Name: 증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 384웰 플레이트에서 액체 오버레이 기법을 이용한 다세포 종양 회전 타원체 형성 방법입니다. 배양액 증발을 최소화하여 실험 재현성을 높이고 약물 스크리닝의 신뢰성을 개선하는 기술입니다.

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이 작품은 교육, 청소년, 체육 (LO1304)의 체코 교육부와 체코의 기술기구 (TE01020028)에서 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 환경 뚜껑의 정지 영상을 촬영 박사 락스 바라나에게 감사의 말씀을 전합니다.

아가로 오스 코팅 된 플레이트 1. 준비 <ol><li> 저 융점 아가로 오스 0.75 g을 달아 혈청없이 mL의 맥코이의 5A 매체의 (또는 페놀 레드없이) (100)에 추가합니다. 전자 레인지에서 솔루션을 가열 완전히 아가 로스를 용해마다 1-2 분 소용돌이 친다. 를 살균 할 수있는 솔루션을 압력솥. </li><li> [정보 70 ° C로 냉각시키고, 아가 멸균 층류 상자 진공 여과에 의하여 500 ㎖, 0.22 μm의 필터 최상부 통해 필터링. 한 번에 전체 솔루션을 사용하지 않는 경우 작은 볼륨으로 0.75 % 여과 아가로 오스 솔루션 (FAS)을 나누어지는. 추운 방 또는 최대 4 주 동안 4 ° C 냉장고에이 즉시 사용 아가로 오스 솔루션 무균를 저장합니다. </li><li> 흐름 상자에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 다음 70 % 에탄올 (EtOH로)와 함께 콤비 시약 디스펜서 및 주요 카세트에 플라스틱 - 금속 - 팁 분배 카세트와 작은 튜브를 연결합니다. </li><li> 사용하기 전에, FAS I의 저장 분취 가열<html> n은 전자 레인지가 녹아있다. 총리는 아가로 오스 솔루션 코트 384도, 조직 문화 (TC)와 분배 카세트 FAS의 15 μL와 마이크로 플레이트 &quot;특별한&quot;처리 한. 접시에 아가로 오스는 세포를 파종하기 전에 15 ~ 20 분 동안 냉각시킵니다. 추운 방에 4 ° C에서 멀리 직접 빛으로부터 폴리에틸렌 봉지에 싸여 무균 아가로 오스 - 코팅 된 플레이트를 저장합니다. 주 : 원액에서 아가 로스의 농도 변화를 방지하기 위해 0.75 % FAS 반복 가열을 피한다. 상술 된 조건 하에서 저장 될 때 아가 - 코팅 된 플레이트는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다. FAS는 판의 코팅 동안 가열을 필요로하지 않습니다. </li><li> 카세트 팁 및 튜브에 남아있는 아가로 오스를 제거하기 위해 70 ~ 80 ° C를 멸균 수로 프라이밍에 의해 분배 카세트를 청소합니다. </li></ol> 2. 세포 배양 및 MCTS 형성 <ol><li> 배양 인간 결장 암종 HCT116 세포, 전술 한 바와 같이아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8. </li><li> 아가로 코팅 된 384 웰 냉장에서 TC 마이크로 플레이트가 처리 필요한 수를 제거하고 15 분 동안 실온 (RT)로 평형화. </li><li> 70 % EtOH로 멸균 PBS와 표준 튜브 분배 카세트를 프라이밍에 의해 세포 파종의 콤비 시약 디스펜서를 준비합니다. 필요한 μL로 시딩 볼륨과 디스펜서 수동 설정 버튼을 이용하여 매체에 토출 속도를 조정한다. 주 : 전체 세포 시딩 공정은 무균 조건에서 층류 상자에서 수행된다. </li><li> 재조합 세포 분해 효소를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 부착 세포를 해리. 완전 성장 배지 50 μL에 웰 당 2.5 × 104 세포 / ml의 밀도로 시드 셀 무균 비이커에 세포 현탁액 재고 확인. 