Name: 블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 블루 네이티브 PAGE와 단백질 상관 관계 프로파일링을 이용한 친화력 정제 단백질 복합체 분석 방법을. 이 기술은 질량 분석법을 통해 단백질 상호작용 데이터의 해상도를 높여줍니다.

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<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
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여기, 우리는 단백질 복합체를 해결하기 위해 양적 질량 분석과 함께 파란색 기본 겔 전기 영동 다음에 친화력 정화의 사용을 설명합니다. 이 방법은 기능성 단백질 어셈블리로 일차원 단백질 상호 작용의 목록을 해명하기위한 방법을 제공한다. 우리는 에피토프 - 태그 단백질의 사용을 기반으로하는 방법을 보여줍니다. 태그가 단백질을 발현하는 세포주를 사용할 수없는 경우, 대안은 관심의 단백질에 대한 항체를 사용하는 네이티브 경쟁 용출을 달성 할 수 펩타이드가 제공 할 수도 있습니다. 출발 물질과 구슬의 양의 크기는 목적 단백질의 발현 수준에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. 우리는 일반적으로 출발 물질 2-5 × 108 셀이 프로토콜을 수행하고, 이는 심지어 낮은 발현 수준을 갖는 단백질을 충분하다. 용해 완충액의 조성은 달성하도록 실험적으로 선택되어야근처 미끼의 가용화를 완료합니다. 이 바인딩 특정 염색질 또는 막 단백질에서 단백질의 일부 ​​유형에 대한 도전이 될 수 있습니다. 대안적인 옵션은 연구중인 단백질 복합체는 높은 염 또는 염색질 결합 단백질 20, 29, 초음파 및 / 또는 뉴 클레아 제 처리를 사용하여 안정한 것이어야한다 소금의 양을 증가시키는 것을 포함한다. 막 단백질의 경우, DDM 또는 디기 토닌에 세제를 전환하는 것이 바람직 할 수도있다 (30). 이 DNA 결합 단백질의 경우, 정제 단계 (20) 중 벤조 나제 바와 같은 뉴 클레아 제를 포함하는 것이 유용하다. 핵산의 완전한 제거는 검출 된 상호 작용 단백질과 DNA 사이에서 발생에 의해 매개되지 않는 것을 보장한다. 이 방법을 사용하여 조사중인 착체의 안정성이 때 중요한 요소를 고려한다. 절차는 길고 preservin을 포함 할 수있다g 단백질 복합체 밤새. 우리는이 크로 마틴 리모델링 복합체 (D 보데와 M 파르도, 데이터가 표시되지 않음) 좋은 성공을 달성,하지만이 평가되어야한다. 필요한 경우 친화 정제 공정을 단축 할 수있다. 같은 크기 배제 크로마토 그래피 등의 기본 분류를 허용 대체 기술은 널리 단백질 복합체의 특성을 50 년 이상 사용되어왔다. 우리는 청색 등 천연 PAGE의 해상도가 크기 배제 크로마토 그래피 20, 31, 32, 33을 사용하여 달성이 우수하다는 것을 보여 주었다. 블루 기본 페이지의 또 다른 장점은 비용이 크로마토 그래피 시스템을 필요로하지 않는, 오히려 실험실에서 널리 퍼져 단백질 전기 영동 장비를 사용합니다. 의 측면에서 손에 시간,이 방법은 기존의 geLC-MS / MS (A)보다 더 많은 작업을 포함하지 않습니다pproach 또는 오프라인 크로마토 그래피 분별. 대부분의 분류 기술 할 그러나, 그것은 그들의 해상도에 한계가 있습니다. 매우 균일 또는 질량과 모양에 가까운 단지는 파란색 기본 페이지에서 제공하는 해상도 및 공유 서브 유닛과 별개의 단지를 해결 보편적으로 성공하지 않을 수 있습니다 여기에보고 따라서 프로토콜을 넘어 수 있습니다. 격려하여, 우리는 세 개의 서브 유닛 (M 파르도, 준비 원고를) 공유하는 두 개의 매우 유사 사량 단지를 분리하는데 성공했다. 질량 분석 점점 민감한되어 있기 때문에, 불특정 인터랙 오염물 미세한 양 AP-MS 샘플에서 검출 될 수있다. 여기에 제시된 방법은보다 높은 분자량에서 미끼 마이그레이션 피크와 일치 마이그레이션 봉우리 단백질에 관심을 집중하여 친화력 정화의 배경 오염 실제 인터랙의 차별에 도움이 있습니다단량체 단백질. 