증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

이 절차의 전반적인 목표는 384웰 플레이트에서 액체 오버레이 기술을 사용하여 균일한 스페로이드 형성의 확장성과 재현성을 개선하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 플레이트에서 과도한 매체 재작동을 줄여 스페로이드 형성의 재현성을 향상시킨다는 것입니다. 우리는 실험실에서 절지동물 선별 검사를 위한 3D 스페로이드 배양 방법을 개발하고 검증했으며, 우리의 연구는 다세포 배양 플레이트의 가장자리 효과가 무엇인지 평가하는 것이었습니다.

오늘은 실험실의 포스터인 Sona와 함께 절차를 시연해 보겠습니다. 이 절차를 시작하여 0 점 7 5g의 저 융점 아가로 오스의 가중치를 부여하고 페놀 레드 유무 및 혈청이없는 mccoy의 5a 배지 100 밀리리터에 첨가합니다. 용액을 전자 레인지로 가열하고 1-2 분마다 휘젓면 아가로 스가 완전히 녹습니다.

그런 다음 용액을 고압 멸균하여 살균합니다. 오토클레이브 아가로스를 섭씨 약 70도까지 냉각시킨 후 층류 상자에 있는 500ml 영점 2개 2마이크로미터 병 상단 필터를 통해 필터링합니다. 다음으로, 전체 용액을 한 번에 사용하지 않을 경우 부분 표본을 추출합니다.

바로 사용할 수 있는 이 아가로스 용액을 냉장실이나 섭씨 4도의 냉장고에 최대 4주 동안 무균으로 보관하십시오. 플로우 박스에서 작업하면서 콤비 시약 디스펜서에 플라스틱 또는 금속 팁 디스펜싱 카세트를 설치합니다. 튜빙 무게를 70% 에탄올 용기에 넣은 다음 카세트를 프라이밍합니다.

그런 다음 튜빙 무게를 PBS 용기로 옮기고 다시 프라이밍합니다. 다음으로, 저장된 여과된 아가로스 용액의 분취액을 전자레인지에 가열하여 녹입니다. 디스펜싱 카세트에 아가로스 용액을 프라임한 다음 384웰 조직 배양 처리된 마이크로 플레이트를 15마이크로리터의 여과된 아가로스 용액으로 코팅하는 프로토콜을 시작합니다.

플레이트의 아가로스를 15-20분 동안 식힌 후 비디오의 다음 섹션에 설명된 대로 세포를 파종하거나 직사광선을 피해 섭씨 4도에서 보관합니다. 마지막으로 디스펜싱 카세트를 청소하려면 튜브 무게를 섭씨 70-80도의 멸균수에 넣고 디스펜서의 프라임 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트 팁과 튜브에 남아 있는 아가로스가 제거됩니다.

다음 cell seeding 과정은 멸균 상태와 laminar flow box에서 수행해야 합니다. 먼저 냉장 보관에서 필요한 수의 아가로스 코팅된 384웰 조직 배양 처리된 마이크로플레이트를 제거하고 15분 동안 실온과 평형을 이룹니다. 그 동안, 70% 에탄올과 멸균 PBS가 함유된 표준 튜브 디스펜싱 카세트를 프라이밍하여 세포 관찰을 위한 콤비 시약 디스펜서를 준비합니다.

그런 다음 디스펜서의 수동 설정 버튼을 사용하여 보는 양을 필요한 마이크로리터로 조정하고 분배 속도를 중간으로 조정합니다. 재조합 세포 해리 효소를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 부착성 인간 결장직장암 HCT116 세포를 제거합니다. 멸균 비커에서 50 마이크로 리터의 완전한 성장 배지에서 웰 당 밀리리터 당 2.5 곱하기 10에서 4 번째 세포의 밀도로 세포가있는 세포 현탁액 스톡을 만듭니다.

하나 이상의 384웰 플레이트를 파종할 경우 자석 교반기를 사용하여 비커 바닥에 침전되는 것을 방지하십시오. 디스펜서를 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 2500개의 셀을 추가합니다. 접시를 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.

한편, 증발 감소 환경 마이크로플레이트 뚜껑을 가져다가 5ml 피펫을 사용하여 5% 디메틸설폭사이드 4ml를 왼쪽 홈통에 분배하고 천천히 위아래로 쓸어냅니다. 오른쪽 골짜기로 이 과정을 반복합니다. 측면 홈통에 추가된 액체가 뚜껑 중앙에서 합쳐지지 않고 가스 교환을 위한 틈이 남지 않도록 하십시오.

액체를 너무 많이 넣으면 뚜껑 외부로 스며들어 384 조직 배양 플레이트의 외부 웰로 들어갑니다. 30분이 지나면 현미경으로 세포를 검사합니다. 플레이트를 30분 동안 휴지시키면 세포가 웰 바닥에 완전히 정착하고 서로 가깝게 정착할 수 있으며, 이는 웰당 단일 스페로이드를 형성하는 데 중요합니다.

