Name: 절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 비만 관련 염증이 영향을 미치는 간 조직에서 대식세포를 분리하고 특성화하는 방법을. 이 프로토콜은 단일 세포 현탁액을 얻는 최적화된 단계를 제공하여 만성 염증 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 펜실베니아 주립 대학교 밀레니엄 과학 단지에서 Flow Cytometry 핵심 시설을 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
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<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
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<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
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<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
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<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
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<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
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저자는 공개 관심의 충돌이 있다.

아 테 롬, 간단한 steatosis steatohepatitis 공동 morbidities을 모방 하 고 제 2 형 당뇨병 다이어트 유발 대사 장애 모델 광범위 하 게 질병의 진행의 기본 분자 메커니즘을 더 잘 이해 하는 데 사용 됩니다. 콜라 종속 소화 자주 분열 조직의 세포 외 기질 (ECM)16,27에서 해방 하는 데 사용 됩니다. 콜라 같은 효소 콜라겐 세포를 이웃에 대 한 구조 지원을 제공 하는 중단. 조직 구조 구성 지시 조직 매트릭스 강성 (변형 저항) 그리고 원유 콜라 제품 성공적인 ECM 중단28보장에 가장 효율적입니다. 와트, "부드러운 매트릭스"의 구성 되는 자주 콜라 유형 ii 동시에 세포 표면의 인슐린 수용 체29의 무결성을 유지 하면서 해방 adipocytes와 주민 면역 세포를 소화 된다. 대동맥의 fibril ...