몇몇 그룹이 이전의 분리 10, 11, 12, 34에 대한 필요없이 셀룰러 규모 단백질 복합체를 묘사하는 단백질 상관 프로파일이어서 분별 기법을 사용 하였다. 그러나,이 하위 화학 양 론적 상호 작용을 검출하는 오류가 발생할 수 있습니다. 친화력 정화를 통해 농축 단계의 통합이를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 특정 단백질이 동일한 셀룰러 컨텍스트 내의 소요 부분에 상기 다수의 복합체 단백질 복합체의 토폴로지 탐색 및 해명에 일반적으로 유용한 것으로한다. 이 전략은 단백질 복합체를 해결하기 위해 고가의 크로마토 그래피 분별 장비가 없을 수 있습니다 실험실 간단하고 의무입니다.

세포에서, 가장 단백질은 일시적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 통해 안정한 단백질 또는 조립체를 형성하여 기능을 수행한다. 단백질 상호 작용을 특성화하는 것은 충분히 이해 세포 과정에 매우 중요합니다. 질량 분석 (AP-MS)와 함께 선호도 정화는 천연 단백질 상호 작용을 식별하기 위해 가장 일반적으로 적용되는 전략 중 하나입니다. 지난 10 년간 달성 기기의 기능을 크게 향상이 방법은 매우 강력한 만들었습니다. AP-MS 실험에 의해 확인 된 상호 작용이 미끼와할까요 사이의 직접 및 간접 협회의 혼합물을 포함하는 것이 중요합니다. 또한, 종종 단백질은 다른 생물학적 역할을 할 수도 있습니다 동일한 세포 맥락에서 여러 가지 다른 단지에 참여, 따라서 AP-MS에 의해 식별됩니다 인터랙는 별개의 단백질 어셈블리 또는 기능 엔티티의 혼합을 나타낼 수 있습니다. 도출 할 수 없습니다이러한 토폴로지 정보는 AP-MS 간단한 실험에 의해 생성 된 단백질의 모노 차원 목록에서 선험적. 그러나,이 기술은 이러한 어셈블리를 해결하기 위해 하나 이상의 방법과 결합하여 단백질 복합체의 구조를 정의하는 데 더 이용 될 수있다. AP-MS를 통해 확인 된 단백질 상호 작용의 토폴로지를 해결하기 위해 몇 가지 전략이 적용되고있다. 하나의 방법은 실험 1과 베이트 이전 라운드에서 확인할까요을 이용하여 반복적 인 AP-MS 실험을 수행한다. 매우 유익한 있지만,이 두 실험 및 해석 상당히 노동 집약적 인 작업입니다. 질량 분석기와 결합 단백질 가교 점점 단백질 복합체 2, 3, 4, 5에 대한 위상 정보를 도출하는 데 사용되고있다. 그러나 computatio가교 결합 된 펩티드의 최종 분석은 여전히 ​​도전 과제로 남아 따라서 흐름의 병목 현상이다. MS 분해성 가교 시약의 출현 단백질 (6, 7)를 상호 작용에 가까운 위치에 아미노산 잔기의 매핑을 용이하게한다. 또 다른 방법은 종래의 직교 분리 기술 8,9 친화 정제를 조합하는 것이다. 겔 여과 나 이온 교환 수, 또는 수 크로스 구배 분획 법에 의해 크로마토 그래피 분별은 또한 최근에 의해 통과 복잡한 분리 단계 10, 11, 12, 13, 시스템 전체의 레벨에서 multiprotein 착물을 설명하기 위해 정량적 질량 분석과 조합하여 사용되고있다. 블루 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (BN-PAGE)는 널리 적용되었습니다천연 단백질 상호 작용, 미토콘드리아 막 단백질 복합체 (14)를 포함하는 일반적으로 사람들을 조사합니다. 이 분리 기술은 최근 미토콘드리아 단지 15 일에뿐만 아니라 라벨이없는 단백질 정량과 상관 프로파일 링과 함께 사용 된 16, 17,뿐만 아니라 19 일 전체 세포 18에서 다른 단백질 복합체를 푸는합니다. 우리는 이후 기본 분류 방법과 정량적 인 MS와 친화력 정화의 조합이 특정 단백질을 포함하는 여러 단백질 어셈블리를 해결하기위한 유용한 전략을 제공해야한다는 가설을 세웠다. 여기서 우리는 정량적 질량 SP이어서 절연 단지 청색 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법으로 일반 에피토프 계 친화 정제를 조합하는 방법을 설명ectrometry 단백질 상관 프로파일은 단백질에 관여 할 수있는 여러 어셈블리를 해결합니다. 우리는 에피토프 태그에 융합 관심의 단백질이 생리적 풍부 가까이 달성하고 효율적인 기본을 보장하기 위해 내생 로커스에서 표현 마우스 배아 줄기 세포를 사용 복잡한 격리. 이 방법은 단백질이 기존의 geLC-MS (20)보다 더 많은 작업을 필요로하지 않는 동안, 자신의 상관 프로필을 기반으로 별개의 어셈블리에 이러한 문제를 해결하기에 종사 여러 상호 작용을 풀어.

