동일 최소값과 최대 값)을 할 수 있습니다 쉽게 비교할 수 있습니다.최소값과 최대 값의 조정은 양적 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 이미지 내보내기를 선택 PNG, 디렉토리 및 이미지 이름을 클릭 </li></ol></li><li> 관심 지역의 정량 (ROI) <ol><li> 도구 팔레트에서 &quot;ROI&quot;도구로 이동합니다. 투자 수익 (ROI) 방법 (원형, 사각형, 자동차, 또는 자유 손)와 로아의 수를 선택합니다. ROI를 창 이미지 창 팝업 관찰한다. </li><li> 마우스를 사용하여, 크기와 위치를 조정한다. 자동 ROI 툴을 사용하는 경우 모든 이미지에 대해 동일한 투자 수익 (ROI) 임계 값을 사용합니다. ROI의 크기와 위치를 수동으로 (예를 들어, 원형의 ROI) 정의 된 경우 모든 이미지에 대해 동일한 영역을 사용합니다. </li><li> RO.I. 새 창 팝업을 위로 관찰 측정 &quot;을 클릭합니다. 열을 사용자 정의 (예를 들어, 파일 이름, 동물 번호, 그룹, 실험, 면적, 총 수, 평균 횟수, SD 수, 최소 및 최대 카운트, 면적, 시간 포인트, 프로브 주입 등)의 시간. 사용자 정의 된 설정을 저장합니다. 때 다시ADY 모든 (Ctrl + A)를 선택하고 복사하여 스프레드 시트에 표를 붙여 넣습니다. </li><li> 장소에 ROI를 가진 PNG로 이미지를 내 보냅니다. 저장 한 이미지 파일을 닫습니다. </li></ol></li><li> 정량하는 데 필요한 모든 이미지 파일 -이 절차를 반복합니다 (3.1.7 3.1.6 단계). 스프레드 시트에 모든 ROI의 정량화를 복사합니다. 참고 : 여기에, 결과 등 그룹, 시점, 정렬 할 수 있습니다 통계적으로 분석 하였다. 통계 분석에 대한 ROI를에 생물 발광 신호의 총 수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 형광 나노 입자의 근적외선 (NIR) 분석 <ol><li> 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다. 참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 시각 신호의 특이성을 평가하기 위해 예 / 엠 720분의 675 및 예 ​​/ 엠 700분의 640에서 촬영 한 이미지를 비교. </li><li> 정량 분석에 대한 예 / 엠 720분의 675에서 촬영 한 화상을 사용하여 (여기 최대 : 680 ㎚). 자동 ROI 도구가 이용 될 수있는 로아를 정의. 자동 ROI 임계 값을 조정하고 모든 이미지를 사용합니다. 로아의 전체 방사 효율을 정량화한다 (단계 3.1 참조). </li></ol></li><li> 단백질 분해 효소에 민감한 프로브의 근적외선 (NIR) 분석 <ol><li> 소프트웨어 제어를 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다. 참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. 자동 형광 스펙트럼 unmixing을 수행합니다. unmixing 도구는 이미지 생활에서 구현됩니다. 자동 unmixing은 자동 형광 이미지로 특정하고 720분의 675로 예 / 엠 700분의 640을 사용합니다. </li><li> 혼합되지 않은 이미지를 선택하고 상술 한 바와 같이 ROI를 정의합니다. 정량 및 통계 분석에 대한 ROI를 총 방사 효율을 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

본 동영상은 SJL / J 마우스의 EAE의 생체 내 이미징의 생물 발광 및 근적외선 형광을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 염증에 민감한 프로브를 사용하여 생물 발광 영상은 주로 시신경염를 표시하고 정량화가 EAE 심각도의 임상 평가 및 약물의 효과에 동의 것으로 나타났다. 신호가 척추에 의해 흡수되기 때문에, 생물 발광 촬상 방법 가능성 EAE 현시 (17)의 기본 위치 인 요추 척수 염증을 검출 할 수 없었다. 근적외선 영상은 더 민감하지만, 생물 발광이 발생하지 않는 자동 형광 높은 간섭의 비용. 빠르게 변화하는 신호 세기와 시계열 NIR 바람직한 방법을 만든다 - (5 분 2)에 비해 BLI - (2- S 1) NIR의 노광 시간은 매우 짧다. 와 중요한 단계프로토콜과 기술의 한계에 면역 위치의 신호는 EAE에서 ...

