자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석
2017년 3월 8일
이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.
이 실험의 전반적인 목표는 리간드가 코팅된 자기 마이크로비드를 사용하여 장력에 반응하여 활성화되는 생화학적 경로를 탐색하고 접착 수용체에 강제로 적용하는 것입니다. 이 방법은 특급 헬로메트릭스의 기계적 장력이 어떻게 차별화를 유도하는지 또는 조직 규정 준수가 어떻게 변형을 주도하는지와 같은 기계 거래 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 접착 수용체의 특정 하위 집합에 장력을 가하기 위해 비드를 사용하여 화학 분석을 위해 많은 세포를 자극할 수 있다는 것입니다.
시작하려면 최소 30초 동안 와류를 사용하여 원래 바이알에 있는 슈퍼 상자성 토실활성화 비드를 완전히 재현탁합니다. 40마이크로리터의 재현유된 초상자성 비드를 1밀리리터, 0.1몰, pH 7.4의 인산나트륨을 포함하는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 다음으로, 튜브를 자기 분리 스탠드에 올려 놓고 용액에서 자기 비드를 분리합니다.
상등액을 버리고 자기 분리 스탠드에서 튜브를 제거합니다. 비드를 1 밀리리터, 0.1 몰, 인산 나트륨, pH 7.4에 재현탁합니다. 비드를 두 번 세척한 후 동일한 버퍼의 1ml에 비드를 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 100마이크로그램의 소 피브로넥틴 또는 기타 세포 접착 수용체 리간드를 비드와 와류에 결합합니다. 음성 대조군을 위해 리간드를 BSA, poly-D-lysine 또는 apotransferrin으로 교체하여 이 단계를 반복합니다. 리간드가 포함된 용액으로 비드를 로터에서 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 배양합니다.
반응이 발생한 후 비드 응집체가 나타나면 10-20초 이상 초음파 처리하지 마십시오. 다음으로, 자기 분리 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 나머지 용액을 흡인합니다. 그런 다음 0.2% 소 혈청 알부민이 보충된 PBS 용액 1ml를 추가합니다.
섭씨 37도의 로터에서 1시간 동안 배양합니다. 자석을 사용하여 0.2% 소 혈청 알부민이 보충된 PBS 용액 1ml로 비드를 두 번 세척합니다. 동일한 버퍼의 1 밀리리터에 다시 현탁시키기 전에.
응집체가 20-30초 이상 나타나지 않으면 비드를 초음파 처리합니다. 세포 분석을 진행하거나 비드를 섭씨 4도에서 최대 1개월 동안 보관합니다. 80% 포화도에 도달할 때까지 적절한 성장 배지에서 60ml 조직 배양 접시에 부착 세포를 배양합니다.
리간드 코팅 비드를 펠릿화한 후, 0.2% 소 혈청 알부민이 보충된 1ml의 PBS 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 100마이크로리터의 리간드 코팅된 비드 용액을 5ml의 따뜻한 배양 배지 및 와류에 추가합니다. 다음으로, 60ml 배양 접시에서 배지를 흡인하고 비드가 보충된 5ml의 따뜻한 성장 배지를 추가합니다.
세포 배양 조건에서 20분 동안 현탁액을 배양하여 비드가 침전되어 세포에 부착되도록 합니다. 20분을 초과하지 않는 것이 중요한데, 이는 구슬이 식세포작용에 의해 내재화될 수 있기 때문입니다. 다음으로, 10X 또는 20X 대물렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 비드를 관찰합니다.
부착된 비드와 떠 있는 비드를 구별하기 위해 접시를 약간 흔들어 비드 접착력을 확인합니다. 원형 38mm 네오디뮴 자석을 일반 60mm 배양 접시 뚜껑의 윗면에 놓고 뚜껑 아래쪽에 위치한 두 개의 작은 13mm 네오디뮴 자석을 사용하여 제자리에 고정합니다. 원하는 시점과 세포 배양 조건에 대해 장력을 가한 세포를 배양합니다.
일반 접시 뚜껑을 자석이 있는 뚜껑으로 바꿉니다. 자석은 매우 강력하므로 조심스럽게 조작하십시오. 처리 후 접시를 얼음 위에 놓고 접시에서 전체 매체를 조심스럽게 흡인합니다.
300마이크로리터의 세포 용해 완충액을 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 용해물을 수집하고 미리 냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기 비드를 펠릿화하고 전체 셀 용해물을 미리 냉각된 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
웨스턴 블롯 분석을 위해 비드 분리 후 얻은 총 세포 용해물에서 15마이크로리터 분취액을 제거합니다. 1ml의 얼음 냉간 용해 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 50마이크로리터 샘플 버퍼를 비드 펠릿에 추가합니다.
볼텍싱으로 현탁액을 혼합한 후 드라이 블록 히터를 사용하여 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다. 이 분획은 분리된 접착 복합체를 포함합니다. 생화학 분석을 진행하거나 분획을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
이 그림은 접착 복합체의 정제를 보여주기 위해 표시됩니다. GAPDH 면역블로팅은 총 세포 용해물에 대한 로딩 제어로 사용되며 접착 복합체의 순도를 확인하는 데 사용됩니다. 정제된 접착 복합체 분획에서 세포질 신호의 부재를 검증하기 위해 장시간 노출이 사용되었습니다.
