마이크로 어레이를 사용한 발현 프로파일링

DNA 마이크로어레이는 많은 다른 유전자의 발현을 동시에 측정하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 그(것)들은 "칩" 또는 슬라이드에 고정된 다른 유전자를 대표하는 프로브의 수천으로 구성되고, 다른 생물학 조건에서 유전자 발현을 평가하기 위하여 상호 보완적인 혼성화에 의지합니다.

이 비디오는 마이크로어레이 기술의 기본 원리, 마이크로 어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일링 프로토콜 및 일부 현재 응용 프로그램을 다룹니다.

먼저 유전자 발현 프로파일링 및 마이크로어레이 기술의 원리에 대해 논의해 보겠습니다.

생물학적 샘플에서 유전자 발현을 평가하기 위해 개발된 초기 방법 중 하나는 멤브레인에 고정된 특정 RNA 분자에 대한 "프로빙"을 수반하는 북부 블로팅입니다. "자유 부동" 프로브는 샘플에서 상호 보완적인 RNA 서열을 인식하고, 전형적으로 방사성 또는 형광 분자로 표시되어 시각화될 수 있습니다.

미세 제조, 게놈 시퀀싱 및 기타 기술의 발전은 마이크로 어레이 바이오 칩의 개발로 이어졌습니다. 북부 얼룩과 마찬가지로 마이크로 어레이는 프로브와 샘플 핵산 서열 사이의 상호 보완적 결합 원리를 기반으로 합니다. 그러나 북부와 는 달리 마이크로 어레이에서는 유리 슬라이드 또는 칩에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브입니다. "자유 부동" 샘플은 세포의 또는 관심 있는 유기체로부터 분리된 RNA로부터 생성되며, 이는 상호 보완적 또는 "c"-DNA로 전사된다. 이것은 형광 분자로 직접 표지될 수 있고, 또는 그들의 양은 cRNA로 체외 전사에 의해 더 증폭될 수 있습니다. 그런 다음 샘플이 칩에 혼성화됩니다. 다른 응용 프로그램을 위해 설계된 마이크로 어레이에 프로브는 "감각"일 수 있기 때문에, 이는 그들의 순서가 유기체의 표현RNA, 또는 "안티 센스"와 같은 방향으로 있다는 것을 의미, 연구원은 견본의 가닥 방향성이 프로브의 것과 상호 보완적이다는 것을 확인해야합니다.

칩상에 있는 각 유전자 특이점에 대한 "원시" 형광 강도 데이터는 정량화 및 처리될 수 있다. 데이터는 학생의 t 시험과 같은 추가 통계 시험을 실시할 수 있으며, 형광 신호가 두 세포 유형 또는 실험 조건 간에 현저히 다른 지 여부를 결정할 수 있습니다.

연구원은 또한 표현의 유사한 패턴에 근거를 둔 "클러스터" 또는 그룹 유전자에 이 데이터를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 두 세포 집단 사이의 발현 패턴을 비교할 때, 특정 유전자는 동일한 방향으로 대략 동등한 양에 의한 발현 변화를 입증하는 것으로 밝혀질 수 있고, 따라서 함께 그룹화될 것이다. 연구원은 "가지"의 높이 그리고 배열이 얼마나 유사하거나 유사하는지 나타내는 나무 다이어그램 또는 "dendrogram"의 모형에 있는 이 관계를 묘사할 수 있습니다 -또는 유사-유전자 발현 패턴입니다. 분석의 이 모형은 "클러스터된" 유전자가 동일 생물학 통로에 참여할 수 있기 때문에 유전자 네트워크에 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이제 마이크로어레이 방법론의 원리에 대해 논의되었으므로 일반적인 마이크로어레이 실험을 살펴보겠습니다.

격리된 RNA의 품질을 보장하기 위해 작업 공간과 장비는 RNA를 파괴하는 효소인 RNases를 비활성화하는 화학 물질로 처리되어야 합니다. RNA는 관심있는 샘플에서 분리되고 정제되며, 그 농도와 무결성은 분광계를 통해 결정됩니다.

이 샘플 RNA는 cDNA, 그리고 cRNA로 변환됩니다. 다음으로, 샘플은 형광 분자로 표지되고 단편화되고, 그 질과 양은 다시 검사될 수 있으며, 이 때 형광 라벨링의 정도도 평가될 수 있다.