다발성 경화증은 뇌의 수초와 척수의 자가면역 매개 공격과 파괴에 의해 발생합니다1. 여성의 경우 연간 100,000명당 약 3.6명, 남성의 경우 약 2.0명의 다발성 경화증이 발생하는 다발성 경화증은 외상성 부상에 이어 젊은 성인에서 두 번째로 흔한 신경 장애의 원인입니다2,3. 질병 병리학은 유전적 및 환경적 요인에 의해 기여합니다4 그러나 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 자가반응성 T 림프구는 중추신경계로 들어가 뇌, 척수, 시신경의 백질에 국소 침투를 유발하는 염증 폭포를 유발합니다. 대부분의 경우 이러한 침투는 처음에는 되돌릴 수 있지만 재발 횟수에 따라 지속성이 증가합니다. 이 질병의 병리학을 연구하기 위해 많은 설치류 모델이 개발되었습니다. SJL/J 마우스의 재발-완화 EAE와 C57BL6 마우스의 1차-진행성 EAE가 가장 인기 있는 모델입니다.
운동 기능 결손의 정도를 설명하는 임상 EAE 점수와 체중은 EAE 중증도를 평가하기 위한 황금 표준입니다. 이러한 임상 징후는 척수에서 면역 세포 침투 및 미엘린 파괴 정도와 일치하며 인간에서 약물 치료 효능을 적당히 예측합니다5. 그러나 이러한 징후는 주로 척수에 있는 복부 섬유관의 파괴를 반영합니다. 현재로서는 살아있는 쥐의 생체 내 뇌 침윤 및 시신경염을 평가할 수 있는 쉽고, 비침습적이며, 신뢰할 수 있고, 재현 가능한 방법이 없습니다. 
생체 내 이미징은 동물 실험의 R배치, R유도 및 R정제를 주장하는 Russel과 Burch(1959)의 3가지 "R" 원칙과 일치합니다6, 이미징은 여러 시점에서 한 동물의 판독값을 증가시키고 전체 수를 줄일 수 있기 때문입니다. 현재 염증 또는 미엘린 상태는 주로 면역조직화학, FACS 분석 또는 다른 분자 생물학적 방법7을 통해 생체 외 평가되며, 모두 특정 시점에 안락사된 마우스를 필요로 합니다. 
피부, 관절 및 혈관계의 염증을 평가하기 위해 많은 생체 내 이미징 시스템 프로브가 개발되었습니다. 이 기술은 골수과산화효소(MPO), 기질 금속단백분해효소(MMP)8 및 cathepsins9 또는 cyclooxygenase2를 포함한 조직 과산화효소에 의한 생물 발광 또는 근적외선 형광 기질의 활성화에 의존합니다. 이러한 프로브는 주로 관절염 또는 죽상동맥경화증 모델에서 검증되었습니다9,10. cathepsin에 민감한 프로브는 EAE11의 형광 분자 단층 촬영 이미징에도 사용되었습니다. MMP, 특히 MMP2 및 MMP9는 EAE에서 프로테아제 매개 BBB 파괴에 기여하며 면역 세포 침투 부위에서 상향 조절12, 이는 이러한 프로브가 EAE 이미징에 유용할 수 있음을 시사합니다. peroxidase 또는 cathepsin 기반 프로브의 경우에도 마찬가지입니다. 기술적으로 뇌나 척수의 염증을 영상화하는 것은 두개골이나 척추가 생물 발광 및 근적외선 신호를 흡수하기 때문에 훨씬 더 어렵습니다. 
염증 지표 외에도 형광 화학 물질이 설명되었으며, 이는 수초에 특이적으로 결합하여 수초화의 정량화를 허용할 수 있습니다13. 근적외선 형광 프로브인 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide(DBT)는 수초화 섬유에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며 원발성 수초화 결함의 마우스 모델 및 cuprizone-유발 탈수초화14에서 정량적 도구로 검증되었습니다. EAE에서 DBT 신호는 수초 섬유의 염증을 반영하여 다소 증가5. 
EAE와 다발성 경화증의 또 다른 특징은 BBB가 파괴되어 혈관 투과성이 증가하고 혈액 세포, 세포 외액 및 거대 분자가 CNS 실질로 유출된다는 것입니다. 이는 부종, 염증, 희소돌기아교세포 손상으로 이어질 수 있으며, 결국에는 탈수초화15,16으로 이어질 수 있습니다. 따라서 일반적으로 혈액에서 조직으로 매우 천천히 분포하는 형광 표지된 소 혈청 알부민5와 같은 형광 프로브를 사용하여 BBB 누출을 시각화하면 EAE를 평가하는 데 유용할 수 있습니다.
본 연구에서는 EAE에서 다양한 프로브의 유용성을 평가하고 가장 신뢰할 수 있고 강력한 생물 발광 기술에 대한 절차를 보여줍니다. 또한 MMP 활성 및 BBB 무결성을 위한 근적외선 프로브의 장단점에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>이미징 프로브, 페길화 나노 입자, 혈액 뇌 장벽 무결성 이미징에 유용</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>이미징 프로브, 매트릭스 금속 단백 분해 효소에 의해 활성화 가능, 염증 이미징에 유용</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect 염증 프로브</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>이미징 프로브, 산화효소에 의해 활성화, 염증 이미징에 유용</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA 에멀젼&nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE 유도 키트</td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE 유도 키트</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>생물 발광 및 적외선 이미징 시스템</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 소프트웨어&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>CLS136334</td><td>IVIS 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>마취제</td></tr></tbody></table>

