형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

이 이미징 분석의 전반적인 목표는 뉴런에서 소포 운동성을 관찰하고 쉽게 정량화하는 것입니다. 이 접근 방식을 통해 간단하고 시간 효율적인 방식으로 뉴런의 막 이동을 분석할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 자궁을 70% 에탄올이 함유된 새 페트리 접시로 이식합니다.

다음으로, HBSS가 있는 다른 페트리 접시로 자궁을 옮깁니다. 그런 다음 멸균된 해부 겸자와 수술용 가위를 사용하여 자궁에서 태아를 제거합니다. 그런 다음 HBSS가 있는 새 페트리 접시에 넣으십시오.

실체 현미경으로 피부와 두개골을 제거하고 멸균된 해부 겸자를 사용하여 뇌를 꺼냅니다. 그런 다음 HBSS가 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균된 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다.

그런 다음 여분의 영역을 잘라냅니다. 다음으로, 피질을 HBSS가 있는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 일회용 스포이드 또는 25ml 피펫을 사용하여 모든 피질을 수집하고 15ml 튜브에 넣습니다.

그런 다음 피펫팅으로 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 대뇌 피질 효소 용액 3ml를 피질이 들어 있는 튜브에 넣는다. 튜브를 수조에 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

그 후, 대뇌피질 효소 용액 3ml를 대뇌피질 효소 용액을 대뇌피질이 들어 있는 튜브에 넣고 섭씨 37도의 수조에서 추가로 5분 동안 배양합니다. 5 분 후에 대뇌 피질 효소 해결책을 제거하고 10%fetal 둔감한 혈청을 포함하는 DMEM의 5 밀리리터를 추가하십시오. 멸균 P1000 팁이 있는 5ml 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 피질을 분리합니다.

그런 다음 P200 팁이 있는 5ml 피펫을 사용하여 피질을 다시 피펫팅합니다. 40 마이크로 미터 나일론 셀 스트레이너를 50 밀리리터 튜브에 넣고 서스펜션을 여과하여 파편을 제거합니다. 그 후, 현탁액을 실온에서 5분 동안 420배 g으로 원심분리한 후 DMEM 매체를 제거합니다.

그 후, 5ml의 대뇌 피질 배양 배지를 첨가하고 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 대뇌 피질 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 조정합니다. 다음으로, 코드화된 35밀리리터 유리 바닥 접시 각각에 대해 2밀리리터의 세포 현탁액에 있는 6개의 피질 뉴런에 10을 세 번 플레이트합니다.

이 절차에서는 4마이크로그램의 플라스미드와 200마이크로리터의 무혈청 배지를 혼합합니다. 별도의 튜브에서 8마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 200마이크로리터의 무혈청 배지에 희석합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 용액을 배양합니다.

5분 후 플라스미드 용액과 형질주입 시약 용액을 혼합하고 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 코드화된 유리 바닥 접시에 혼합물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 뉴런을 배양합니다.

그 후, 배지를 2ml의 대뇌 피질 배양 배지로 교체하고 1-2일 동안 섭씨 37도에서 뉴런을 배양합니다. 이미징을 위해 40X 대물 렌즈가 있는 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하십시오. 배양 시스템을 사용하여 온도를 섭씨 37도로 유지하십시오.

이미지 수집 소프트웨어에 의해 제어되는 100초 동안 5초마다 한 프레임씩 뉴런 이미지를 획득합니다. 이미지를 분석하려면 수동 추적을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 모든 순차적 이미지를 엽니다. 순차적 이미지를 결합하려면 이미지, 스택, 스택을 차례로 선택하고 이미지를 스택으로 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 플러그인을 선택한 다음 수동 추적을 선택합니다.

추적 창이 나타납니다. Show Parameters의 확인란을 클릭하고 Parameters 섹션에서 추적 매개변수를 정의합니다. 그런 다음 트랙 추가를 클릭하여 새 트랙을 시작합니다.

관심 있는 소포를 확인한 후, 순차적 영상에서 신호의 중심을 클릭하여 xy 좌표를 기록합니다. 이 절차를 반복하여 모든 순차적 이미지에서 소포의 xy 좌표를 수집하면 참조점이 선택된 후 각 이미지가 자동으로 연속 이미지로 진행됩니다. 이 이미지는 4개의 DIV에서 시작된 2일간의 형질주입 후 마우스 피질 뉴런의 수상돌기에 있는 소포를 포함하는 LAMP-EGFP의 운동성을 보여줍니다.

삽입은 LAMP-EGFP 양성 소포의 타임랩스 이미지를 보여줍니다. 빨간색 화살촉은 움직이는 소포를 나타내고 파란색 화살촉은 휴지 소포를 나타냅니다. 주황색 화살표는 더 높은 형광 신호를 나타냅니다.

다음은 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 종속 X축 위치입니다. b로 표시된 빨간색 원 안의 소포는 움직이고 있고 a로 표시된 파란색 원 안의 소포는 쉬고 있습니다. 이 막대 그래프는 LAMP-EGFP 이동의 총 거리를 나타냅니다.

그리고 이 막대 그래프는 소포를 포함하는 LAMP-EGFP의 평균 운동성 거리를 나타냅니다.