절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

본 절차의 전반적인 목표는 간과 같이 식이 유발 염증의 영향을 흔히 받는 조직에서 대식세포를 효과적으로 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 조직 상주 대식세포의 표현형이 만성 염증성 질환의 진행을 어떻게 결정하는지에 관한 면역학 및 염증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 비만으로 인한 저등급 만성 염증의 영향을 받은 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 분리 단계를 최적화한다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 대학원생인 Joselyn Allen이 진행하겠습니다. 간을 분리하려면, 먼저 에탄올에 적신 마우스를 폴리스티렌 폼 해부판 위에 앙와위로 놓은 다음 앞발과 뒷발을 고정하십시오. 다음으로, 중간 포인트 팁 핀셋을 사용하여 요도구 근처의 복부 피부를 잡고, 날카로운 해부 가위로 들어 올린 피부에 작은 절개창을 만듭니다.

가위의 아래쪽 날을 피부와 복막 사이의 절개창에 넣고 서혜부에서 턱까지 측면 절개를 수행합니다. 피부를 조심스럽게 젖혀 손상되지 않은 복강과 흉벽을 노출시킨 후, 복막을 따라 측면 절개를 합니다. 흉골을 들어 올리고 횡격막을 주의 깊게 절개합니다.

그런 다음 위장관 장기들을 옆으로 밀어내고 간하하대정맥(subhepatic inferior vena cava) 또는 IVC의 위치를 확인합니다. 지혈 겸자를 사용하여 간상하대정맥(suprahepatic IVC)을 클램핑하여 국소 관류 상태를 유지하고, 미리 데워둔 관류 버퍼가 채워진 주사기를 23 gauge 혈액 채취 및 주입 세트에 연결합니다. 튜브와 바늘에 관류 버퍼가 가득 찰 때까지 플런저를 천천히 누른 후, 간하하대정맥과 평행하게 바늘을 삽입합니다.

IVC의 적절한 캐뉼라 삽입은 해리 완충액이 간 전체와 주변 조직에 국소적으로 분포되게 하여 조직 소화를 최적화합니다. 4cm 지혈 클램프를 사용하여 바늘을 고정하고, 플런저를 천천히 눌러 관류를 시작하십시오. 바늘이 적절한 위치에 삽입되었다면, 간의 색이 빠르게 빠지며 간엽이 확대될 것입니다.

관문맥을 즉시 절단하여 관류 완충액이 간을 통해 자유롭게 흐르도록 하고, 혈액 제거를 돕기 위해 엄지와 검지 사이로 간엽을 가끔 부드럽게 마사지합니다. 관류 완충액이 5 mL만 남았을 때, 관류 완충액 주사기를 미리 가온된 해리 완충액이 채워진 주사기로 교체하고, 간이 완전히 소화될 때까지 간엽을 계속 부드럽게 마사지하며 간을 관류합니다. 핀셋의 뭉툭한 끝부분으로 좌측 외측엽을 부드럽게 눌러 소화가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다.

포셉을 제거하면 표면에 서서히 채워지는 함몰 부위가 나타나야 합니다. 그다음 바늘을 제거하고, 해부 가위의 짧은 직선 칼날을 사용하여 연결 인대를 조심스럽게 절단함으로써 간 전체와 담낭을 적출합니다. 적출한 간을 10 mL의 얼음처럼 차가운 DMEM이 담긴 10 cm 디쉬로 옮기고, 치상 포셉을 사용하여 절단된 간상하대정맥(suprahepatic IVC)을 잡습니다.

중간 크기 핀셋을 사용하여 각 엽에 빠르게 문지르는 동작을 가함으로써 글리슨 캡슐(Glisson's Capsule)에서 세포를 분리하고, 포화된 DMEM을 얼음 위에 놓인 50 milliliter 원추형 튜브 내의 70 micrometer 세포 스트레이너에 통과시킵니다. 생존 세포의 높은 수율은 간 세포를 글리슨 캡슐로부터 적절하게 분리해야만 달성할 수 있습니다. 모든 세포가 수집되면, 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 부드럽게 섞고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 세 차례 더 저속 원심분리합니다. 마지막 원심분리가 끝나면, 상층액을 새로운 50 milliliter 튜브로 옮기고 세포를 더 높은 속도로 한 번 더 원심분리합니다. 그런 다음, 비실질세포 펠렛을 FACS buffer에 재현탁하여 세포 수를 측정하고, 라벨이 부착된 50 milliliter 원형 바닥 폴리스티렌 튜브에 간세포를 이후 응용 단계에 맞는 적절한 농도로 희석합니다.

고지방 식이 또는 고지방 고콜레스테롤 식이를 섭취한 마우스는 대동맥과 같이 영향을 받은 조직에서 전형적으로 활성화된 M1 대식세포의 침윤이 증가하는 양상을 보입니다. 항염증 표현형을 나타내는 RON 수용체 발현 대동맥 CD45 양성 F4/80 양성 대식세포는 고지방 고콜레스테롤 식이를 섭취한 마우스에서 감소하는 반면, 염증 유발 CD45 양성 F4/80 양성 CD11c 양성 대식세포는 이러한 동물에서 분리한 대동맥에서 증가된 수로 발견됩니다. 또한, 소화된 대동맥에서 유래하여 분리한 RON 수용체 발현 대식세포는 잘 알려진 M2 대식세포 마커인 Arginase 1 유전자의 발현이 증가된 것으로 나타납니다.

실제로 간 거주 대식세포의 특성 분석 결과, CD11c 양성 전염증성 대식세포 집단과 함께 RON 수용체를 발현하는 하위 집단의 표현형이 우세하게 나타났으며, 이들은 항염증성 M2 표현형과 밀접하게 연관된 유전자들의 발현이 감소한 것으로 확인되었습니다. 분쇄된 백색 지방 조직에서 분리한 대식세포 집단에서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 전염증성 표현형 대식세포 집단은 RON 수용체의 세포 표면 발현이 감소한 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면, 동물 한 마리당 20분에서 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 마친 후, 분리된 간 유래 조직 상주 대식세포의 표현형을 더욱 구체적으로 분석하기 위해 유세포 분석, 형광 활성 세포 분리 및/또는 정량적 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후, 여러분은 질환이 있는 간에서 조직 상주 대식세포를 적절하게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.