Name: 자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 학습하세요 자석 구슬을 이용한 세포 표면 접착 리모델링 분석 방법을 통해 기계적 인장에 반응하는 생화학적 신호 경로를 연구하세요. 이 기술은 기계전도 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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CG는 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-13 JSV1-0008), (마리 퀴리 경력 통합 n˚8304162)에서 유럽 연합 (EU)의 지평선에서 유럽 연구위원회 (ERC)에서 보조금 지원 2020 연구와 혁신 프로그램 (ERC 시작 부여 n˚639300).

자석 구슬 1. 리간드 활용 주 : 리간드 결합은 2.8 μm의 직경 상자성 토실 활성화 된 비드를 사용하여 수행된다 (원액 농도 10 8 비드 / ㎖, 30 mg의 비드 / ㎖). 다음 프로토콜은 60mm 조직 배양 접시에서 80 % 컨 플루 언시로 성장 MRC-5 세포에 해당하는 약 2 × 105 세포의 샘플들에 기초한다. 따라서 다른 합류점에서 서로 다른 크기 또는 셀의 판을 사용하는 경우 구슬 및 시약의 볼륨을 조정합니다. 셀당 2 비드 있기 위하여 상자성 비드의 양을 사용한다. 따라서, 4 × 105 구슬은 60mm 플레이트 필요하다. <ol><li> 철저하게 적어도 30 초를 텍싱하여 원래 유리 병에 구슬을 재현 탁. 1.5 ML의 microcentrifuge 관 (4 × 106 비드에 대응하는) 재 부유 상자성 비드의 40 μL 분취. </li><li> 자기 separati에 튜브를 배치용액으로부터 자성 비드를 분리하기 위하여 스탠드. , 상층 액을 버리고 자기 분리 스탠드에서 튜브를 제거하고 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산 산도 7.4의 구슬을 재현 탁. <ol><li> 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산의 pH 7.4와 두 번 반복 세척 단계. </li></ol></li><li> 최종 세척 후, 1 mL의 0.1 M 나 - 인산염 pH가 7.4에서 구슬을 재현 탁. </li><li> 수확기 100 μg의 소 피브로넥틴 (FN) 또는 비드를 함유하는 1 ㎖의 0.1 M 나트륨 포스페이트 pH를 7.4으로 다른 세포 접착 수용체 리간드 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> FN 또는 음의 컨트롤에 대한 BSA, 폴리 D 라이신 또는 아포 트랜스페린과 다른 특정 리간드를 대체하여 이전 단계를 반복합니다. </li><li> 선택적으로, 겔 분석, 가교 효율 분석을위한 리간드 용액의 10 μL 나누어지는을 농축 램 믈리 샘플 버퍼의 적절한 볼륨과 혼합한다. </li><li> 회 전자에 37 ° C에서 12 ~ 24 시간 동안 리간드 함유 용액에 구슬을 품어. </li><li> 반응이 더 이상 10-20 초간, 초음파 처리 (39 W의 연속 전력)을 발생한 후 비드 응집체 나타나면. </li><li> 자기 분리 스탠드를 사용하여 구슬을 분리, 나머지 솔루션을 기음과 PBS 1 ㎖ / 0.2 % BSA의 pH가 7.6 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 회 전자에 1 시간 동안 품어. </li><li> 1 mL의 PBS / 0.2 % BSA의 pH를 7.6로 두 번 자석을 이용하여 구슬을 씻으십시오. 1 mL의 PBS에 재현 탁 비즈 / 0.2 % BSA의 pH가 7.6. </li><li> 초음파 처리 비즈 집계 이하 20 ~ 30 초 동안 표시합니다. </li><li> 선택적으로, 서양 얼룩에 의해 결합 효율을 분석하기 위해 10 μL 나누어지는을 제거 (농축 램 믈리 샘플 버퍼의 적절한 볼륨과 혼합). </li><li> 최대 1 개월 4 ° C에서 분석하거나 저장 비즈 셀로 이동합니다. </li><li> 선택적으로, 자석 구슬로 FN 가교를 분석 쿠마 블루와 SDS-PAGE 젤과 얼룩을 실행합니다. </li></ol> 지느러미에 부착 수용체에 결합 된 리간드 코팅 구슬에 인장 부대 2. 