<table><tbody><tr><td>단백질 G: Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG 항체 M2</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr>, <tr><td>Tween-20, 단백질 등급, 10% 용액</td>, <td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl pimelimidate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr>, <tr><td>0.2 M 트리에탄올아민 완충액, pH 8.2</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG 펩타이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE 음극 첨가제</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x NativePAGE 샘플 로딩 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 샘플 첨가제&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 원뿔형 바닥 96웰 플레이트, 폴리프로필렌</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>멀티스크린 HTS 96웰 여과 시스템</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96웰 캡 천연</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP(Tris(2-카르복시에틸)포스핀 염산염)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 염기서열분석 등급</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (소프트웨어)</td><td>N.A.</td><td>해당 없음</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>페르세우스 (소프트웨어)</td><td>N.A.</td><td>해당 없음</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

대부분의 단백질은 다른 단백질과 연합하여 작용합니다; 그러므로, 생물학적 과정을 완전히 이해하기 위해서는 이러한 기능 단위를 특성화하는 것이 중요합니다. 질량분석법(AP-MS)과 결합된 친화성 정제는 단백질-단백질 상호 작용을 식별하기 위해 선택되는 방법이 되었습니다. 그러나 기존의 AP-MS 연구는 단백질 상호 작용에 대한 정보를 제공하지만 조직 정보는 손실되었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 질량 분석법으로 특성을 분석하기 전에 친화성 정제된 단백질 복합체를 분해하여 단백질이 관여할 수 있는 고유한 기능 어셈블리를 밝히는 전략을 개발했습니다. 에피토프 태그를 사용한 미끼 단백질의 친화성 정제와 경쟁적 용리를 통해 분리된 단백질 복합체는 파란색 천연 전기영동을 통해 분리됩니다. 정량적 질량 분석법을 사용한 상관 관계 프로파일링을 통한 단백질 이동 프로파일의 비교를 통해 상호 작용하는 단백질을 별개의 분자 개체에 할당할 수 있습니다. 이 방법은 겔 여과와 같은 기존 크로마토그래피 기술로는 분리되지 않을 수 있는 가까운 분자량의 단백질 복합체를 분리할 수 있습니다. 기존의 AP-geLC-MS/MS보다 약간의 작업을 통해 이 전략이 많은 경우 단백질 상호 작용을 식별하는 동시에 단백질 복합 토폴로지 정보를 얻는 데 적합할 수 있음을 보여줍니다.