마우스의 다발성 경화증의 eae 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

SJL / J 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 재발 - 완화 성 다발성 경화증 (RRMS)의 모델이다. 운동 기능 적자를 설명하는 임상 EAE 점수는 척수의 면역 매개 염증의 기본 판독입니다. 그러나 점수와 체중은 뇌의 염증과 시신경염의 생체 내 평가를 허용하지 않습니다. 후자는 2/3 MS 환자에서 초기 자주 표현된다. 여기서는 생체 촬상 시스템을 이용하여 살아있는 쥐 생물 발광과 EAE는 시신경염을 유발 평가 근적외선 라이브 영상, 뇌 염증 및 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 중단하는 방법을 보여준다. 산화 효소에 의해 활성화 생물 발광 기판은 주로 시신경염 나타났다. 신호는 특정이었고, 임상 점수를 병렬 약물 효과 및 질병 시간 과정의 시각화를 허용했다. vasculatur 내에 남아 페 길화 된 형광 나노 입자장시간 E는 BBB의 무결성을 평가하기 위해 사용되었다. 근적외선 영상은 질병의 피크에서 BBB 누수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 신호는 눈 주위 강했다. 매트릭스 메탈 용 근적외선 기판 EAE - 유발 된 염증을 평가하기 위해 사용되었다. 자동 형광 정량 unmixing 스펙트럼을 요구 신호 간섭. 전반적으로, 생물 발광 이미징 EAE 관련 시신경염 약물 효과를 평가하기위한 신뢰성있는 방법이고 신호 특이성 견고성 정량의 용이성 및 비용면에서 근적외선 기술보다 우수 하였다.

시신경염의 생물 발광의 시간 코스 염증 프로브의 생물 발광 신호는 눈 주위 강한이었고 시신경염와 EAE 마우스에서만 일어났다. 신호는 비 EAE 마우스 나 염증 프로브를 주입하지 생쥐도 발생 하였다. 쥐를 복구 할 때 신호가 사라졌다. 따라서, 신호 시신경염 특정하고, 상기 신호의 피크 임상 EAE 스코어의 피크 평행. 그림 1은 EAE 유도 후 10 일 및 14 군데 SJL / J 마우스의 두 가지 예를 보여줍니다. 생물 발광 신호는 10 일에 최고이고 마우스 복구 시작했을 때 사라졌다. 임상 점수의 시간 과정은 생물 발광 신호 (예를-1) 또는 점수의 선행 (예-2) 감소의 실종과 일치. <p class="jove_content" fo:keeP-together.within 페이지 = &qu...