이상의 384 WP 시드 때 비이커의 바닥에 침강을 방지하기 위해 자기 교반기를 사용하여 세포를 교반한다. </li><li> 허용플레이트는 실온에서 30 분간 휴식 후 4 × g에서 15 분 동안 원심 분리한다. </li><li> 한편, 증착 환원성 환경 뚜껑을 가지고 짧은면에서 멸균 H 8ml의 2 O 5 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)로 채우기 5 ㎖ 피펫 (도 1A)를 사용하여 (좌우). 먼저, 서서히 상하로 피펫 팁을 스위핑 좌측 홈통으로 액체를 충전 4㎖를 분배. 오른쪽 골이 단계를 반복합니다. 참고 : 액체가 뚜껑의 중심에 병합 및 가스 교환 (그림 1A)에 대한 간격을 두지 않는 쪽 골짜기에 추가되었는지 확인합니다. 뚜껑의 외관 및 이후에 384- 웰 TC 플레이트의 외측에 웰 H의 H 2 O의 삼출 2 O 결과 과량 추가. </li><li> (그림 2A를 멸균 H 2 O와 384 웰 TC 플레이트의 액체 저장소를 채우고 액체로 채워진 환경 뚜껑 일반 판 뚜껑을 교체). </li><li> 95 % 습도, 5 % CO 2, 20 % O 2와 37 ° C 회전 배양기에서 플레이트를 배치하고, 세포를 4 일 동안 MCTSes으로 응집 할 수있다. 갑자기 떨어지는 습도 수준을 방지하기 위해, 후속하는 일이 너무 오래 동안 인큐베이터의 도어를 열지 않도록. </li></ol> 로봇 형 시스템을 사용하여 3. 중간 교환 <ol><li> MCTS 형성 다음날 4 일, 잘 자동화 마이크로 플레이트 워셔 디스펜서를 사용하여 당 사전 예열 매체의 30 μL를 추가합니다. MCTSes 추가 3 일간 성장하도록 허용합니다. 그들은 실험에 원하는 크기를 달성 할 때까지 정기적으로 3 일마다 배지를 교체합니다. </li><li> 각 웰로부터 매체의 볼륨을 정의 대기음 경험적 와셔 매니 폴드의 Z -height을 조정한다. 기음 30 웰 당 매체의 μL 신선한 사전 예열 매체의 30 μL로 교체합니다. 주 : 세탁기 매니 폴드 아래로 이동하는 분배 속도와 속도를 설정가장 낮은 속도로 우물에 우물에서 난류를 최소화합니다. </li></ol> MCTS 4. 높은 콘텐츠 이미징 및 반 자동화 된 이미지 분석 <ol><li> 이미지 4X 공기 목적을 이용한 고 함량 자동 촬상 시스템의 MCTS (NA 16). </li><li> 숫자와 간격은 Z -stacks 및 웰 당 전체 MCTS를 캡처 실험에서 원하는 픽셀 비닝을 조정 MS (11)의 노출 시간 및 4 × 4의 비닝을 설정한다. </li><li> 프로그래밍 언어로 작성된 사내 루틴을 사용하여 &quot;읽어&quot;에서 설명한 바와 같이, 이미지를 단계적으로 처리한다. 참고 :하는 .m 코드와 .txt 인 추가 정보 파일은 보조 코드 파일 (그림 1B)로 사용할 수 있습니다. 루틴 측정 2D 이미지에서 MCTS 지역, 전공 및 부전공 축, 경계, 그리고 견고. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> 그림 1 :환경 뚜껑의 제조 및 반자동 루틴의 흐름도. 올바른 (왼쪽)과 초과 액체를 충전 (오른쪽) 양 (여기, 5 % DMSO) 가득 증발 감소 환경 뚜껑 (A) 이미지. 화살표는 액체를 추가 단측 통을 나타낸다. 별표는 DMSO의 정확한 양의 첨가 다음 뚜껑의 중앙의 간격을 나타낸다. (B)이 반 자동화 영상 분석 루틴에 포함 된 단계를 도시하는 플로. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li>
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<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids%3A+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).</li>
</ol>

