블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

본 실험 전략의 전반적인 목표는 친화성 정제된 단백질 복합체의 blue native polyacrylamide gel electrophoresis 분획화 및 질량 분석 상관 프로파일링을 통해, 단백질이 관여할 수 있는 서로 다른 기능적 어셈블리를 규명하는 것입니다. 이 방법은 친화성 정제 질량 분석 실험으로 생성된 단백질 목록에 조직적 정보를 추가하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 수행하기가 간단하고 분해능이 좋으며, 일반적인 gel CMSMS보다 작업량이 조금 더 많을 뿐이라는 점입니다.

이 프로토콜은 FLAG 태그가 부착된 단백질을 내인성 수준으로 발현하는 2억에서 5억 개의 세포로부터 단백질 복합체를 정제하는 데 최적화되었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 펠렛을 해동한 후, DTT와 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 5 mL를 세포 현탁액에 넣고 부드럽게 섞어줍니다. 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

세포 현탁액을 차가운 다운 호모게나이저(down homogenizer)로 옮깁니다. 촘촘한 페스틀을 사용하여 눈에 띄는 점성이 사라질 때까지 20~30회 스트로크하여 세포를 용해한 후, 균질화물을 차가운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리한 후, 약 50 µL의 용해물을 남기고 맑게 정제된 용해물을 깨끗하고 차가운 튜브로 옮깁니다.

단백질 농도를 측정하고 정제 과정을 모니터링하기 위해 용해물 35 µL를 별도로 보관합니다. 다음으로, 이전에 준비한 비즈에서 버퍼를 제거합니다. 비즈를 용해물 1 mL로 재현탁한 후, 나머지 용해물과 혼합합니다.

혼합물을 4°C의 회전 휠에서 1~2시간 동안 배양하십시오. 자석을 사용하여 튜브 벽면에 비드를 모으십시오. 상층액 30 µL를 분취하여 수집하고 나머지는 버리십시오.

피펫팅을 4~6회 실시하여 비드를 0.5 milliliters의 IPP150 buffer에 재현탁합니다. 그 다음, 현탁액을 1.5 milliliter 냉각 튜브로 옮깁니다. 이어서 0.5 milliliters의 FLAG elution native buffer로 비드를 3회 세척합니다.

마지막 세척 후, 비드를 새로운 냉각 튜브로 옮깁니다. 완충액을 완전히 제거합니다. native 용출 완충액에 녹인 200 micrograms per milliliter 3X5 펩타이드 100 microliters에 비드를 재현탁합니다.

그 후, 부드럽게 회전시키며 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 자석을 사용하여 비즈를 수집하고, 상층액을 새로운 냉각 튜브로 옮깁니다. 모든 용출액을 회수하기 전까지 이 단계를 두 번 반복합니다.

원심분리 필터 유닛을 사용하여 4°C에서 10,000 ×g로 원심분리하여 용출액을 25 µL까지 농축합니다. 농축된 25 µL의 용출액에 4X native 샘플 로딩 버퍼와 0.5% G-250 샘플 첨가제를 넣어 샘플을 준비합니다. 샘플과 native 분자량 마커를 로딩하되, 그 사이에 빈 웰을 하나 둡니다.

그 다음, 비어 있는 모든 웰에 10~20 µL의 1X native 샘플 로딩 버퍼를 로딩합니다. 샘플이 흐트러지지 않도록 주의하며 음극 챔버에 200 mL의 1X native PAGE dark blue 음극 버퍼를 채웁니다. 양극 챔버에는 550 mL의 1X native PAGE 양극 버퍼를 채웁니다.

젤을 150V에서 30분 동안 전기영동합니다. 작동을 멈춘 후, 세롤로지컬 피펫으로 진한 파란색 음극 완충액을 제거하고 1X 연한 파란색 음극 완충액으로 교체합니다. 60분 동안 추가로 전기영동한 후, 젤 카세트를 열고 카세트 플레이트 중 하나를 폐기합니다.

겔은 다른 카세트 플레이트에 부착된 상태로 유지됩니다. 겔을 충분히 덮을 수 있는 양의 고정액이 담긴 트레이에 넣고, 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 그 후, 고정액을 제거하고 물로 교체한 다음 겔을 스캔합니다.