질량 분석에 의해 친 화성 정제 블루 천연 단백질 상관 프로파일의 워크 플로우 (ABC-MS) 전략은도 7에 도시되어있다. 관심의 단백질 주변의 원주민 단백질 복합체 (이 경우 FLAG)에 에피토프 태그에 대한 항체를 사용하여 친화력 정화 및 경쟁력 용출에 의해 격리됩니다. 착물은 BN-PAGE에 의해 해결되며, 전체 겔 레인은 48 개 부분으로 절개하고, 샷건 LC-MS / MS를 위해 준비했다. MS 정량 정보는 청색 기본 분리 걸쳐 각각의 식별 된 단백질 마이그레이션 프로파일을 생성하는 데 사용된다. 상호 작용하는 단백질을 겹쳐 피크 구별 복잡한 디스플레이 유사한 이동 프로파일을 형성한다. 목적 단백질은 하나 개 이상의 부 조립에 걸리는 경우, 다수의 피크가, 그 이동 프로파일에서 관찰 된 서브 착물 청색 네이티브 겔 해상력 내에 주어진다. 미그의 체계적인 비교배급량 프로필 계층 클러스터링을 사용하여 단백질의 프로파일 상관에 의해 달성 될 수있다. dendrogram은 모든 분획에 대한 피크 강도가 별개의 단백질 복합체에 속하는 단백질 (도 8)의 상호 작용의 확인을 용이하게 열지도 시각화된다. 우리는 MTA2, 복잡한 20 개조 NuRD 염색질의 핵심 서브 유닛의 상호 작용 파트너를 분석하기 위해이 전략을 사용했다. 도 9에 도시 된 바와 같이, MTA2의 이동 프로파일은 더 풍부 표시 하부 질량 피크, 700 kDa 이상 1.2 MDA 간의 구별 강도의 두 피크를 표시. MTA1 / 3 HDAC1 / 2 Mbd3 포함한 기타 NuRD 코어 서브 유닛은, 상기 서브 유닛, 즉 Chd4의 일부 피크이라도 동일한 분리 패턴을 보였다 B Gatad2a / 및 Rbbp4 / 7은 (도 9a 역 풍부 분포 있었다 B). 한편, CDK의 프로필2ap1,이 Wnt 유전자 프로모터 (23)에 NuRD 복합체를 모집 규제 인자 만 높은 질량 피크 (도 9c)를 표시하고 있으므로 Sall4도 NuRD 20, 24, 25에 결합하는 것으로 나타났다 전사 리프레했다. 따라서, 청색 기본 PAGE에 의한 친 화성 정제 MTA2 관련 단백질 분획은 NuRD 복합체의 두 가지 형태를 확인할 수 있었다. ABC-MS는 특정한 단백질 엔티티에 할당하면서 신규 인터랙의 식별을 허용한다. 열 -지도에 표시된 단백질 클러스터 및 분획 강도의 시험을 통하여 우리는 두 NuRD 피와 일치 개의 이전 피크를 표시 NuRD 소단위와 Wdr5와 Wdr5 상기 MLL의 메틸화 착체 (26)의 조절 서브 유닛 사이의 강한 상관을 검출Wdr5 및 NuRD 간의 새로운 상호 작용을 제안 eaks (도 8). 우리는 크기 배제 크로마토 그래피 (20)의 공동 면역와 공동으로 마이그레이션하여이 상호 작용을 확인했다. 계층 적 클러스터링 디스턴스 메트릭 계산의 선택은 클러스터 따라서 상관의 형태에 영향을 미칠 것이다. 우리는 단백질 또는 관심의 복잡한의 기존 상호 작용의 지식을 가진 가장 적합한을 달성하기 위해 서로 다른 측정 실험을하는 것이 좋습니다. 일반적으로 우리는 맨하탄 (L1)의 거리 메트릭 (20)에 최적의 결과를 달성했다. 피어슨 상관 또는 유클리드 거리 메트릭은 다른 분류 기법 10, 11, 12에 기초하여 복합체를 식별하기 위해보고되었다. 관음청색 기본 분획으로부터 수득 titative MS 데이터는 단백질 복합체의 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다. iBAQ (강도 계 절대 정량) 값은 식별 된 단백질 (27), (28)의 상대적인 풍부함의 측정치를 제공한다. 마이그레이션 프로파일 내의 모든 피크 분획에서의 단백질의 복합 부재 iBAQ 값은 상대적인 양을 얻기 베이트 단백질의 정규화된다. 주어진 단백질 복합체 부재의 프로파일 피크 걸쳐 정규화 iBAQs 수평 흐름을 따라야하고, 그래프 값 미끼 단백질에 대해 상호 작용하는 단백질의 화학량 론을 반영한다. 