피브로넥틴 코팅 비드를 사용하여 장력에 대한 반응으로 접착 복합체에서 시간이 지남에 따라 발생하는 기계적 전달 과정을 조사했습니다. 접착 복합체 분획의 자기 분리 후, 용해물과 접착 복합 분획을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 기계적 장력에 대한 반응으로 접착 복합체에서 모집되거나 인산화되는 것으로 알려진 하중 제어 및 후보는 면역 블로트되었습니다.
장력은 접착 복합체에 대한 Paxillin 동원에 영향을 미치지 않았지만, 티로신 31에 대한 인산화는 총 세포 용해물과 접착 복합체 분획 모두에서 기계적 장력에 대한 반응으로 향상되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마그네틱 비드를 사용하여 접착 표면 단백질에 인장력을 가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 강력한 자석에 주의해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 웨스턴 블롯, 액틴 중합 분석 또는 효소 분석과 같은 생화학적 연구를 수행하여 키나아제 활성이 장력에 의해 조절되는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 세포의 자기에 민감한 신호 전달 경로를 탐색하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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개요
이 기사는 세포 표면 접착부에서 기계적 인장에 의해 활성화된 생화학 경로를 조사하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 리간드 코팅된 자기 마이크로비드를 사용하여 연구자들은 접착 수용체에 힘을 가할 수 있으며, 이를 통해 조직 항상성 및 발달에서의 기계전달 연구를 촉진합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 기계전달
- 세포 접착
- 생화학 신호 전달 경로
배경
- 세포 표면 접착은 기계전달에서 중요한 역할을 합니다.
- 기계적 인장은 조직 발달 및 항상성에 영향을 미칩니다.
- 이러한 경로를 이해하면 기계적 자극에 대한 세포 반응을 파악할 수 있습니다.
- 리간드 코팅된 자기 마이크로비드는 특정 접착 수용체에 통제된 인장을 가하는 방법을 제공합니다.
연구 목적
- 기계적 인장이 어떻게 생화학 경로를 활성화하는지 탐구합니다.
- 세포 분화에서 기계적 인장의 역할을 조사합니다.
- 조직 유연성이 세포 변형에 어떤 영향을 미치는지 이해합니다.
사용된 방법
- 초순자성 토실 활성화 비드의 재현탕.
- 비드를 인산 나트륨 용액으로 분주합니다.
- 자기 분리 스탠드를 사용하여 비드를 분리합니다.
- 분석을 위해 접착 수용체에 힘을 가합니다.
주요 결과
- 이 방법을 통해 생화학 분석을 위해 여러 세포를 자극할 수 있습니다.
- 특정 접착 수용체 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다.
- 기계전달 과정에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
- 조직 역학 및 세포 행동을 이해하는 데 있어 잠재적 응용이 가능합니다.
결론
- 이 프로토콜은 기계전달을 연구하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.
- 기계적 힘이 세포 과정에 어떻게 영향을 미치는지 이해를 촉진합니다.
- 미래 연구는 이러한 발견을 바탕으로 새로운 치료 전략을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Mechanical tension at cell surface adhesions drives signaling pathways that influence phenotypic outcomes and tissue development. Understanding these mechanotransduction mechanisms enables target validation in diseases where adhesion remodeling is implicated, such as fibrosis and cancer metastasis. This method supports preclinical de-risking by linking mechanical stimuli to biochemical readouts, improving predictive confidence in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates force-dependent signaling pathways at integrin-based adhesions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Enables isolation of adhesion complexes for biochemical analysis of phosphorylation events.
- Predictive Value: Supports target confidence by identifying tension-responsive nodes like phosphorylated Paxillin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares ligand-coated magnetic beads to apply defined tensile forces to specific receptor subsets.
- Operational Value: Standardizes force application across samples for reproducible adhesion remodeling readouts.
- Assay Readiness: Generates purified adhesion complexes compatible with western blotting and enzymatic assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects mechanical inputs to biochemical outputs in disease-relevant adhesion signaling.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether kinase activity or cytoskeletal dynamics are regulated by tension.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system to study how tissue compliance influences cellular transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, force-dependent biochemical data.
- Discovery Biology: Tests how mechanical tension directs cellular differentiation or transformation via adhesion receptor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, ligand-specific force application to prepare cells for downstream compound screening.
- Analytics: Enables western blot analysis of adhesion complex fractions to measure tyrosine phosphorylation and protein recruitment.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking tension-induced phosphorylation to phenotypic outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for applying controlled tension across multiple adhesion receptors and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mechanotransduction by isolating force-sensitive adhesion complexes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized bead preparation and magnetic separation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating targets under physiologically relevant mechanical conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on tension-dependent signaling fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, magnetic bead handling, and western blot techniques.
- Needs magnetic separation stands, neodymium magnets, and ligand coating capabilities.
- Demands standardization of bead ligand density and incubation times across experiments.
- Must account for phagocytosis risk by limiting bead-cell incubation to 20 minutes.
- Limited to surface adhesion receptors; cannot probe intracellular mechanosensors directly.