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필터링 된 아가로 오스와 384 잘 TC 플레이트 코팅 LOT의 표준 관행 코트로 오스 및 / 또는 분배 장치를 필요로하는 플레이트, 아가 로스 겔 (6)의 가열을 방지하기 위해 유지되어야을 1.5 % 저 융점 아가로 오스를 사용하는 것이다. 직경이 0.2 내지 0.4 mm에 이르기까지 작은 튜브 구멍 액체 분배 카세트를 사용하여 여러 판을 준비하는 동안 아가로 오스의 겔은 잠재적 인 문제이다. 이 분배 동안 추가 가열을 필요로하지 않기 때문에 분배 카세트 막힘의 잠재적 문제를 해결하기 위해, 0.75 %, FAS를 사용 하였다. 또한, 또한, 0.75 % FAS만큼 빠르게 필터링되지 않은 1.5 % 또는 0.75 % 아가 용액 겔화하지 않는 것을 관찰 하였다. 0.75 % FAS를 사용하여, 상기 분배 카세트를 막힘없이 코팅 전체 384- 웰 TC 플레이트를 35 미만의 걸린다. 카세트는 잔차를 제거하기 위해 온수로 프라이밍하여 끝에 세...

종양에서의 암 세포는 생리 학적으로 외 매트릭스와 세포의 상호 작용에 의해 둘러싸인 복잡한 3 차원 (3D) 구조로 배열된다. 거의 모든 조직에서의 세포는 3 차원 환경에 상주 종양 특성을 모방 관내 종양 모델에서 더 많은 생리 학적 관련성에 대한 필요성은 여러 차원 배양 기술 1, 2, 3의 발전을 가져왔다. 이 모델은 현재 3D 2의 치료제로의 전이 및 세포 반응에 종양 미세 환경의 역할을 연구 기초 연구 도구가되고있다. 또한, 2 차원 (2D) 세포 배양 4에 비해, 3D 모델 세포 신호 전달 경로에 영향을 종양 기질 상호 작용의 더 나은 이해를 위해 허용한다. 암세포의 다세포 종양 타원체 (MCTSes)는 자주 차원 셀 (C)에 사용되는생체 내 종양에 상대 친밀감으로 인해 ulture 모델. 사용하는 여러 방법 중에서, 아가 - 코팅 된 플레이트에 MCTS 발생의 액체 오버레이 기술 (LOT)의 리드 최적화 목표 검증 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11에 대한 상당한 관심을 받고있다. 이것은 LOT 6, 7을 사용 MCTS 배양 화합물 라이브러리의 파일럿 화면을 실행할 수 있었다 성공적으로 최근의 연구로부터 명백하다. 그러나, 매체의 증발에 의한 불균일 손실 MCTS의 형태와 성장에 잘 - 투 - 잘 변화는 미세 적정 플레이트를 사용하여 LOT (의원)을 함께 일반적인 장애물이다. 결과적으로, 불균일 MCTSes의 형성 의미 관련성 타협약리학 적 검정 8, 12, 13에서의 데이터. 분배 유닛 자동 액체를 사용하는 경우 재현성 문제 이외에, LOT 계 고 처리량 분석에 영향을 미치는 또 다른 실질적인 문제는 의원 코팅은 아가 로스이다. 분배 유닛은 아가로 오스 겔을 방지하기 위해 가열 유지 될 수 있지만, 분배 카세트 배관의 막힘 로봇 시스템 (6)에 대한 잠재적 관심사이다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 최근에 MCTS 문화 (8)의 LOT에 약간의 수정을 고안했다. 이러한 변형은 주로 흔히 높은 처리량 스크리닝 실험실에서 발견되는 장비를 이용하여 MP들에서 요철 매체 손실을 방지 할 수있는 방법에 기초한다. 3 걸쳐 균일 한 크기와 재현 MCTSes의 생성에 대한 수정 LOT의 자세한 절차84 웰 플레이트 (WPS)가 여기에 표시됩니다. 원고은 특히 단면적의 측정에 대한 명확히 한정된 경계를 갖고 있지 않은 부분적으로 분해 된 약물 처리 MCTSes에서 MCTS 크기의 평가 반자동 루틴을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9414</td><td>저융점</td></tr><tr><td>맥코이의 5A 미디엄</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>" 빠른" Filtermax 필터</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &mu; m, 500 mL</td></tr><tr><td>멀티드롭&트레이드; 콤비 시약 디스펜서&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>소형 튜브 디스펜싱 카세트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>메탈 팁&nbsp;</td></tr><tr><td>384웰 TC 플레이트&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>플레이트 유형- CellCarrier</td></tr><tr><td>표준 튜브 디스펜싱 카세트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime 환경 뚜껑</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>로터리 인큐베이터(SteriStore)</td> <td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>일련 번호: D00384</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 세탁기 디스펜서&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>미지정</td><td>모델: EL406&nbsp;</td></tr><tr><td>고함량 이미징 시스템 (CellVoyager)</td> <td>Yokogawa Electric Corporation</td><td>미지정</td><td>모델: CV7000</td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; 익스프레스 재조합 세포 해리 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Phenol red free</td></tr></tbody></table>

