마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

이 방법의 전반적인 목표는 오픈 소스 플랫폼을 사용하여 자동화되고 사용자 독립적인 방식으로 쥐의 전체 근육 내 근섬유 정량을 신속하고 신뢰성 있게 안내하는 것입니다. 이 방법은 골격근의 노화, 질병 또는 외상으로 인한 결함에 관한 신경근 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 근섬유 집단을 신뢰성 있게 분석하고 근육 횡단면의 고품질 이미지를 생성하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.

충분히 해동한 후, Triton X가 첨가된 PBS(PBST)로 시료를 각각 10분과 5분 동안 총 2회 조심스럽게 세척합니다. 두 번째 세척 후, 절편을 2분 동안 자연 건조합니다. 그 다음, 소수성 펜을 사용하여 개별 횡단면의 둘레를 따라 원을 그립니다.

15분 동안 추가로 공기 건조한 후, goat serum이 첨가된 PBST로 상온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다. 다음으로 슬라이드를 세척하고 각 샘플에 적절한 1차 항체 칵테일을 첨가하여 빛이 차단된 상온에서 1시간 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 PBST로 10분 동안 한 번, 5분 동안 한 번 슬라이드를 세척합니다.

그 후, 빛이 차단된 상태에서 적절한 2차 항체 칵테일로 근육 절편을 1시간 동안 표지합니다. 시연된 바와 같이 슬라이드를 PBST로 2회 세척한 후, 슬라이드를 건조시키고 제조업체의 지침에 따라 DAPI 핵 염색 키트로 핵을 염색합니다. 1분간 PBST로 세척하여 과잉 DAPI를 제거한 후, 짧게 공기 건조합니다.

그 후, 시료를 형광 봉입제와 커버슬립으로 덮고, 슬라이드를 차광하여 4°C에서 보관합니다. 염색 후 24~48시간 이내에 슬라이드를 슬라이드 스캐너에 적재하고 프로그램 소프트웨어에서 새 프로젝트를 생성합니다. 슬라이드 미리보기를 위해 DAPI 채널과 2.5x 렌즈를 선택하고, 첫 번째 표본의 초점을 수동으로 맞춥니다.

세부 획득 과정에 포함되어야 할 각 단면의 외곽선을 지정하고 각 채널의 노출 시간을 설정하십시오. 이제 자동 이미지 획득을 실행하며, 자동화 과정 초기에 잘못된 획득이 발생하는 것을 방지하기 위해 첫 번째 시야(field of view)가 정확하게 획득되는지 확인하십시오. 이미지 획득이 완료되면, 각 단면의 오토포커스가 정확한지 그리고 개별 섬유들이 명확하게 구별되는지 수동으로 확인하십시오.

모든 이미지에 대해 필요에 따라 오토포커스를 확인하고 수동으로 교정하는 것이 매우 중요합니다. 자동화된 근섬유 정량화 과정에서 최적의 결과를 얻으려면 고품질의 이미지가 필요합니다. 그다음, 최종 분석에 포함될 모든 횡단면-섹션에 대해 DAPI를 제외한 각 채널을 개별 JPEG 파일로 내보내고, 노출된 채널에 따라 해당 파일들을 적절한 이름의 폴더로 명명하여 분류하십시오.

근섬유 정량화 과정을 시작하기 전, 적절한 이미지 편집 소프트웨어에서 각 이미지를 미리 확인하여 염색된 섬유와 배경 사이에 충분한 대조가 이루어졌는지 확인하십시오. 그다음, ImageJ에서 Plugins>Macros>Edit 명령을 사용하여 매크로 소스 코드를 열고, 매크로 소스 코드 내에서 각 채널의 폴더 디렉토리를 변경하십시오. 이제 Run 명령을 사용하여 매크로를 실행하십시오.

폴더 내의 모든 이미지가 매크로로 로드되어 순차적으로 정량화됩니다. 정량화가 완료되면 결과를 적절한 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고, 양성으로 계산된 slow, intermediate, fast fiber의 값을 확인하십시오. 이후 총 fiber 수를 계산할 수 있습니다.

근섬유의 면역형광 염색은 교차 반응이 적고 빠르게 진행되며, 결과 이미지에서 염색된 섬유와 주변 조직 간의 높은 대비는 물론, 서로 다른 섬유 유형 간의 뚜렷한 구분이 나타납니다. 자동 분석을 통해 수동 분석 대비 ±4%의 정확도로 상대적인 근섬유 군집을 검출할 수 있으며, 전체 절대 수치는 수동 분석에 비해 높게 측정됩니다. 그러나 상대적 수치는 ±4% 범위 내에서 유사하게 유지됩니다.

이 영상을 시청하신 후, 근섬유 정량화를 자동화하기 위해 이 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. DAPI를 사용하는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 따라서 염색을 수행하는 동안 적절한 보호 장구를 착용하시기 바랍니다.