2017년 4월 3일
이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.
이 절차의 전반적인 목표는 간과 같이 식이 유발 염증에 일반적으로 영향을 받는 조직에서 대식세포를 효과적으로 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 조직 상주 대식세포 표현형이 만성 염증성 질환의 진행을 어떻게 지시할 수 있는지에 대한 면역학 및 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것의 주요 장점은 이 절차가 비만 매개 저등급 만성 염증의 영향을 받는 조직에서 유래한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 분리 단계를 최적화한다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Joselyn Allen입니다. 간을 분리하려면 먼저 에탄올에 적신 쥐를 폴리스티렌 폼 해부 보드의 누운 자세에 놓고 앞발과 뒷발을 고정합니다. 다음으로, 중간 포인트 끝 집게를 사용하여 요도 입구 근처의 복부 피부를 잡고 날카로운 절개 가위를 사용하여 융기된 피부를 작게 절개합니다.
가위의 아래쪽 날을 피부와 복막 사이의 절개 부위에 삽입하고 사타구니에서 턱까지 측면 절개를 합니다. 피부를 부드럽게 당겨 손상되지 않은 복강과 흉벽을 노출시키고 복막을 통해 측면 절개를 만듭니다. 흉골을 들어 올리고 횡격막을 조심스럽게 절개합니다.
그런 다음 위장 기관을 옆으로 옮기고 간하 하대정맥 또는 IVC를 찾습니다. 지혈 겸자를 사용하여 국소 관류를 유지하기 위해 간상(suprapatic IVC)를 고정하고 예열된 관류 완충액으로 채워진 주사기를 23게이지 혈액 채취 및 주입 세트에 부착합니다. 튜브와 바늘이 관류 완충액으로 채워질 때까지 플런저를 부드럽게 누르고 바늘을 간 하 IVC와 평행하게 삽입합니다.
IVC의 적절한 캐뉼레이션은 해리 완충액이 간과 말초 조직 전체에 국소적으로 분포되어 조직 소화를 최적화하도록 합니다. 4cm 지혈 클램프를 사용하여 바늘을 제자리에 고정하고 플런저를 부드럽게 눌러 관류를 시작합니다. 바늘이 적절한 위치에 있으면 간에서 색이 빠르게 씻겨 나오고 엽이 커집니다.
관류 완충액이 간을 통해 자유롭게 흐를 수 있도록 문맥을 즉시 절단하고, 때때로 엄지와 검지 사이의 엽을 부드럽게 마사지하여 혈액을 쉽게 제거할 수 있도록 합니다. 관류 완충액이 5ml만 남으면 관류 완충액 주사기를 예열된 해리 완충액으로 채워진 주사기로 교체하고 엽을 부드럽게 마사지하고 간이 완전히 소화될 때까지 간을 관류합니다. 한 쌍의 집게의 뭉툭한 가장자리를 왼쪽 측엽에 부드럽게 눌러 성공적인 소화를 확인합니다.
집게가 제거되면 천천히 채워지는 표면에 움푹 들어간 곳이 나타나야 합니다. 그런 다음 바늘을 제거하고 해부 가위의 짧고 곧은 날을 사용하여 연결 인대를 조심스럽게 잘라 간 전체와 담낭을 절제합니다. 10밀리리터의 얼음처럼 차가운 DMEM이 들어 있는 10cm 접시에 간을 옮기고 톱니가 있는 집게를 사용하여 절단된 간상 IVC를 잡습니다.
중간 포인트 겸자를 사용하여 각 엽에 빠른 쓰다듬는 동작을 적용하여 Glisson's Capsule에서 세포를 분리하고 얼음 위의 50ml 원추형 튜브에 있는 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 포화된 DMEM을 통과시킵니다. 생존 가능한 세포의 높은 수율은 Glisson's Capsule에서 간 세포를 적절하게 분리해야만 달성할 수 있습니다. 모든 세포가 수집되면 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 원심분리로 세포를 펠릿
화합니다.상층액을 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮겨 저스핀 원심분리를 3회 더 수행합니다. 마지막 원심분리 후 상층액을 새 50ml 튜브로 옮기고 더 빠른 속도로 세포를 한 번 더 원심분리합니다. 그런 다음 계수를 위해 비실질 세포 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁하고 간 세포를 라벨이 붙은 5밀리리터 원형 바닥 폴리스티렌 튜브의 다운스트림 적용에 따라 적절한 농도로 희석합니다.
고지방 다이어트 또는 고지방 고콜레스테롤 다이어트를 먹인 생쥐는 대동맥과 같은 영향을 받은 조직에서 고전적으로 활성화된 M1 대식세포의 침투가 증가했습니다. 항염증 표현형을 나타내는 대동맥 CD45 양성 F4/80 양성 대식세포를 발현하는 RON 수용체는 고지방, 고콜레스테롤 식단을 섭취한 마우스에서 감소하는 반면, 전염증성 CD45 양성 F4/80 양성 CD11c 양성 대식세포는 이러한 동물에서 분리된 대동맥에서 증가된 수로 발견됩니다. 또한, 소화된 대포도에서 유래한 대식세포를 발현하는 분류된 RON 수용체는 잘 확립된 M2 대식세포 마커인 Arginase 1 유전자의 발현이 증가했음을 나타냅니다.
실제로, 간 상주 대식세포의 특성화는 CD11c 양성 전염증성 대식세포 집단을 가진 하위 집단을 발현하는 RON 수용체의 우세한 표현형을 보여주며, 이는 개미-염증성 M2 표현형과 밀접한 관련이 있는 유전자의 발현이 감소함을 보여줍니다. 소화된 백색 지방 조직에서 분리된 대식세포 집단에서도 RON 수용체의 표면 발현이 감소된 전염증성 표현형 대식세포 집단에서 유사한 추세가 관찰됩니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 동물 한 마리당 20-30분 안에 완료할 수 있다.
이 절차에 따라 유세포 분석, 형광 활성화 세포 분류 및/또는 정량 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 분리된 간 유래 조직 상주 대식세포의 표현형을 추가로 특성화할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 병든 간에서 조직에 상주하는 대식세포를 적절하게 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 프로토콜은 연구자들이 식이로 인한 대사 장애로 영향을 받은 염증 조직에서 조직 거주 대식세포를 분리하고 특성화하는 것을 가능하게 합니다. 이 방법은 비만 매개 염증에 영향을 받은 조직에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 분리 단계를 최적화하는 데 중점을 둡니다.
Macrophage heterogeneity in obesity-driven inflammation is a critical determinant of disease progression and therapeutic targeting in metabolic and cardiovascular disorders. This protocol enables robust isolation and phenotypic characterization of tissue-resident macrophages from inflamed liver, aorta, and adipose tissue, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Reliable access to well-characterized immune cell populations enhances translational continuity and de-risks mechanistic hypotheses across the discovery pipeline.
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification and translational validation.