된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

이 생화학 프로토콜의 전반적인 목표는 서로 다른 동위원소가 표지된 자매 히스톤을 포함하는 뉴클레오솜을 생성하는 것입니다. 이는 두 자매 히스톤의 번역 후 변형 반응을 동시에 매핑하는 데 사용됩니다. 이 생화학 프로토콜의 전반적인 목표는 두 자매 히스톤의 번역 후 변형을 동시에 매핑하는 데 사용할 수 있도록, 서로 다르게 동위원소가 표지된 자매 히스톤을 가진 뉴클레오솜을 생성하는 것입니다.

질량 분석법과 같은 번역 후 변형을 매핑하는 고해상도 기술과 결합된 이 방법은 대칭적으로 변형된 뉴클레오솜의 형성에 기여하는 메커니즘은 무엇인가와 같은 염색질 생물학의 핵심 질문들을 다룹니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 뉴클레오솜 재구성 프로토콜과 일반적인 단백질 정제 방법론을 결합하기 때문에 생화학 실험실에서 쉽게 구축할 수 있다는 점입니다. 옥타머 재구성을 위해 두 그룹의 히스톤 H3가 사용될 것입니다.

아미노 말단에 폴리히스티딘 태그(polyhistidine-tag)가 포함된 질소 15 표지 H3와, 아미노 말단에 스트렙타비딘 친화성 태그(streptavidin affinity tag)가 포함된 탄소 13 표지 H3를 준비합니다. 두 종류의 히스톤 H3를 포함하여 동결 건조된 히스톤 분주액을 언폴딩 버퍼(unfolding buffer)에 녹여 이 절차를 시작합니다. 약 5 mg의 히스톤이 들어 있는 각 튜브에 1 mL의 언폴딩 버퍼를 넣고 피펫팅으로 혼합하되, 볼텍싱(vortex)하지 마십시오.

완전한 언폴딩(unfolding)이 일어날 수 있도록 튜브를 30분 동안 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 각 히스톤의 정확한 농도를 결정하기 위해 280 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 두 종류의 히스톤 H3 풀(pool)을 각각 50%씩 포함하도록 유의하며, 코어 히스톤들을 동일한 몰 비율로 혼합합니다.

언폴딩 버퍼(unfolding buffer)를 사용하여 최종 단백질 농도가 약 1 mg/mL가 되도록 조정합니다. 혼합물을 6 kDa 컷오프 투석막으로 옮깁니다. 그리고 4 °C에서 1~2 L의 냉각된 리폴딩 버퍼(refolding buffer)를 사용하여 투석합니다.

다음 날, 투석된 물질을 수집하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 4°C에서 최대 속도로 5분간 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 옥타머 농도를 측정한 후, 10 kDa 컷오프 원심 필터 유닛을 사용하여 옥타머를 최종 부피 약 2mL가 되도록 농축합니다. 옥타머 농도는 50에서 100 µM 사이로 얻어야 합니다.

젤 여과 컬럼을 FPLC 시스템에 연결하여 젤 여과를 준비합니다. 0.22 µm 필터링 및 탈기 처리된 리폴딩 버퍼를 사용하여 컬럼 부피(CV)의 2배로 평형화합니다. 농축된 시료를 분당 1 mL의 유속으로 주입하고, 1~1.5 mL씩 분획하여 수집합니다.

이 절차를 시작하려면, 순수한 옥타머(octamer)가 포함된 해당 분획들을 모으고 앞서 설명한 방법으로 농도를 결정하십시오. 1 mL 니켈 니트릴로트라이아세틱산(nickel nitrilotriacetic acid) 또는 니켈 NTA 컬럼을 FPLC 시스템에 연결합니다. 그리고 1 mL/min의 유속으로 0.22 µm 필터링 및 탈기 처리된 리폴딩 버퍼(refolding buffer)를 10 CV만큼 흘려 평형화하십시오.

분당 1밀리리터의 유속으로 정제된 옥타머를 니켈 NTA에 통과시킨다. 통과액을 수집한다. 분당 1밀리리터의 유속으로 250밀리몰 이미다졸이 포함된 리폴딩 버퍼 10 CV를 사용하여 용리한다.

니켈 NTA 용출액을 수집합니다. 스트렙타비딘 기반 정제는 가급적 저온실에서 수행해야 합니다. 배치 중력 흐름 장치를 사용하여 250 millimolar 이미다졸이 포함된 리폴딩 버퍼 10 CV로 1 milliliter 용량의 상용 스트렙타비딘 친화성 컬럼을 평형화합니다.