응용 프로그램세포의 표면 <ol><li> 적절한 성장 배지 60mm 조직 배양 접시에 부착 배양 세포는 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 (일반적 DMEM 4.5 g / L D- 글루코스는 10 % FCS로 보충). </li><li> 비 변성 비 이온 용해 완충액 (20 mM 트리스 염산 pH를 7.6, 150 mM의 NaCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 0.1 % NP-40) 및 냉각 마이크로 원심 튜브를 준비한다. </li><li> 1 mL의 PBS 섹션 1.10에 resuspend에서 리간드 - 코팅 된 비드 펠렛 / 0.2 % BSA의 pH가 7.6. 따뜻한 문화 매체와 소용돌이의 5 ㎖에 리간드 - 코팅 된 비드 용액 100 μL를 추가합니다. </li><li> 대기음 60mm 배양 접시에 중간 5 mL를 구슬로 보충 따뜻한 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 조건에서 20 분 (37 ℃, 5 % CO 2) 비드 침전물과 셀에 부착 할 수 있도록 부화. 이 구슬은 식균 작용에 의해 내면화 될 수 있기 때문에 20 분을 초과하지에 매우 중요합니다. </li><li> 선택적으로, 10 배 또는 20 배 OBJE을 사용하여 광학 현미경 하에서 비드를 관찰이 뽑은 약간 부착 떠있는 구슬을 구별 할 수있는 요리를 흔들어 비드 부착을 확인합니다. </li><li> 인큐베이터에서 배양 접시를 유지하면서 상면에 부착 된 원형 38mm 네오디뮴 자석 덮개에 대한 일반 접시 뚜껑 교체. 자석은 상기 덮개의 하부면에 위치하는 두 개의 작은 13mm 네오디뮴 자석에 의해 제자리에 유지된다. 자석은 매우 강력하기 때문에, 신중하게 조작 할 수 있습니다. </li><li> 세포 배양 조건에서 원하는 시점에 대한 장력 (37 ℃, 5 % CO 2) 실시 세포를 인큐베이션. </li><li> 치료 후, 얼음에 접시를 놓고 조심스럽게 접시에서 전체 매체를 대기음. </li><li> 세포 용해 완충액 300 μL를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 미리 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 휴대 스크레이퍼 및 전송을 사용하여 해물를 수집합니다. </li><li> 자기 분리 스탠드를 이용하여 자성 비드를 펠릿 새로운 프리 진정 총 세포 용 해물을 전송할1.5 ML의 microcentrifuge 관 에드. 추가 분석을 위해 -20 ° C에서이 부분을 저장합니다. </li><li> 1 ML의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼로 구슬을 3 회 반복한다. 비드 펠렛 50 μL 램 믈리 시료 완충액 추가 건조 히터 블록을 사용하여 5 분 동안 95 ℃에서 비등 피펫으로 혼합한다. 이 부분은 절연 접착 단지가 포함되어 있습니다. -20 ° C에서 생화학 분석이나 가게에 진행합니다. </li><li> 비즈 분리 (약 300 μL) 후의 전체 세포 용 해물에서 웨스턴 블롯 분석을위한 50 μL 나누어지는을 제거합니다. 주 : 단백질 - 단백질 상호 작용 연구 (면역, GST 풀다운 분석) 또는는 GTPase 활성 실험으로서 상기 생화학 적 연구에 사용될 수있는 남아 250 μL (용해 완충액 변화가 주목는 GTPase에 따라 필요할 수있다). </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기에 기재된 방법은 세포 표면 접착 수용체에 장력을 적용하고 그 이후의 정제를 허용하는 간단한 방법을 구성한다. 그러나 일부 단계는 대상 접착 수용체에 따라 효율적으로 접착 정화 및 잠재적 인 최적화를 수행 할 수 있습니다 수행하는 것이 중요하다. 우리는 사용자가 아래에 발생할 수있는 잠재적 인 문제를 제시한다. 우리는 2.8 μm의 직경 자성 비드를 사용하지만, 더 큰 비드는 4.5 μm의 직경을 사용할 수있다. 식균 작용은 30 ~ 60 분 배양시보다 신속하게 발생할 수있는 그 구슬 변위가 자기장 (34), (35)에 따라 제한 될 수 있도록 더 큰 구슬이 강한 접착력을 가지고 있기 때문에, 구슬의 직경은 2-5 μm의 제한되어야한다. 따라서, 짧은 시간에 배양 시간을 제한하고 적절한 비드 크기를 사용하는 것이 중요하다. 셀당 인큐베이션 비드의 수 (F)의 양에 영향...