화학량 론 계산의 더 상세한 표현, 20 참조. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> 도 7 : 도식 플로 요약 ABC-MS의trategy. 이는도 20에서 수정된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> MTA2의 인터랙의 BN-PAGE 이전 프로파일도 8 계층 클러스터링. MTA2 관련 단백질은 자신의 마이그레이션 프로필의 유사성에 따라 클러스터했다. 오직 NuRD 착체를 함유하는 가열 - 맵의 서브 세트 (파란색 상자 묶인) 도시되어있다. 노란색 상자가 NuRD 단지와 Wdr5의 강한 상관 관계를 강조한다. 주석 분자량이 같은 젤에서 실행 단백질 표준의 이동 거리에서 추정되었다. 이 연구는 원래 생화학 및 모 20 미국 사회 분자 세포 프로테오믹스에 발표 된<html> lecular 생물학. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> NuRD 소단위와 관련된 단백질도 9 BN-PAGE 이전 단면도. A) 동일한 강도의 패턴으로 존재하고 MTA2 NuRD 소단위. B) 상기 역 강도 패턴 MTA2 및 NuRD 소단위. 오직 고 분자량 NuRD 엔티티에 존재하는 C) 및 MTA2 Cdk2ap1. 주석 분자량은 단백질 표준의 마이그레이션 프로필에서 추정되었다. 이 연구는 원래 분자 세포 프로테오믹스 (20) 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회에 출판되었다.&quot;_blank&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="보충 파일" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> 보충 자료 : 샘플 데이터 세트. ABC-MS 실험에서 단백질 동정 및 정량 값을 포함 proteingroups.txt 파일 MaxQuant 유래. 이 연구는 원래 분자 세포 프로테오믹스 (20) 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회에 출판되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

본 실험 전략의 전반적인 목표는 친화성 정제된 단백질 복합체의 blue native polyacrylamide gel electrophoresis 분획화 및 질량 분석 상관 프로파일링을 통해, 단백질이 관여할 수 있는 서로 다른 기능적 어셈블리를 규명하는 것입니다. 이 방법은 친화성 정제 질량 분석 실험으로 생성된 단백질 목록에 조직적 정보를 추가하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 수행하기가 간단하고 분해능이 좋으며, 일반적인 gel CMSMS보다 작업량이 조금 더 많을 뿐이라는 점입니다.이 프로토콜은 FLAG 태그가 부착된 단백질을 내인성 수준으로 발현하는 2억에서 5억 개의 세포로부터 단백질 복합체를 정제하는 데 최적화되었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 펠렛을 해동한 후, DTT와 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 5 mL를 세포 현탁액에 넣고 부드럽게 섞어줍니다. 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.세포 현탁액을 차가운 다운 호모게나이저(down homogenizer)로 옮깁니다. 촘촘한 페스틀을 사용하여 눈에 띄는 점성이 사라질 때까지 20~30회 스트로크하여 세포를 용해한 후, 균질화물을 차가운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리한 후, 약 50 µL의 용해물을 남기고 맑게 정제된 용해물을 깨끗하고 차가운 튜브로 옮깁니다.