니켈 NTA 용출액을 스트렙타비딘 친화성 컬럼에 통과시킵니다. 통과액을 수집합니다. 2.5 millimolar desthiobiotin이 포함된 리폴딩 버퍼 10 CV로 용출합니다.

용출액을 수집합니다. 용출액 내의 8량체 농도를 측정한 후, 10배 낮은 농도의 TEV protease를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날, 혼합물을 50 kilodalton 분획 분자량 컷오프 투석막으로 옮겨 4°C에서 refolding buffer로 하룻밤 동안 투석합니다.

10 kilodalton 컷오프 원심분리 필터 장치를 사용하여 정제된 비대칭 옥타머를 1~2 mL 부피로 농축합니다. 예상되는 옥타머 농도는 20~50 µM입니다. 뉴클레오솜 재구성을 위해서는 뉴클레오솜 위치 지정 서열이 포함된 DNA가 필요합니다.

5 M NaCl 스톡 용액을 사용하여 DNA의 염 농도를 2 M NaCl로 조정하십시오. 소규모 테스트에서 결정된 최적의 옥타머 대 DNA 비율을 사용하여 DNA와 옥타머 및 리폴딩 버퍼를 혼합하십시오. 2 M보다 낮은 염 농도에서 옥타머와 DNA가 혼합될 가능성을 방지하기 위해 옥타머를 가장 마지막에 첨가하십시오.

혼합물을 6 kDa 컷오프 투석막으로 옮기고 4°C에서 1L의 리폴딩 버퍼를 사용하여 하룻밤 동안 투석합니다. 다음 날, 투석 버퍼의 염 농도를 단계적으로 낮춥니다. 이때 각 염화나트륨 버퍼에 샘플을 최소 3시간 동안 유지합니다.

다음으로, 투석막을 1 L의 분석 버퍼가 담긴 비커로 옮기고 4 °C에서 하룻밤 동안 투석을 계속합니다. 다음 날, 투석된 시료를 수집합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리하여 형성된 침전물을 제거합니다.

30 kilodalton 컷오프 원심분리 필터 유닛을 사용하여 샘플을 최종 부피 약 300 microliters가 되도록 농축하십시오. 260 nanometers에서 DNA 농도를 측정하십시오. 최종 농도는 10 내지 20 micromolar 범위여야 합니다.

샘플을 4 °C에서 최대 수주 동안 보관하십시오. 리폴딩된 히스톤 혼합물의 젤 여과 용출 프로파일을 보면 히스톤 옥타머가 약 70 mL에서 용출됨을 알 수 있습니다. SDS page 젤은 정확한 히스톤 화학량론을 보여줍니다.

세 가지 유형의 옥타머(octamer)를 포함하는 재구성된 옥타머 풀을 탠덤 친화성 정제법(tandem affinity purification scheme)으로 처리합니다. 비대칭 종의 분리는 친화성 태그의 존재 여부로 확인합니다. 이후 TEV 프로테아제(protease)를 사용하여 친화성 태그를 제거합니다.

DNA와 옥타머(octamer)의 몰비를 다양하게 하여 소규모 뉴클레오솜 재구성을 수행한 결과, 1:1 비율이 최적임을 확인하였습니다. 최적화된 DNA 대 옥타머 몰비를 사용하여 대규모 뉴클레오솜 재구성을 수행하였으며, 4가지 핵심 히스톤의 정확한 화학 양론적 비율이 관찰되었습니다. 서로 다르게 동위원소 표지된 뉴클레오솜의 NMR 분광법 분석을 통해 질소 15($^{15}\text{N}$) 표지 및 탄소 13($^{13}\text{C}$) 표지된 자매 H3 히스톤의 존재를 확인하였습니다.

본 응용 사례에서는 히스톤 H3의 C 링 10번 위치에서 동위원소가 서로 다르게 표지되고 비대칭적으로 인산화된 뉴클레오솜을 GCN5 아세틸전이효소와 반응시켰습니다. 이후 두 H3 복제본 모두에서 히스톤 H3 리신 14번의 아세틸화를 NMR 분광법을 통해 실시간으로 추적하였습니다. 분석 결과, 히스톤 H3의 C 링 10번 인산화가 trans 방식에 비해 cis 방식에서 GCN5에 의한 히스톤 H3 리신 14번 아세틸화를 촉진한다는 사실이 밝혀졌습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 5일 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 서로 다른 특성을 가진 자매 히스톤을 포함하는 뉴클레오솜을 재구성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.