마우스 모델 인간의 질병의 역학 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 병에 걸린 상태에서 쥐에서 조직 거주 세포의 적절 한 절연1질병 병 인에 분자와 세포질 기여를 이해 하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 중요 한 중요 한 장애는 비만 이다. 비만의 발생률 인슐린 저항을 가진 동시에 전세계 상승 입력 2 당뇨병, 심혈 관 질환, 지방 간 질환2,3계속 됩니다. 과도 한 영양소 소비는 더4대동맥과 간 등 다른 주변 조직 세포 주위를 변경할 수 있습니다 지방 조직에서 나오는 변경된 신호 트리거링 줄된 신체 활동에 의해 비뚤어진 다. 같은 변화 항상성 장애 만성 낮은 학년 조직의 염증5발생합니다.
흰색 adipose 조직 (WAT)을 그들의 신규 모집 뿐만 아니라 대동맥 및 간 거주 대 식 세포의 클래식 활성화 뿐만 아니라 신진 대사 신호 dysregulation를 시작 하지만 염증6,7유지 표시 되었습니다. 대 식 세포의 phenotypic와 기능적인이 질은 비만의 병에 강하게 연관 공동 morbidities7관련. 대 식 세포 분극에 동적 소성 전시 진행 협조 하는 활성화 된 고기의 범위와 염증8의 해상도를이 셀에 대 한 수 있습니다. 고전적인 활성화 (M1) 세포는 염증의 전파에 연루는, 하는 동안 또는 활성화 (M2) 세포 해상도 조직 수리9,10와 연결 되었습니다.
으로 신체 대사 스트레스를 겪 습, 백색 지방 조직 비정상적으로 축적. 확장 된 지방 조직 매력과 뿌리깊은 인슐린 저항, 혈당 및 궁극적으로 2 형 당뇨병, 인슐린 저항 또는 혈당11, 홍보 일반 체형 기능을 변경 하는 염증 성 세포 유지 12. 동시에 발표 하는 염증 성 신호에 응답 개장 한다 백색 지방 조직 침투 고전적인 활성화 (M1) 지방 조직 대 식 세포 (Atm)13,14. 이 멀티 셀룰러 기관 간4대동맥 등 다른 신체 기관의 정상적인 기능 derails 신호 폭포를 발휘 한다.
간 근처 dysregulated 와트15에서 발생 하는 자극에 적응 하는 신진 대사 강국 이다. 간 세포 또는 Kupffer 세포 신진 대사 변화에 대응 parenchymal 모두 변환 하는 선 동적인 cytokines 및 비 parenchymal 세포 표현 형을 분 비 하 고 조직 리 모델링 추진. 간 장의 지질 축적, 염증, 과도 한 세포 외 기질 예금, 괴 사 및 간 손상의 넓은 스펙트럼에 기여 하는 염증 성 모욕 비 알코올 지방산 간 질환 와 관련 된 최종 기능 손실 다음과 16,,1718.
손상 된 와트와 간 기능에 병렬로 큰 동맥 시체는 만성 대사 스트레스19를 겪 습으로 동맥 벽 내 지질 축적. 내 피 세포를 활성화 하 여 발산의 분 비 및 monocytes20의 후속 모집 동맥 지질 축적을 트리거합니다. 일단 채용, monocytes 증식, 분화, 단백질을 섭취 하 고 거품 세포가. Atherogenesis를 시작 하 고 프로-염증 성 활동의 지속적인 채용 및 조직 거주 지질 라덴 대 식 세포. 이 atherogenic microenvironment에 릴레이 extracellular와 세포 스트레스 신호에 굴복, 이러한 세포는 다음는 apoptotic 신호 폭포에에서 종사. 이 거품 세포는 죽지로 그들은 그들의 지질 가득 괴 사 성 병 변, 다음 플 라크 파열, 심근 경색과 뇌졸중에 이르게 핵심 내용을 기여.
대 식 세포 고기의이 부분에 와트, 간 등 대동맥8,21dysregulated 조직에 염증 성 변화에 의해 유도 된 비만 총괄. 채용 그리고 조직 상주 대 식 세포 대 식 세포 표현 형1를 조작 하는 잠재적인 분자 표적에 대 한 통찰력을 제공할 수 있다. 효과적으로 비만 유발 염증된 조직에서 세포 특성, 단일 세포 현 탁 액은 효소 소화를 통해 얻어질 수 있다. 이러한 분리 프로토콜 충분히 결합 조직 면역 세포 죽음을 최소화 하 고 최적의 셀 수익률을 제공 하는 동안 저하에 효과적 이어야 합니다. 효소 혼합 조직 및 그것의 구조상 메이크업의 종류에 따라 달라 집니다. 대동맥 등 탄력적인 조직 간와 와트, 조직 분리를 달성 하기 위해 강력한 효소 활동을 요구 한다. 단일 세포 현 탁 액에서 조직 주민 대 식 세포 수 명확 하 게 특징 또는 transcriptional 프로 파일링 같은 추가 다운스트림 분석에 대 한 격리.
여기는 조직 관련 프로토콜 설명 하는 콜라-종속 조직 소화와 색채 cytometry 효과적으로 분리 하 고 유도 하는 전통적인 다이어트 비만에서 얻은 조직 상주 세포 특성화를 사용 하 동맥 경화 증, 간단한 steatosis 및 steatohepatitis 마우스 모델입니다. 백혈구-(CD45 또는 CD11b)와 대 식 세포-에 대 한 항 체와 세포 표면 마커 얼룩 동시 (f 4/80) 특정 항 원 자주 사용 한다 대 식 세포 인구22식별 하. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 고 순도에서 이러한 확인 된 인구를 정렬 하는 데 사용 하는 강력한 전략 이다. 정렬 된 인구 다음 형 특정 유전자 프로 파일 (예: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응) 다운스트림 분자 분석23을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 표준 cytometry와 교류 cytometry 기반 세포 분류는 크게 다른 유형의 세포 현 탁 액 내에서 세포를 구별에 강력한 도구, 비록 전 프로토콜 성공적인 출력 되도록 낙관 되어야 한다. 