단백질 농도를 측정하고 정제 과정을 모니터링하기 위해 용해물 35 µL를 별도로 보관합니다. 다음으로, 이전에 준비한 비즈에서 버퍼를 제거합니다. 비즈를 용해물 1 mL로 재현탁한 후, 나머지 용해물과 혼합합니다.혼합물을 4°C의 회전 휠에서 1~2시간 동안 배양하십시오. 자석을 사용하여 튜브 벽면에 비드를 모으십시오. 상층액 30 µL를 분취하여 수집하고 나머지는 버리십시오.피펫팅을 4~6회 실시하여 비드를 0.5 milliliters의 IPP150 buffer에 재현탁합니다. 그 다음, 현탁액을 1.5 milliliter 냉각 튜브로 옮깁니다. 이어서 0.5 milliliters의 FLAG elution native buffer로 비드를 3회 세척합니다.마지막 세척 후, 비드를 새로운 냉각 튜브로 옮깁니다. 완충액을 완전히 제거합니다. native 용출 완충액에 녹인 200 micrograms per milliliter 3X5 펩타이드 100 microliters에 비드를 재현탁합니다.그 후, 부드럽게 회전시키며 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 자석을 사용하여 비즈를 수집하고, 상층액을 새로운 냉각 튜브로 옮깁니다. 모든 용출액을 회수하기 전까지 이 단계를 두 번 반복합니다.원심분리 필터 유닛을 사용하여 4°C에서 10,000 ×g로 원심분리하여 용출액을 25 µL까지 농축합니다. 농축된 25 µL의 용출액에 4X native 샘플 로딩 버퍼와 0.5% G-250 샘플 첨가제를 넣어 샘플을 준비합니다. 샘플과 native 분자량 마커를 로딩하되, 그 사이에 빈 웰을 하나 둡니다.그 다음, 비어 있는 모든 웰에 10~20 µL의 1X native 샘플 로딩 버퍼를 로딩합니다. 샘플이 흐트러지지 않도록 주의하며 음극 챔버에 200 mL의 1X native PAGE dark blue 음극 버퍼를 채웁니다. 양극 챔버에는 550 mL의 1X native PAGE 양극 버퍼를 채웁니다.젤을 150V에서 30분 동안 전기영동합니다. 작동을 멈춘 후, 세롤로지컬 피펫으로 진한 파란색 음극 완충액을 제거하고 1X 연한 파란색 음극 완충액으로 교체합니다. 60분 동안 추가로 전기영동한 후, 젤 카세트를 열고 카세트 플레이트 중 하나를 폐기합니다.겔은 다른 카세트 플레이트에 부착된 상태로 유지됩니다. 겔을 충분히 덮을 수 있는 양의 고정액이 담긴 트레이에 넣고, 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 그 후, 고정액을 제거하고 물로 교체한 다음 겔을 스캔합니다.질량 분석법을 준비하기 위해, 먼저 폐액을 수집할 수 있도록 다른 96-웰 플레이트 위에 원추형 바닥 96-웰 플레이트를 올려놓습니다. 21 gauge 바늘을 사용하여 원추형 바닥 96-웰 플레이트의 웰 바닥을 뚫습니다. 그 다음, 구멍이 뚫린 플레이트의 웰에 200 µL의 50% acetonitrile, 0.25% formic acid를 첨가합니다.플레이트 스택을 쉐이커에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 액체가 구멍을 통해 폐액 수집 플레이트로 흐르도록 플레이트를 500 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 세척 단계를 2회 반복한 후, 구멍이 뚫린 96 웰 플레이트의 각 웰에 150 µL의 50 mM 중탄산암모늄을 채웁니다.다음으로, 겔을 깨끗한 표면에 놓습니다. 샘플이 포함된 레인을 48개의 동일한 조각으로 자릅니다. 겔 상단의 마지막 5개 조각을 제외하고, 각 조각을 2~3개의 더 작은 조각으로 나눕니다.각 슬라이스를 구멍이 뚫린 끝단이 세척된 96-웰 플레이트의 웰에 순차적으로 넣습니다. 