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

이 영상 기법의 전반적인 목표는 살아있는 생쥐의 다발성 경화증 EAE 모델에서 시신경염과 뇌 염증을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 EAE 및 다발성 경화증의 경과에 영향을 미치는 새로운 메커니즘과 같이 신경면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 EAE로 유도된 시신경염과 뇌 염증을 질병의 경과 전반에 걸쳐 살아있는 생쥐에서 관찰하고 정량화할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 약물 치료까지 확장되는데, 이는 EAE 점수로는 나타나지 않는 약물의 효과를 관찰할 수 있기 때문입니다. 이 절차에서는 PTX를 1x PBS에 2 µg/mL 농도로 녹인 후 잘 혼합합니다. 그런 다음, 짧은 시간 동안 이소플루란 마취를 실시한 상태에서 PLP/CFA 100 µL를 마우스 꼬리 기저부에 피하로 2회 주입합니다.목 뒷부분에 주입하지 마십시오. 상부 등이나 목 부위 피부에서 발생하는 면역 반응이 머리 및 척수의 영상 촬영을 방해하기 때문입니다. 면역화 1~2시간 후, 생쥐의 복강 내에 PTX 100 microliters를 주입하십시오. 그 후 면역화 24시간 뒤에 생쥐에게 PTX 100 microliters를 다시 주입하십시오.대조군 마우스의 경우, PLP가 포함되지 않은 CFA 100 µL를 꼬리 기부에 두 번 주입합니다. 면역 후 7일부터 표준 점수 체계에 따라 매일 임상 증상을 평가합니다. 면역 후 약 10~12일경에 마우스의 점수가 1점을 초과하면, 질병 발생 시점에 맞추어 1차 영상을 촬영합니다.그 다음, 초기 증상이 나타난 후 약 1~2일 뒤이자 1~3일 동안 지속되는 질병의 정점에서 두 번째 영상 촬영을 수행합니다. 이후 생쥐는 7~10일 이내에 완전히 회복될 것입니다. 해당 간격 동안의 영상 촬영에서는 여전히 혈관 누출이 관찰될 수 있으나, 염증 지표는 음성이어야 합니다.in vivo 이미징을 수행하려면 모든 이미징 절차 동안 마우스에게 2%~2.5% isoflurane 마취를 유지하십시오. 두 마리의 마우스를 장치 내에 서로 나란히 배치하고, 마우스의 상단 척추가 중앙에 오도록 위치시킵니다. 그다음, 면역화 부위를 검은색 천으로 가리십시오.이미지 캡처 소프트웨어를 실행하고 카메라를 초기화합니다. 그런 다음 마우스의 위치가 정확한지 확인하기 위해 기준 이미지를 촬영합니다. 이후 모든 이미지를 캡처할 때 카메라와 6.5 centimeter 거리를 유지하며 B 초점을 사용하십시오.그 후, 주사기에 채우기 전 40 mg/mL 농도의 즉시 사용 가능한 화학발광 시약을 혼합합니다. 그런 다음, 이를 마우스의 복강 내로 100 µL 주입하고, 주입 후 5분, 10분, 15분 시점에서 생체발광 영상을 촬영합니다. 이 과정에서 생체발광 분석 소프트웨어를 실행하십시오.상단 메뉴 바에서 파일 브라우저 아이콘을 클릭하십시오. 실험 폴더 디렉토리로 이동하여 파일을 열고, 실험과 관련된 설명이 표시되는 열을 구성하십시오. 품질 관리를 위해 EAE 증상이 없는 비응답자 마우스 또는 나이브 마우스의 파일을 클릭하여 EAE 신호의 특이성을 확인하십시오.신호의 특이성을 추가로 대조하기 위해, 각 마우스의 프로브 주입 전 기저 상태 이미지를 확인하며, 이는 음성으로 나타나야 합니다. 이미지를 선택하려면 첫 번째 EAE 마우스의 첫 번째 파일을 클릭하여 생체 발광 강도와 국소화 위치를 확인하십시오. 모든 이미지를 하나씩 확인하십시오.정량을 위해 각 마우스당 신호가 가장 강한 이미지를 사용하십시오. 이미지를 조정하고 내보내려면 정량할 첫 번째 파일을 더블 클릭하십시오. 새로 뜨는 창의 옵션(Options) 버튼 아래에서 각 화면에 표시될 라벨을 사용자 정의하십시오.오른쪽 도구 팔레트에서 이미지 조정(Image Adjustment)으로 이동합니다. 기본적으로 최소 및 최대 강도는 자동으로 설정되며 무지개색 의사색(pseudocolor)으로 표시됩니다. 필요한 경우 수동(Manual)을 선택하여 설정을 변경하십시오.다음으로 Image Export를 클릭하고, PNG와 디렉토리, 그리고 이미지 이름을 선택하십시오. 관심 영역(region of interest)의 정량을 위해서는 도구 팔레트의 ROI Tool로 이동하십시오. ROI 방법과 ROI 개수를 선택하십시오.이미지 창 내의 ROI 창에서 ROI의 크기와 위치를 조정하십시오. 자동 ROI 도구를 사용할 때는 모든 이미지에 대해 동일한 ROI 임계값을 사용하십시오. ROI 크기와 위치를 수동으로 정의하는 경우 모든 이미지에 대해 동일한 영역을 사용하십시오.그 후, Measure ROI를 클릭합니다. 새 팝업 창에서 실험 세부 정보의 열을 사용자 정의하고 저장합니다. 준비가 되면 전체 선택 후 표를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.그 후, ROI가 표시된 상태로 이미지를 PNG 파일로 내보냅니다. 그런 다음 이미지 파일을 저장하고 닫습니다. 다음은 EAE 유도 후 10일과 14일에 촬영한 두 마리의 SJL/J 마우스 예시입니다.눈 주변의 생물 발광 신호는 10일째에 가장 높았으며, 마우스가 회복되기 시작하면서 사라졌습니다. 여기의 막대 그래프는 10일째와 14일째의 생물 발광 신호 정량 분석 결과를 보여주며, 임상 EAE 점수는 여기에 표시되어 있습니다. 이 그림에서 각 그룹당 5마리 마우스의 생물 발광 이미지는 R-flurbiprofen을 투여한 마우스에서 시신경염이 감소한 약물 효과를 보여줍니다.ROI 내의 총 생체 발광 수치 정량화를 통해 유의미한 치료 효능이 확인되었습니다. 숙달되면 이 기술은 이미징할 마우스 수에 따라 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행할 때는 백색 마우스를 사용하고 EAE의 임상 경과를 면밀히 관찰하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에 척수 내 면역 세포 침윤과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 FACS 분석이나 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 영상을 시청한 후, 여러분은 생물발광 이미징을 이용하여 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염과 뇌 염증을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Medicine