이 연구에서는 프로토콜을 효과적으로 분리 하 고 가능한 조직의 특정 세포 특성화 설명; 더 중요 한 것은,이 연구는 사전 및 문제 해결 전략을 방지 또는 해결 뿐만 아니라 자주 발생 하는 기술적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 인치 바늘</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 인치 바늘 x 12 인치 튜빙 혈액 채취 세트</td><td>BD</td><td>367297</td><td>간 관류 중 간하 IVC의 캐뉼레이션에 사용됩니다</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. 바늘</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>고무 스톱이 있는 1mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16/32 Fc 블록&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 퍼시픽 블루</td><td>바이오레전</td>드 <td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE 쥐 IgG2a</td><td>바이오레전</td>드 <td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 아르메니아 햄스터 IgG</td><td>바이오레전</td><td>드 400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 쥐 IgG2b</td><td>바이오레전</td>드 <td>400610</td><td></td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 랫 IgG2c</td><td>바이오레전</td><td>드 400717</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 변형 이글 미디엄(DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 스트레이너</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 수용액 -16x</td><td>전자 현미경 과학</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위, 3.5 인치, 직선, 23 mm, 샤프&nbsp;</td><td>스톨팅</td><td>52132-10P</td><td>일반 해부 목적으로 사용</td></tr><tr><td>마이크로 펜치, 4인치, 풀 커브, 0.8mm</td><td>스톨팅</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>일반적인 해부 목적으로 사용</td></tr><tr><td>스프링 해부 가위 &ndash; 3mm 절삭 날&nbsp;</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-10</td><td>대동맥 박리에 사용 단계 1.3.3.17에서 1.3.3.28까지</td></tr><tr><td>곡선 0.07 mm x 0.04&nbsp; mm 팁 집게</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>대동맥 박리에 사용 단계 1.3.3.17 - 1.3.3.28</td></tr><tr><td>지혈 집게(곡선형)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 세포 배양/페트리 접시</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 페트리 접시(10cm) 뚜껑</td> <td>포함Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리기 튜브(폴리프로필렌)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브&nbsp;( 폴리프로필렌)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 라운드-바텀 폴리스티렌 튜브&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>쌍둥이 자리 바이오 제품</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (원료 에틸 알코올 변성, 무수)</td> <td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 II</td><td>형 시그마 - 알드리치</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasse Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 비커&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm 헤모스태틱 클램프</td><td>스톨팅</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>톱니가 있는 집게</td> 스톨<td>팅</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m 일회용 필터</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄 칼륨 (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>면도기 (0.22 mm (0.009"))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>텍사스 레드 라이브/데드 스테인</td><td></td><td></td><td>레드 생존 가능성 스테인 (in 그림 1A)</td></tr></tbody></table>