각 웰에 50 µL의 acetonitrile을 첨가하고 플레이트를 흔들어 30분에서 60분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 액체를 제거한 후, 각 웰에 2 mM TSEB와 50 mM ammonium bicarbonate 200 µL를 첨가합니다.플레이트를 상온에서 30분 동안 흔들어 배양한 후, 이전과 같이 원심분리를 통해 액체를 제거합니다. 200 µL의 순수 아세토니트릴을 첨가하여 겔 조각을 탈수시키고, 겔 조각이 하얗고 불투명해질 때까지 상온에서 20분 동안 흔들어 배양합니다. 아세토니트릴을 제거한 후, 각 웰에 차가운 중탄산암모늄에 희석된 트립신 150 µL를 첨가합니다.플레이트를 37°C에서 2시간 동안 진탕 배양합니다. 그다음, 젤이 포함된 플레이트 아래에 깨끗한 원추형 바닥 플레이트를 놓고 플레이트의 방향이 올바른지 확인합니다. 이어서 200 ×g에서 1분간 원심분리하여 펩타이드가 포함된 액체를 수집합니다.펩타이드가 포함된 플레이트를 원심 증발기에 넣고 다음 단계를 수행하는 동안 액체를 증발시킵니다. 겔 조각에 50% acetonitrile, 0.25% formic acid 150 µL를 첨가합니다. 37 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.200 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 부분적으로 건조된 플레이트에 액체를 모읍니다. 다음 단계를 수행하는 동안 펩타이드가 포함된 플레이트의 증발을 계속합니다. 펩타이드 용액을 세척된 원심 여과 플레이트로 옮깁니다.펩타이드를 수집하기 위해 그 아래에 깨끗한 원뿔형 바닥 플레이트를 배치하고, 이전과 동일하게 플레이트 스택을 원심 분리합니다. 원뿔형 바닥 플레이트 내의 액체가 완전히 마를 때까지 증발시킵니다. 건조가 완료되면, 텍스트 프로토콜에 기술된 질량 분석 및 데이터 분석을 수행할 때까지 플레이트를 실리콘 리드로 덮어 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.Mta2 및 공정제 단백질의 blue native PAGE 이동 프로파일을 계층적 군집 분석한 대표적 결과가 단백질 강도를 나타내는 덴드로그램과 히트맵으로 여기에 제시되어 있습니다. Mta2의 이동 프로파일은 두 개의 서로 다른 복합체를 나타내는 두 개의 피크를 보여줍니다. 일부 NuRD 하위 단위들은 저분자량 어셈블리에서 가장 높은 함량을 보이는 유사한 패턴을 나타냅니다.반면, 다른 NuRD 서브유닛들은 더 높은 분자량의 NuRD 복합체에 더 많이 포함되어 있습니다. 한편, Mta2 상호작용 단백질인 Cdk2ap1은 더 높은 분자량의 NuRD 복합체에만 존재합니다. 숙련되면 이 기술은 2.5일 만에 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 단백질 복합체의 해리를 방지하기 위해 모든 시료와 시약을 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차는 천연 조건(native conditions)에서 경쟁적 용출(competitive elution)을 통해 친화성 매질로부터 관찰 가능한 모든 표적 단백질에 적용될 수 있습니다. 본 절차 이후, 확인된 하위 복합체를 검증하기 위해 역-공침강(reverse co-immunoprecipitation) 또는 순차적 공침강(sequential co-immunoprecipitation)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

학습하세요 블루 네이티브 PAGE와 단백질 상관 관계 프로파일링을 이용한 친화력 정제 단백질 복합체 분석 방법을. 이 기술은 질량 분석법을 통해 단백질 상호작용 데이터의 해상도를 높여줍니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

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