후생 동물에서 기계적인 긴장은 증식, 분화 및 생존 1, 2 등 세포 프로세스의 무수의 조절을 통해 조직 개발 및 항상성을 지시합니다. 기계 긴장은 세포 외 기질에서 발생할 수 또는 부착 세포 샘플 세포 외 기질에 끌어과 긴장에 민감한 분자를 통해 강성을 프로브 액토 마이 오신의 수축성 기계를 통해 자신의 세포 외 환경을 생성 할 수 있습니다. 장력에 응답하여, mechanosensitive 접착 단백질은 복잡한 신호 캐스케이드를 트리거 형태 적 변화를 겪는다. 차례로,이 신호 전달 경로는 세포 외 환경에 세포의 행동을 조정 증식, 분화 및 생존을 포괄 mechanoresponse을 조율. 이러한 프로세스는 빠르게 메카의 루프에 다시 공급하는 (초 분) 단기 기간에 정착 될 수있다<html> mechanosensitive 구조를 수정하여 notransduction. 예를 들어, 인테그린 기반 유착의 Rho는 GTPase 매개 골격 리모델링 3, 4, 5 내지 장력에 응답하여 강화한다. 병행하여, 다른 신호 전달 경로는 결국 세포의 운명 (6) 영향을 미치는 유전 적 프로그램을 제어하는 시간 일 동안 활성화됩니다. 많은 연구가 세포 결정론 질병 발전 1, 2에 매트릭스 강성의 영향을 강조하는 반면, 접착 매개 mechanotransduction의 정확한 분자 메커니즘은 아직 어려운 남아있다. 다양한 방법은 유동 시스템, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) -tension 센서 (7)를 포함하여 세포 행동에 셀 생성 힘이나 외력의 영향을 연구하기 위해 개발되어왔다아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8 호환 기판 (9) 자기 핀셋, 광 핀셋 (10)과 원 자간 력 현미경 (AFM) 11. 여기에서 우리는 특정 접착 수용체에 적용되는 인장 힘에 반응 mechanotransduction 경로의 특성을 초상 자성 비드를 사용하여 프로토콜을 제시한다. 상자성 비드 자기장에 배치 될 때 가역적으로 자화 입자이다. 일단 특정 수용체에 대한 리간드로 코팅이 비드 외 힘 부여의 효과를 연구하기위한 강력한 도구를 제공한다. 이 방법은 여러 연구 3, 5, 12에 의해 검증 된 - (17)과 주로 부착 세포의 생화학 적 분석을 용이하게하는 이점을 제시한다. 생화학 분석 하였다 유사한 콜라겐 - 코팅 된 자성 비드를 이용하여, 초기 작업은 증가를보고긴장 5, 18, 19에 응답 단백질 티로신 인산화에서 RhoA 정품 인증. 후술하는 방법은 3 인테그린인가 장력으로부터 하류 신호 전달 경로의 특성을 피브로넥틴 (FN) 코팅 된 비드와 함께 사용되어왔다. 이 연구에서, Guilluy 등. 장력이 인테그린 접착 단지에 두 개의 구아닌 염기 교환 요인 (GEFs), larg의 및 GEF-H1의 모집을 통해에서 RhoA를 활성화 것으로 나타났다. 그 때문에, 다른 연구는 GEF-H1은 여기에 설명 된 방법론의 견고성을 보여주는, 다른 방법 (20), (21)를 사용하여 세포 생성 긴장에 대한 응답으로 접착 단지에 채용되는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 활성화는 세포 골격에서 RhoA 리모델링을 통해 접착력 강화를 촉진하기 위해 도시 하였다. 이 시스템은 또한 긴장 적용 t을 탐구하는 데 사용 된세포 / 세포 부착 수용체 O. 인테그린 관련 접착 단지 (12)과 유사하게 vinculin 모집의 증가를 유도 E-cadherin의의 세포 외 도메인으로 코팅 된 자성 비드 상 힘의 응용 프로그램입니다. 콜린스와 그의 동료들은 PECAM-1 인테그린 촉진에서 RhoA 활성화 13 긴장의 응용 프로그램을 관찰했다. 자석 구슬을 사용하여 또 다른 실험 방법은 격리 된 핵에 적용 긴장의 연구이다. nesprin-1 핵 엔벨로프 단백질에 대한 항체로 코팅 된 비드를 사용하여, 핵막 착물들은 동적 기계적 장력 (22)에 응답하여 조절되는 것을 보여 정제 하였다. 이러한 결과는 mechanotransduction 경로의 연구에서이 방법의 강력 함을 지원합니다. 흐름 또는 견인력 시스템은 일반적으로 세포 과정을 촉진하면서 또한, 자성 비드는 특히 수용체 리간드를 사용하여 세포 부착 수용체 타겟팅 (13), (15)에 대한 모노클로 날 항체. 이 방법의 또 다른 장점은 간단한 리간드 친 화성 정제 절차를 접착 복합체의 분리이다. 잘 세포에 대한 리간드 - 코팅 구슬의 추가가 부착 수용체를 결합하여 여러 가지 접착 단백질 (23)의 채용을 유도하는 것으로 알려져있다. 리간드 - 코팅 자석 구슬에 힘 또한 응용 프로그램 (24)는, 다양한 장력에 의존하는 신호 전달 경로 (4)을 매개 거대 플랫폼으로 이러한 접착 단지를 켭니다. 자석을 이용하여 비드 농축하여 세포 용해는 접착 플랫폼의 격리를 허용한다. 접착 복합체를 정제하는 데 사용하는 다른 방법이 이미 부착 세포에 사용되어왔다. 이들은 단백질 - 단백질 상호 작용을 보존하는 화학 가교 결합세제 및 전단 흐름 또는 초음파 20, 21, 25, 26, 27, 28에 의해 세포 용해 단계. 마지막 단계는 접착 성 복합체를 함유하는 생성 된 복부 원형질막의 집합이다. 이들 방법과는 달리, 자성 비드를 선택적으로 접착 수용체의 특정 패밀리를 표적으로하여 세포 부착 복합체 더 정제 레벨을 허용한다. 자성 비드가 이미 리간드 피복 된 마이크로 비드 (29), (30)에 부착 된 비 - 부착 세포 접착 복합체를 정제하는 데 사용되어왔다. 힘이 짧은 지속 시간 (분 초)에 적용되는 모방 생물 상황을 설명하는 방법. 따라서, 정제 접착 착체의 분자 구성 모두를 조사하기위한 강력한 도구를 제공하며하류 mechanosensitive-신호 전달 경로. 여기에서 우리는 접착 표면 단백질에 인장 힘을 적용하는 자석 구슬 사용에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 영구 네오디뮴 자석은 배양 접시 표면의 상단에 배치됩니다. 단일 2.8 ㎛의 자성 비드의 힘 상수 (30-40 PN) (31)가되도록, 자석의 자극면을 6 mm의 높이로 배치된다. 인장 자극 시간은 관심과 활성화의 시간 스케일의 분자에 따라 작업자에 의해 결정된다. 세포는 마지막으로 접착 단지는 자석을 사용하여 비즈 분리로 정제하고, 생화학 적 분석 처리, 용해된다. 이 프로토콜은 리간드 - 코팅 된 상자성 비드의 제조 방법 및 생화학 적 분석 하였다 자석 관통 장력의 적용을 포함한다. 또한, 우리는 인테그린 기반 ADH에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공esions 접착 리모델링을 유도 단백질의 티로신 인산화를 바꾼다.