라벨이 부착된 cRNA는 마이크로어레이에 로드하기 전에 "혼성화 솔루션"과 혼합됩니다. 성공적인 혼성화를 용이하게 하기 위해 "믹서"를 칩에 배치하여 "혼성화 챔버"를 형성합니다. 그런 다음 혼성화 믹스가 배열에 천천히 추가됩니다. 이들은 마이크로 어레이의 특정 영역에 샘플의 바인딩을 방해하고, 거짓 음의 신호를 초래할 수 있기 때문에, 기포를 피하기 위해 주의해야한다. 시료가 추가되면 칩은 최대 24시간 동안 적절한 온도에서 배양됩니다.

혼성화 후, 믹서는 칩에서 제거되고, 바운드되지 않은 시료가 세척되고, 어레이는 전문 슬라이드 보유 원심분리기에서 원심분리에 의해 철저하게 건조된다. 말린 칩은 마이크로어레이 스캐너에 삽입되고, 칩에서 관찰된 가장 밝은 신호가 과도하게 포화되지 않도록 기계가 조정됩니다. 그런 다음 마이크로 어레이를 스캔하고 전체 칩의 이미지가 생성됩니다.

칩을 스캔하면 이미지 파일이 데이터 추출 소프트웨어에 로드되고 신호 부정성에 대해 평가됩니다. 마이크로어레이 이미지에서 추출된 데이터는 로그₂ 변환을 포함한 다수의 통계적 조작을 거치며, 이는 연구원이 유전자 발현의 증가 또는 감소측면에서 데이터를 수치적으로 묘사할 수 있게 한다. 마이크로어레이 칩 간의 신호 차이를 차지하는 정규화뿐만 아니라. 그런 다음 이 처리된 데이터를 추가로 분석할 수 있습니다.

이제 마이크로어레이로 표현프로파일링이 수행되는 방법을 보여 주므로 특정 실험에서 마이크로어레이를 어떻게 사용할 수 있는지 살펴보겠습니다.

연구원은 수시로 세포 분화와 같은 생물학 프로세스를 통해 유전자 발현이 어떻게 변경되는지 평가하기 위하여 마이크로 어레이를 이용합니다. 여기서 과학자들은 망막 발달의 다른 단계를 나타내는 3개의 인간 세포 모형에서 미세 조정 유전자 발현에 관여하는 22-뉴클레오티드 작은 RNA인 microRNAs의 수준을 평가했습니다. 이 세포 사이 microRNA 발현을 비교해서, 연구원은 망막 조직 분화 및 발달에 잠재적으로 관련되었던 유전자를 확인할 수 있었습니다.

마이크로어레이는 또한 다른 세포 또는 조직 모형 사이 발현 다름을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 실험에서는 외상 후 스트레스 장애 또는 PTSD의 설치류 모델이 쥐를 감전에 노출시킴으로써 확립되었습니다. 뉴런은 다른 뇌 영역에서 수집되었고 RNA는 분리되었다. 마이크로어레이는 PTSD 뒤에 복잡한 분자 기계장치에 대한 통찰력을 제공하는 이 뉴런에 있는 미토콘드리아 관련 유전자의 차동 발현을 확인하기 위하여 그 때 이용되었습니다.

마지막으로, 연구원은 또한 새로운 질병 biomarkers가 확인될 수 있다는 희망에 있는 암 연구 결과에 마이크로 어레이를 적용하고 있습니다. 우리의 진화를 통해 바이러스에 의한 감염의 결과로, 인간 게놈은 "내인성 레트로바이러스" 또는 ERV로 불린 바이러스성 유전 순서를 포함합니다, 그 중 일부는 아직도 적극적으로 표현됩니다. 여기서, 암 및 정상 전립선 조직에서 ERV의 발현은 마이크로어레이를 사용하여 비교되었다. 이 방법은 연구원이 전립선암에서 강화된 몇몇 ERV를 찾아내는 것을 허용했습니다, 그(것)들에게 질병을 진단하기 위하여 이용될 수 있는 잠재적인 biomarkers만들기.

마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현 프로파일링에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오는 마이크로어레이 기술의 기본 원칙, 표현 프로파일링을 위한 프로토콜 및 이 기술의 응용 프로그램을 다루었습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!