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

비만 크게 조직 상주 세포 monocyte 파생 된 대 식 세포에 의해 중재 만성 염증 상태를 촉진 합니다. 다이어트 유발 된 비만 (DIO)는 대 식 세포가;의 역할을 공부 하 고 귀중 한 모델 그러나, 적절 한 대 식 세포 격리는 염증된 조직에서 취득 하기 어렵다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 단계와 높은 지방 (HFD) 또는 높은 콜레스테롤 높은 지방 (18 주 다음 쥐에서 조직 상주 대 식 세포의 적당 한 인구를 얻기 위한 우리의 연구에서 파생 된 필요한 문제 해결 지침 개요 HFHCD) 규정식 내정간섭입니다. 이 프로토콜은 비만 동맥 경화는 간, 대동맥, 흰색 adipose 조직 (WAT) 등에서 공부 하는 3 각 인 조직에 초점을 맞추고. 우리가 어떻게 dualistic 사용 강조 흐름의 cytometry 격리의 새로운 차원과 조직 상주 대 식 세포의 특성을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 기본 섹션에서는 기본 조직 관련 효소 소화 및 대 식 세포 격리, 이후 세포 표면 항 체 얼룩이 흐름 cytometric 분석에 대 한 복잡 한 합니다. 이 프로토콜 기존의 복잡 한 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 기본 해결 하 고 적절 하 게 정렬 된 세포 인구에서 광범위 한 특성을 얻을 수 있도록 이러한 복잡성을 설명 제공. 대체 농축 방법 FACS 작업할 때 유연성 및 시간 관리에 대 한 수 있도록 밀도 간 같은 셀 정렬에 대 한 포함 되어 있습니다. 간단히,이 프로토콜 macrophage 다양 한 주어진된 연구에서 염증된 조직에서에서이 평가 하는 연구를 보조 하 고 유리한 세포 분리 및 특성에 대 한 성공적인 통찰력 있는 문제 해결 팁을 제공 합니다. DIO 중재 염증에서 면역 세포.