<table><tbody><tr><td>네오디뮴 자석 (60mm 접시의 윗면에 있음)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>등급 N52 치수: 1 1/2" 직경 x 1/2" 두께</td></tr><tr><td>의 네오디뮴 자석(60mm 접시 하단)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>등급 N42 치수: 1/2" 지름 x 1/4" 두께의 검은 플라스틱 코팅&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>초파라마그네틱 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>소 혈장에서 추출한 Fibronectin</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>소 Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당, GlutaMAX 보충제, pyruvate&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>60*15mm 문화 접시</td><td>팔콘</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive 세포 표면 접착 착물 셀들은 주변의 기계적 특성을 감지 할 수있다. 최근의 연구는 접착 부위에 힘을 감지 분자 및 혈통 특정 유전자 발현을 조절하고 표현형 출력을 구동 힘에 의존하는 전사 인자를 모두 확인했다. 그러나, 생화학 적 경로에 기계적인 긴장을 변환 신호 네트워크는 애매 남아있다. 세포 표면 수용체에 적용된 기계적 장력에 종사하는 신호 전달 경로를 탐색하기 위해, 초상 자성 마이크로 비즈가 사용될 수있다. 여기서 우리는 세포 표면의 접착 단백질의 힘을 적용하는 자성 비드를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면, 리간드 피복 된 비드에 부착 된 접착 단지 자기 분리에 의해서도 힘 따라 다양한 생화학 적 방법에 의해 세포 내 신호 전달 경로, 또한 접착 리모델링을 조사 할 수있다. 이 프로토콜은 리간드 공동의 제조를 포함ated 초상 자성 구슬, 그리고 응용 프로그램이 생화학 적 분석 한 다음 인장 힘을 정의합니다. 또한, 우리는 인테그린 기반의 접착에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플이 부착 리모델링을 유발 단백질 티로신 인산화를 변경 제공합니다.