파종된 플레이트를 4회씩 15분 동안 원심분리 G.스핀 후 384 조직 배양 플레이트의 액체 저장고에 멸균수를 채우고 일반 플레이트 뚜껑을 액체로 채워진 환경 뚜껑으로 교체합니다. 습도 95%, CO2 5%, 산소 20%의 섭씨 37도의 회전식 인큐베이터에 플레이트를 놓고 세포가 4일 동안 다세포 종양 스페로이드 또는 MCTS로 응집되도록 합니다. 습도 수준이 갑자기 떨어지지 않도록 다음 날에는 인큐베이터 도어를 너무 오래 열지 마십시오.

NCTS 형성 후 4일차에 자동 마이크로플레이트 세척기 디스펜서를 사용하여 각 웰에 30마이크로리터의 예열된 배지를 추가합니다. MCTS를 인큐베이터에 다시 넣고 실험을 위한 원하는 크기에 도달할 때까지 MCTS가 자랄 때까지 기다립니다. 3일마다 매체를 교체하기 위해 와셔 매니폴드의 Z 높이를 경험적으로 조정하고 디스펜싱 속도와 세척 매니폴드가 웰로 이동하는 속도를 가장 낮은 속도로 설정하여 웰의 난류를 최소화합니다.

웰당 30마이크로리터의 배지를 흡입하고 30마이크로리터의 미리 예열된 배지로 교체합니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 개구수 16을 가진 4개의 X 공기 이물체를 사용하는 고함량 자동 이미징 시스템에서 MCTS를 이미지

이미징 소프트웨어를 사용하여 노출 시간을 11밀리초로 설정하고 비닝을 4x4로 설정합니다. 실험에서 각 웰에서 전체 MCTS를 캡처하기 위해 z-스택의 수와 간격 및 픽셀 비닝을 원하는 대로 조정합니다. 2D 이미지를 단계적으로 처리하여 MCTS 영역, 장축과 단축, 둘레 및 입체도를 측정합니다.

구체적인 지침은 함께 제공되는 m-code 및 text read me 파일을 참조하십시오. 이 루틴의 적용 가능성을 확인하기 위해 7일령 MCTS를 항암제인 파클리탁셀(Paclitaxel), PTX, 빈크리스틴(Vincristine), VCR, 옥살리플라틴(Oxalyplatin), OXA, 독시루비신(Doxyrubicin), DOX, 5가지 플루루라실(5-FU)을 4일 동안 3가지 농도로 투여했다. MCTS의 이미지가 여기에 나와 있습니다.

이러한 이미지를 분석하여 대조군, CTL과 비교하여 약물 처리된 MCTS의 면적, 주축 및 소축, 둘레 및 견고성을 확인했습니다. 장축과 단축은 기하학적 부피를 계산하는 데 사용되었습니다. 약물 처리 후 MCTS 면적 및 부피의 농도 의존적 감소가 있었다.

Vincrystine의 밀리리터당 0 포인트 1 마이크로 그램과 밀리리터 당 0 포인트 4 마이크로 그램 독시 루비신 및 5 Fluorouracil은 MCTS 면적의 증가를 초래했지만, 부피는 Vincrystine 밀리리터당 1 마이크로 그램 포인트 0 다음으로 크게 증가했습니다. MCTS 둘레는 packlitaxel, Doxyrubicin 및 Five Fleurouracil의 최고 농도에서만 유의한 차이를 보였으며, 이는 MCTS 크기에 완전히 영향을 미쳤습니다. Packlitaxel 및 Vincrystine을 0 점 2 밀리리터당 5 마이크로 그램 및 0 점 0 밀리리터 당 6 마이크로 그램, Doxyrubicin 및 5 Fleurouracil을 밀리리터 당 100 마이크로 그램으로 처리하면 고체도가 현저히 감소하여 MCTS가 완전히 부분적으로 분해되었음을 나타냅니다.

종합하면, 이러한 데이터는 잠재적인 항암제를 조사하는 데 이 방법의 유용성을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 모든 세포주가 특정 3D 배양 방법에 적합한 것은 아니며 다른 세포주가 스페로이드 모양, 크기, 조직학 및 성장 역학에서 차이를 보이는 스페로이드를 형성한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

우리가 개발한 자극 루틴을 통해 스페로이드 크기를 효과적으로 평가할 수 있으며, 특히 단면적 측정을 위해 명확하게 정의된 경계가 없는 부분적으로 분해된 약물 처리 스페로이드에서 그렇습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여기에 제시된 수정이 추가 장비나 소모품을 필요로 하지 않으며 절지동물 스크리닝 실험실에서 일상적으로 구현될 수 있다는 사실을 잘 이해하게 될 것입니다.