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

밀접 생체 조건에서 모방 종양 모델 잠재적 항암제의 스크리닝을위한 약물 발견 및 개발에서 점점 인기를 끌고있다. 다세포 종양 회전 타원체 (MCTSes)를 효과적으로 리드 최적화 및 목표 검증을위한 시험 관내 모델들이 우수하고, 고형 종양의 생리적 조건을 모방. MCTS 배양에 사용할 수있는 다양한 기술 가운데 아가 액체 오버레이 방법 MCTS 생성하기위한 가장 저렴한 방법이다. 그러나, 높은 처리량 스크리닝 액체 오버레이를 사용 MCTS 배양의 안정적인 전송은 아가로 마이크로 타이 터 플레이트 (MPS)의 코팅 우물 걸쳐 균일 MCTS 형성의 irreproducibility 포함한 많은 한계에 의해 손상 될 수있다. 의원 약물 전체 플레이트의 사용을 방지 판의 외부로부터 매체의 과도한 증발 인한 효과 가장자리 상당히 쉽다테스트합니다. 이 원고는 균일 한 MCTS 형성의 확장 성 및 재현성을 높일 수있는 액체 오버레이 기술에 대한 상세한 기술 향상된 기능을 제공합니다. 약물 치료가 발표 된 후 또한, MCTS의 평가에 대한 간단한, 반 자동 및 보편적으로 적용 할 수있는 소프트웨어 도구에 대한 자세한 내용은 있습니다.

특히 주변 우물에서 매체의 요철 손실은 작은 문화 볼륨이 의원에 자주 발생하는 문제입니다. 예를 잘 조절 온도 / 가습 시스템 및 증발 감소 의원과 접시 뚜껑 인큐베이터 실질적으로 개선 된 배양 조건은, 우물 8에서 매체의 상당한 손실을 줄일 수 있습니다. 상대 증발을 측정하기 위해 오렌지 G (OG)의 동일한 양을 각 웰에 첨가하고, 3 일 동안 OG 흡광도의 변화는 표준 회전 044 정규 환경 뚜껑 판에 기록 하였다. 플레이트 웰 플레이트 (도 2A)의 가장자리로부터의 거리에 기초하여 6 개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1-4에서 표준 인큐베이터 (그림 2B)에서 일반 뚜껑 접시에 시간이 지남에 OG의 흡광도에 큰 변화가 있었다. OG 흡광도의 변화로부터도했지만그룹 환경 뚜껑 / 회전 인큐베이터 조합 (그림 2C)에서 판 1 우물, 변...

마이크로 타이 터 플레이트에서 배지의 요철 손실 균일 다세포 타원체 종양 형성의 재현성에 영향을 미친다. 배양 조건을 개선하면 구형 형성의 재현성 및 액체 오버레이 기술을 사용하여 회전 타원체 기반 분석의 결과를 개선 상당한 매체 손실을 감소시킨다.