기술의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 리간드 결합 후, 자성 비드를 20 분 동안 세포를 배양 한 후 영구 자석은 시간의 다양한 시간 동안 30-40 PN의 인장력을 적용하기 위해 사용된다. 도 1b는 MRC5 세포 부착 수용체에 결합 2.8 μm의 FN 코팅 된 자성 비드를 나타낸다. 세포 용해 후의 초상 자성 비드의 세정 단계는 매우 중요 및 정제의 정도를 결정한다. 세 세척의 최소 권장합니다. 장시간 노출과 GADPH의 면역 블롯은 접착 단지의 순도 (그림 2a)을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다. FN 코팅 비드 장력에 응답하여 접착 복합체에서 시간이 지남에 따라 발생하는 mechanotransduction 프로세스를 조사 하였다. 접착 복잡한 분획 자기 분리 한 후, 파쇄물 및 밀착성 복잡한...

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

이 실험의 전반적인 목표는 리간드가 코팅된 자기 마이크로비드와 접착 수용체에 가해지는 강제적인 힘을 이용하여, 장력에 반응하여 활성화되는 생화학적 경로를 탐구하는 것입니다. 이 방법은 기계적 전사(mechanic transaction) 분야에서 외부 헬로메트릭스(helometrics)의 기계적 장력이 어떻게 세포 분화를 유도하는지, 또는 조직 순응도가 어떻게 세포 변형을 일으키는지와 같은 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비드를 사용하여 접착 수용체의 특정 하위 집합에 장력을 가함으로써, 화학적 분석을 위해 많은 세포를 동시에 자극할 수 있다는 점입니다.먼저, 초상자성 토실 활성화 비즈(super paramagnetic tosylactivated beads)를 원래 바이알에서 최소 30초 동안 볼텍싱하여 완전히 재현탁합니다. 재현탁된 초상자성 비즈 40 µL를 0.1 M 인산나트륨(pH 7.4) 1 mL가 들어 있는 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 분주합니다. 그다음, 튜브를 자성 분리대(magnetic separation stand)에 올려 용액으로부터 자성 비즈를 분리합니다.상청액을 버리고 자석 분리대에서 튜브를 제거합니다. 1 mL의 0.1 M sodium phosphate (pH 7.4)에 비드를 재부유시킵니다. 비드를 두 번 세척한 후, 동일한 버퍼 1 mL에 비드를 재부유시킵니다.그 다음, 100 µg의 bovine fibronectin 또는 다른 세포 부착 수용체 리간드를 비드에 추가하고 볼텍싱합니다. 음성 대조군을 위해 리간드를 BSA, poly-D-lysine 또는 apotransferrin으로 교체하여 이 단계를 반복합니다. 리간드가 포함된 용액과 함께 비드를 로터 위에서 37 °C로 12~24시간 동안 배양합니다.반응 후 비드 응집체가 나타나면 10~20초 이내로 초음파 처리하십시오. 다음으로, 자성 분리 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 남은 용액을 흡입하여 제거합니다. 그런 후 0.2% bovine serum albumen이 첨가된 PBS 용액 1 mL를 추가합니다.37°C의 로터에서 1시간 동안 배양합니다. 자석을 사용하여 0.2% bovine serum albumen이 첨가된 1mL의 PBS 용액으로 비드를 2회 세척합니다. 그 후, 동일한 버퍼 1mL에 다시 현탁합니다.응집체가 나타나면 비즈를 20~30초 이내로 초음파 처리하십시오. 이후 세

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

마그네틱 핀셋, 강력한 단일 분자 조작 기술은 생물학적 거대 분자에 (자기 토크 핀셋 칭했다 구성을 사용하여) 및 토크 (자기 핀셋을 자유롭게 선회 불리는 구성을 사용하여) 꼬임의 직접적인 측정을 위해 구성 될 수있다. 이러한 측정을 수행하기위한 지침은 DNA 및 관련 nucleo 단백질 필라멘트의 연구에 응용 프로그램을 포함하여 제공됩니다.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

TGT 표면은 성장 인자 - 인테그린 누화를 연구하는 혁신적인 플랫폼입니다. 유연한 프로브 설계, 부착 리간드의 특이성, 자극 조건의 정밀한 조절은 EGFR-인테그린 인터플레이의 강력한 정량적 평가를 가능하게 한다. 결과는 EGFR을 '메카노-조직자' 튜닝 인테그린 역학으로 강조하여 초점 접착 어셈블리 및 세포 확산에 영향을 미칩니다.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

학습하세요 자석 구슬을 이용한 세포 표면 접착 리모델링 분석 방법을 통해 기계적 인장에 반응하는 생화학적 신호 경로를 연구하세요. 이 기술은 기계전도 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

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