질량 분석법을 준비하기 위해, 먼저 폐액을 수집할 수 있도록 다른 96-웰 플레이트 위에 원추형 바닥 96-웰 플레이트를 올려놓습니다. 21 gauge 바늘을 사용하여 원추형 바닥 96-웰 플레이트의 웰 바닥을 뚫습니다. 그 다음, 구멍이 뚫린 플레이트의 웰에 200 µL의 50% acetonitrile, 0.25% formic acid를 첨가합니다.

플레이트 스택을 쉐이커에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 액체가 구멍을 통해 폐액 수집 플레이트로 흐르도록 플레이트를 500 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 세척 단계를 2회 반복한 후, 구멍이 뚫린 96 웰 플레이트의 각 웰에 150 µL의 50 mM 중탄산암모늄을 채웁니다.

다음으로, 겔을 깨끗한 표면에 놓습니다. 샘플이 포함된 레인을 48개의 동일한 조각으로 자릅니다. 겔 상단의 마지막 5개 조각을 제외하고, 각 조각을 2~3개의 더 작은 조각으로 나눕니다.

각 슬라이스를 구멍이 뚫린 끝단이 세척된 96-웰 플레이트의 웰에 순차적으로 넣습니다. 각 웰에 50 µL의 acetonitrile을 첨가하고 플레이트를 흔들어 30분에서 60분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 액체를 제거한 후, 각 웰에 2 mM TSEB와 50 mM ammonium bicarbonate 200 µL를 첨가합니다.

플레이트를 상온에서 30분 동안 흔들어 배양한 후, 이전과 같이 원심분리를 통해 액체를 제거합니다. 200 µL의 순수 아세토니트릴을 첨가하여 겔 조각을 탈수시키고, 겔 조각이 하얗고 불투명해질 때까지 상온에서 20분 동안 흔들어 배양합니다. 아세토니트릴을 제거한 후, 각 웰에 차가운 중탄산암모늄에 희석된 트립신 150 µL를 첨가합니다.

플레이트를 37°C에서 2시간 동안 진탕 배양합니다. 그다음, 젤이 포함된 플레이트 아래에 깨끗한 원추형 바닥 플레이트를 놓고 플레이트의 방향이 올바른지 확인합니다. 이어서 200 ×g에서 1분간 원심분리하여 펩타이드가 포함된 액체를 수집합니다.

펩타이드가 포함된 플레이트를 원심 증발기에 넣고 다음 단계를 수행하는 동안 액체를 증발시킵니다. 겔 조각에 50% acetonitrile, 0.25% formic acid 150 µL를 첨가합니다. 37 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.

200 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 부분적으로 건조된 플레이트에 액체를 모읍니다. 다음 단계를 수행하는 동안 펩타이드가 포함된 플레이트의 증발을 계속합니다. 펩타이드 용액을 세척된 원심 여과 플레이트로 옮깁니다.

펩타이드를 수집하기 위해 그 아래에 깨끗한 원뿔형 바닥 플레이트를 배치하고, 이전과 동일하게 플레이트 스택을 원심 분리합니다. 원뿔형 바닥 플레이트 내의 액체가 완전히 마를 때까지 증발시킵니다. 건조가 완료되면, 텍스트 프로토콜에 기술된 질량 분석 및 데이터 분석을 수행할 때까지 플레이트를 실리콘 리드로 덮어 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

Mta2 및 공정제 단백질의 blue native PAGE 이동 프로파일을 계층적 군집 분석한 대표적 결과가 단백질 강도를 나타내는 덴드로그램과 히트맵으로 여기에 제시되어 있습니다. Mta2의 이동 프로파일은 두 개의 서로 다른 복합체를 나타내는 두 개의 피크를 보여줍니다. 일부 NuRD 하위 단위들은 저분자량 어셈블리에서 가장 높은 함량을 보이는 유사한 패턴을 나타냅니다.

반면, 다른 NuRD 서브유닛들은 더 높은 분자량의 NuRD 복합체에 더 많이 포함되어 있습니다. 한편, Mta2 상호작용 단백질인 Cdk2ap1은 더 높은 분자량의 NuRD 복합체에만 존재합니다. 숙련되면 이 기술은 2.5일 만에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 단백질 복합체의 해리를 방지하기 위해 모든 시료와 시약을 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차는 천연 조건(native conditions)에서 경쟁적 용출(competitive elution)을 통해 친화성 매질로부터 관찰 가능한 모든 표적 단백질에 적용될 수 있습니다. 본 절차 이후, 확인된 하위 복합체를 검증하기 위해 역-공침강(reverse co-immunoprecipitation) 또는 순차적 공침강(sequential co-immunoprecipitation)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.