의학

이 비디오는 EAE 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴를 평가하는 절차를 보여줍니다. 다양한 크기의 형광 염료를 역궤도로 주입하여 뇌의 혈관을 순환합니다. 작은 염료는 틈을 통해 뇌 조직으로 누출되는 반면, 큰 염료는 장벽 손상 정도와 상관관계가 있는 파괴가 심한 경우에만 들어갑니다.

EAE 마우스 모델에서 형광 염료를 사용한 혈액-뇌 장벽 파괴 결정

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

출처: Breid, S., et. al. alpha-synuclein fibrils의 말초 접종 후 형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물 발광 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물 발광 이미징을 보여주며, 활성화된 성상세포에서 루시페라제-루시페린 반응을 보여줍니다. 이 프로토콜은 성상세포 활성화의 비침습적 정량화를 가능하게 하여 CNS 염증 및 치료 효능에 대한 연구를 지원합니다.

형질전환 마우스의 신경염증에 대한 생물발광 이미징

출처 : 슈미츠, K.,  et al., 생쥐의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 이미징. J. Vis. 특급. (2017).이 비디오는 다음을 사용하여 시신경에서 실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE 유발 염증을 시각화하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 생물 발광 이미징. 여기에는 마우스 위치 지정, 시약 주입, 순차적 이미지 캡처를 포함하여 시간 경과에 따른 생물 발광의 변화를 모니터링하는 것이 포함됩니다.

EAE 마우스 모델의 생물 발광 이미징

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

학습하세요 다발성 경화증 EAE 마우스 모델에서 생체 발광 및 근적외선 영상을 활용한 시신경염과 뇌 염증의 실시간 정량 분석 방법을. 이 기술은 약물 효과 평가와 질병 진행 관찰에 탁월합니다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

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