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

본 절차의 전반적인 목표는 384-웰 플레이트에서 액체 오버레이 기술을 사용하여 균일한 스페로이드 형성의 확장성과 재현성을 향상시키는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 플레이트에서 발생하는 과도한 배지 재작업을 줄여 스페로이드 형성의 재현성을 높인다는 점입니다. 본 연구실에서는 절지동물 스크리닝 테스트를 위한 3D 스페로이드 배양법을 개발하고 검증하였으며, 본 연구의 목적은 다세포 배양 플레이트에서 나타나는 에지 효과(edge effect)를 평가하는 것이었습니다.오늘은 연구실의 포스터인 Sona와 함께 실험 절차를 시연하겠습니다. 먼저 저융점 agarose 0.75 g을 정밀하게 측정하여 phenol red 포함 여부와 상관없이 serum이 없는 McCoy's 5a medium 100 mL에 넣습니다. 용액을 마이크로웨이브로 가열하며 1~2분마다 한 번씩 흔들어 agarose를 완전히 녹입니다.그런 다음 용액을 오토클레이브하여 멸균합니다. 오토클레이브한 아가로스가 약 70 °C로 식을 때까지 기다린 후, 층류 작업대(laminar flow box) 내에서 500 mL 0.22 µm bottle top filter로 여과합니다. 다음으로, 전체 용액을 한 번에 사용하지 않을 경우 소분하여 보관합니다.이 즉시 사용 가능한 아가로스 용액을 콜드룸 또는 4 °C 냉장고에 무균 상태로 최대 4주 동안 보관하십시오. 플로우 박스 내에서, 플라스틱 또는 금속 팁 디스펜싱 카세트를 콤비 시약 디스펜서에 장착하십시오. 튜브 무게추를 70 % 에탄올 용기에 넣은 다음 카세트를 프라이밍하십시오.그 다음, 튜브 가중치를 PBS가 담긴 용기로 옮기고 다시 프라이밍합니다. 다음으로, 보관된 여과된 아가로스 용액 분취액을 마이크로파 가열기로 가열하여 녹입니다. 분주 카세트를 아가로스 용액으로 프라이밍한 후, 384-웰 조직 배양 처리 마이크로 플레이트에 여과된 아가로스 용액 15 µL를 코팅하는 프로토콜을 시작합니다.비디오의 다음 섹션에서 설명하는 대로 세포를 파종하거나, 4°C에서 직사광선을 피해 보관하기 전에 플레이트의 아가로스를 15분에서 20분 동안 식힙니다. 마지막으로, 디스펜싱 카세트를 세척하려면 튜브 무게추를 70~80°C의 멸균수에 넣고 디스펜서의 프라임 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트 팁과 튜브에 남아 있는 아가로스가 모두 제거됩니다.다음의 세포 파종 과정은 층류 정화 작업대(laminar flow box) 내의 무균 상태에서 수행해야 합니다. 먼저, 필요한 수량의 agarose 코팅 384웰 조직 배양 처리 마이크로플레이트를 냉장 보관소에서 꺼내 15분 동안 실온에서 평형을 맞춥니다. 그동안 70% 에탄올과 멸균 PBS로 표준 튜브 디스펜싱 카세트를 프라이밍하여 세포 파종을 위한 콤비 시약 디스펜서를 준비합니다.다음으로, 디스펜서의 수동 설정 버튼을 사용하여 토출량을 필요한 µL로, 토출 속도를 중간(medium)으로 조정합니다. 재조합 세포 해리 효소를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 부착된 인간 대장암 HCT116 세포를 제거합니다. 멸균 비커에서 50 µL의 완전 성장 배지를 사용하여 웰당 밀도가 2.5 × 10⁴ cells/mL가 되도록 세포 현탁액 스톡을 만듭니다.두 개 이상의 384 웰 플레이트에 세포를 분주할 경우, 세포가 비커 바닥에 가라앉는 것을 방지하기 위해 마그네틱 스터러를 사용하십시오. 디스펜서를 사용하여 384 웰 플레이트의 각 웰에 2500 cells를 첨가합니다. 플레이트를 상온에서 30분 동안 방치합니다.그동안 증발 방지용 환경 마이크로플레이트 덮개를 준비하고, 5 mL 피펫을 사용하여 5% dimethylsulfoxide 4 mL를 왼쪽 사이드 트러프에 천천히 위아래로 훑으며 분주합니다. 오른쪽 사이드 트러프에도 동일한 과정을 반복합니다. 사이드 트러프에 추가한 액체가 덮개 중앙에서 서로 섞이지 않도록 하여 가스 교환을 위한 간격이 유지되도록 합니다.액체를 너무 많이 첨가하면 뚜껑 외부로 스며들어 결과적으로 384 조직 배양 플레이트의 외부 웰로 들어갈 수 있습니다. 30분이 경과한 후, 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 플레이트를 30분 동안 휴지시키면 세포가 웰 바닥에 완전히 가라앉아 서로 밀착되는데, 이는 웰당 단일 스페로이드를 형성하는 데 중요합니다.세포가 분주된 플레이트를 4 G에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 384 웰 조직 배양 플레이트의 액체 저장소에 멸균수를 채우고 일반 플레이트 뚜껑을 액체가 채워진 환경 유지용 뚜껑으로 교체합니다. 