18 주, 1 x 104 -2 × 104 CD45 (HCHFD 또는 HCD) 높은 지방 높은 콜레스테롤 다이어트 유지 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코) C57BL/6 (BL6) 마우스를 사용할 때++ F4/80 두 표본이 때 대동맥 세포 격리 될 수 있습니다 풀링된. ApoE 코 HFHCD 먹인 쥐에서 해 부 간은 5 x 105 정렬 Kupffer 세포 (사용 가능한 정렬 시간에 따라 달라 집니다) 보다 더 큰 생산. 먹 일 때 높은 지방 다이어트 (HFD)를 사용 하 여 야생 타입 (WT) C57BL/6 마우스, stromal 혈관 분수 (SVF)에서 5 x 105 1 x 106 거주 지방 조직 대 식 세포 (Atm)를 정렬할 수 있습니다. 대 식 세포는 특정된 조직에서 정렬할 수 있습니다 언급 한 총 수 정량 실시...

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

본 절차의 전반적인 목표는 간과 같이 식이 유발 염증의 영향을 흔히 받는 조직에서 대식세포를 효과적으로 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 조직 상주 대식세포의 표현형이 만성 염증성 질환의 진행을 어떻게 결정하는지에 관한 면역학 및 염증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 비만으로 인한 저등급 만성 염증의 영향을 받은 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 분리 단계를 최적화한다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 대학원생인 Joselyn Allen이 진행하겠습니다. 간을 분리하려면, 먼저 에탄올에 적신 마우스를 폴리스티렌 폼 해부판 위에 앙와위로 놓은 다음 앞발과 뒷발을 고정하십시오. 다음으로, 중간 포인트 팁 핀셋을 사용하여 요도구 근처의 복부 피부를 잡고, 날카로운 해부 가위로 들어 올린 피부에 작은 절개창을 만듭니다.가위의 아래쪽 날을 피부와 복막 사이의 절개창에 넣고 서혜부에서 턱까지 측면 절개를 수행합니다. 피부를 조심스럽게 젖혀 손상되지 않은 복강과 흉벽을 노출시킨 후, 복막을 따라 측면 절개를 합니다. 흉골을 들어 올리고 횡격막을 주의 깊게 절개합니다.그런 다음 위장관 장기들을 옆으로 밀어내고 간하하대정맥(subhepatic inferior vena cava) 또는 IVC의 위치를 확인합니다. 지혈 겸자를 사용하여 간상하대정맥(suprahepatic IVC)을 클램핑하여 국소 관류 상태를 유지하고, 미리 데워둔 관류 버퍼가 채워진 주사기를 23 gauge 혈액 채취 및 주입 세트에 연결합니다. 튜브와 바늘에 관류 버퍼가 가득 찰 때까지 플런저를 천천히 누른 후, 간하하대정맥과 평행하게 바늘을 삽입합니다.IVC의 적절한 캐뉼라 삽입은 해리 완충액이 간 전체와 주변 조직에 국소적으로 분포되게 하여 조직 소화를 최적화합니다. 4cm 지혈 클램프를 사용하여 바늘을 고정하고, 플런저를 천천히 눌러 관류를 시작하십시오. 바늘이 적절한 위치에 삽입되었다면, 간의 색이 빠르게 빠지며 간엽이 확대될 것입니다.관문맥을 즉시 절단하여 관류 완충액이 간을 통해 자유롭게 흐르도록 하고, 혈액 제거를 돕기 위해 엄지와 검지 사이로 간엽을 가끔 부드럽게 마사지합니다. 관류 완충액이 5 mL만 남았을 때, 관류 완충액 주사기를 미리 가온된 해리 완충액이 채워진 주사기로 교체하고, 간이 완전히 소화될 때까지 간엽을 계속 부드럽게 마사지하며 간을 관류합니다. 핀셋의 뭉툭한 끝부분으로 좌측 외측엽을 부드럽게 눌러 소화가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다.포셉을 제거하면 표면에 서서히 채워지는 함몰 부위가 나타나야 합니다. 그다음 바늘을 제거하고, 해부 가위의 짧은 직선 칼날을 사용하여 연결 인대를 조심스럽게 절단함으로써 간 전체와 담낭을 적출합니다. 적출한 간을 10 mL의 얼음처럼 차가운 DMEM이 담긴 10 cm 디쉬로 옮기고, 치상 포셉을 사용하여 절단된 간상하대정맥(suprahepatic IVC)을 잡습니다.중간 크기 핀셋을 사용하여 각 엽에 빠르게 문지르는 동작을 가함으로써 글리슨 캡슐(Glisson's Capsule)에서 세포를 분리하고, 포화된 DMEM을 얼음 위에 놓인 50 milliliter 원추형 튜브 내의 70 micrometer 세포 스트레이너에 통과시킵니다. 생존 세포의 높은 수율은 간 세포를 글리슨 캡슐로부터 적절하게 분리해야만 달성할 수 있습니다. 모든 세포가 수집되면, 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 부드럽게 섞고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다.상층액을 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 세 차례 더 저속 원심분리합니다. 마지막 원심분리가 끝나면, 상층액을 새로운 50 milliliter 튜브로 옮기고 세포를 더 높은 속도로 한 번 더 원심분리합니다. 그런 다음, 비실질세포 펠렛을 FACS buffer에 재현탁하여 세포 수를 측정하고, 라벨이 부착된 50 milliliter 원형 바닥 폴리스티렌 튜브에 간세포를 이후 응용 단계에 맞는 적절한 농도로 희석합니다.고지방 식이 또는 고지방 고콜레스테롤 식이를 섭취한 마우스는 대동맥과 같이 영향을 받은 조직에서 전형적으로 활성화된 M1 대식세포의 침윤이 증가하는 양상을 보입니다. 항염증 표현형을 나타내는 RON 수용체 발현 대동맥 CD45 양성 F4/80 양성 대식세포는 고지방 고콜레스테롤 식이를 섭취한 마우스에서 감소하는 반면, 염증 유발 CD45 양성 F4/80 양성 CD11c 양성 대식세포는 이러한 동물에서 분리한 대동맥에서 증가된 수로 발견됩니다. 또한, 소화된 대동맥에서 유래하여 분리한 RON 수용체 발현 대식세포는 잘 알려진 M2 대식세포 마커인 Arginase 1 유전자의 발현이 증가된 것으로 나타납니다.실제로 간 거주 대식세포의 특성 분석 결과, CD11c 양성 전염증성 대식세포 집단과 함께 RON 수용체를 발현하는 하위 집단의 표현형이 우세하게 나타났으며, 이들은 항염증성 M2 표현형과 밀접하게 연관된 유전자들의 발현이 감소한 것으로 확인되었습니다. 분쇄된 백색 지방 조직에서 분리한 대식세포 집단에서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 전염증성 표현형 대식세포 집단은 RON 수용체의 세포 표면 발현이 감소한 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면, 동물 한 마리당 20분에서 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 마친 후, 분리된 간 유래 조직 상주 대식세포의 표현형을 더욱 구체적으로 분석하기 위해 유세포 분석, 형광 활성 세포 분리 및/또는 정량적 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후, 여러분은 질환이 있는 간에서 조직 상주 대식세포를 적절하게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

쥐의 간 세포의 주요 문화 macrophages를 얻을 소설 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스틱 요리 선택적 첨부하여 문화 flasks 및 정화의 흔들림 다음 문화 macrophages의 확산을 활용합니다. 이 기술은 효율적으로 복잡한 장비와 기술없이 간 macrophages을 제공합니다.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.

지방 조직 면역 세포의 분리

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

대식세포는 숙주 병원성에 관여하는 핵심 세포입니다. 대식세포는 단백질체 분석으로 분석하고 검출할 수 있는 표현형 및 기능적 다양성을 나타냅니다. 이 문서에서는 M1 또는 M2 표현형으로 분화된 인간 대식세포의 1차 배양에 대해 2D 전기영동을 수행하는 방법을 설명합니다.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

이 문서에서는 지방 조직 및 cytometry 사용 하 여 이후 분석에서 면역 세포의 고립에 의해 지방 조직의 면역 세포 콘텐츠를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

배우세요 비만 관련 염증이 영향을 미치는 간 조직에서 대식세포를 분리하고 특성화하는 방법을. 이 프로토콜은 단일 세포 현탁액을 얻는 최적화된 단계를 제공하여 만성 염증 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

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