플레이트를 습도 95%, CO2 5%, 산소 20% 조건의 37 °C 회전 인큐베이터에 넣고, 세포가 다세포 종양 구상체(MCTS)로 응집될 때까지 4일 동안 배양합니다. 이후 며칠 동안은 습도가 갑자기 떨어지지 않도록 인큐베이터 문을 너무 오래 열어두지 않도록 주의하십시오.NCTS 형성 후 4일째에, 자동 마이크로플레이트 세척 분주기를 사용하여 각 웰에 미리 데워둔 배지 30 µL를 추가합니다. MCTS를 인큐베이터에 다시 넣고, 실험에 필요한 원하는 크기에 도달할 때까지 MCTS를 배양합니다. 3일마다 배지를 교체할 때, 세척 매니폴드의 Z 높이를 경험적으로 조정하고, 분주 속도 및 세척 매니폴드가 웰 내부로 내려가는 속도를 가장 낮은 속도로 설정하여 웰 내의 와류를 최소화합니다.웰당 30 µL의 배지를 흡입하여 제거하고, 이를 30 µL의 예열된 신선한 배지로 교체합니다. 그 후 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 수치구경이 16인 4배 공기 대물렌즈를 사용하여 고함량 자동 이미징 시스템으로 MCTSs를 촬영합니다.이미징 소프트웨어를 사용하여 노출 시간을 11 milliseconds로, 비닝(binning)을 4x4로 설정하십시오. 각 웰의 MCTS 전체를 캡처할 수 있도록 실험 목적에 맞게 z-stack의 수와 간격, 픽셀 비닝을 조정하십시오. 2D 이미지를 단계별로 처리하여 MCTS의 면적, 장축 및 단축, 둘레, 그리고 solidity를 측정하십시오.구체적인 지침은 함께 제공된 m-code 및 텍스트 read me 파일을 참조하십시오. 이 루틴의 잠재적 적용 가능성을 확인하기 위해, 7일 된 MCTS에 항암제인 Paclitaxel(PTX), Vincristine(VCR), Oxalyplatin(OXA), Doxyrubicin(DOX) 및 5-flurouracil(5-FU)을 세 가지 서로 다른 농도로 4일 동안 처리하였습니다. MCTS의 이미지가 여기에 표시되어 있습니다.대조군(CTLs)과 비교하여 약물 처리된 MCTS의 면적, 장축 및 단축, 둘레, 그리고 견고도를 결정하기 위해 이 이미지들을 분석하였습니다. 기하학적 부피를 계산하기 위해 장축과 단축을 사용하였습니다. 약물 처리 후 MCTS의 면적과 부피가 농도 의존적으로 감소하였습니다.0.01 µg/mL의 Vincrystine과 0.4 µg/mL의 Doxyrubicin 및 5-Fluorouracil은 MCTS 면적의 증가를 가져왔으나, 부피는 0.001 µg/mL의 Vincrystine 처리 후에만 유의하게 증가했습니다. MCTS 둘레는 MCTS 크기에 완전히 영향을 미친 Packlitaxel, Doxyrubicin 및 5-Fluorouracil의 최고 농도에서만 유의한 차이를 보였습니다. 0.25 µg/mL의 Packlitaxel, 0.06 µg/mL의 Vincrystine, 그리고 100 µg/mL의 Doxyrubicin 및 5-Fluorouracil 처리는 solidity의 유의한 감소를 초래하였으며, 이는 MCTS의 완전 또는 부분적인 붕괴를 나타냅니다.종합하면, 이러한 데이터는 잠재적인 항암제를 연구하는 데 있어 이 방법의 유용성을 입증합니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술은 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 모든 세포주가 특정 3D 배양 방법에 적합한 것은 아니며, 세포주마다 스페로이드의 모양, 크기, 조직학적 특성 및 성장 역학에서 차이를 보이는 스페로이드를 형성한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.저희가 개발한 자극 루틴을 통해 스페로이드의 크기를 효과적으로 평가할 수 있으며, 특히 단면적 측정을 위한 경계가 명확하지 않은, 약물 처리로 인해 부분적으로 붕괴된 스페로이드의 평가에 유용합니다. 이 영상을 시청하신 후에는, 여기서 제시된 수정 방법이 추가 장비나 소모품을 필요로 하지 않으며 귀하의 절지동물 스크리닝 실험실에서 일상적으로 구현될 수 있다는 점을 충분히 이해하시게 될 것입니다.

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

배우세요 384웰 플레이트에서 액체 오버레이 기법을 이용한 다세포 종양 회전 타원체 형성 방법입니다. 배양액 증발을 최소화하여 실험 재현성을 높이고 약물 스크리닝의 신뢰성을 개선하는 기술입니다.

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

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