Name: IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델 In Vivo 염증 반응의 장기 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 생체 발광 영상을 이용해 마우스 폐 염증을 비침습적으로 실시간 모니터링하는 방법을. 동일한 동물을 반복적으로 관찰하여 호스트-병원체 상호작용을 장기간 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 이탈리아 낭성 섬유증 재단 프로젝트 FFC # 18 / 2013, FFC # 29 / 2015 및 Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus를 통한 이탈리아 낭포 성 섬유종 연맹의 지원을 받았습니다.

기술 된 모든 동물 실험은 베로나 대학 (University of Verona)의 실험 연구 서비스 센터 (Interdepartmental Center of Experimental Research Service)의 동물 실험을위한 동물 실험을위한 교내 동물 복지위원회의 승인을 받았으며, European Directive 2010/63 UE, Italian D.Lgs 26/2014 및 개정 된 &quot;실험실 동물의 관리 및 사용 안내서&quot;, 워싱턴 DC : National Academy Press, 1996.이 프로토콜과 실험은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (n 273/15)의 승인을 받았습니다. 동물들은 표준 설치 동물과 연화 된 수돗물에 자유롭게 접근 할 수 있었으며 지역의 사료 조건 (실내 온도 : 20-24 ℃, 상대 습도 : 40-70 %, 명암주기 : 12 시간)에 적어도 5 일 동안 순응했다 ). 1. 생체 내 유전자 전달 <ol><li> 생체 내 전달 시약 / 핵산 복합체를 준비하려면 층류 후드를 사용하십시오. </li><li> 실험 프로토콜 정의하기제조업체의 생체 내 지시에 따라 매개 변수를 변경합니다. <ol><li> 마우스 당 복합체 200 μL의 총 주입량을 사용하십시오. </li><li> 내 독소가없는 물에 현탁 된 40 μg의 DNA로 시작하십시오. 최적화 범위는 60 μg에 달할 수 있습니다. 참고 : 주입량에서 핵산의 최종 농도는 제조자의 지침에 따라 0.5 μg / μL를 초과해서는 안됩니다. </li><li> N / P 비는 6 - 8 (핵산 1 g 당 0.12 - 0.16 μL의 전달 시약)을 사용하십시오. 배달 시약의 해당 볼륨을 계산합니다. 참고 : 복합체는 효과적인 세포 진입을 위해 양이온 성이어야합니다. N / P 비는 핵산 인산염 (P) 당 생체 내 전달 시약의 질소 잔류 물 (N)의 수로 정의되며 복합체 내의 이온 균형의 척도를 나타냅니다. </li></ol></li><li> 5 % 포도당 (최종 농축 물)에서 계산 된 양의 핵산을 희석한다 (단계 1.2.1 참조)10 % 포도당 스톡 용액 (제공)과 멸균 수를 사용하여 배양한다. 희석 볼륨이 최종 주입 볼륨의 절반인지 확인하십시오. 부드럽게 소용돌이 치거나 위아래로 pipetting하여 섞는다. </li><li> 10 % 포도당 스톡 용액 (제공됨)과 멸균 수를 사용하여 5 % 포도당 (최종 농도)의 주입량의 절반으로 전달 시약의 계산 된 양 (1.2.3 참조)을 희석하십시오. 부드럽게 소용돌이 치며 13,000 xg에서 15 초 동안 스핀하십시오. </li><li> 희석 핵산에 위의 희석 전달 시약을 한꺼번에 첨가하십시오. 부드러운 vortexing하여 그들을 혼합하고 15 초 동안 13,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 실온에서 15 분 동안 1.5 단계에서 혼합물을 품어. 참고 :이 시점부터 복합체는 실온에서 4 시간 동안 안정되고 4 ℃에서 보관하면 최대 7 일 동안 안정합니다. </li><li> 실온에서 평형화 된 복합체를 사용하여 꼬리 정맥 주사를 시행하십시오. 정맥 확장을 위해 30 초 동안 마우스 꼬리를 따뜻한 물 (50 - 53 ° C)에 넣으십시오. <ol><li> 마우스를 제지 장치 안에 놓습니다. 27-30 게이지 바늘을 꼬리 정맥에 20-30 ° 각도로 삽입하고 천천히 200 μL를 주입합니다. 완료되면 바늘을 제거하고 주사 부위에 압력을가하십시오. 참고 : 주입 도중 꼬리 부분이 약간 부풀어 있으면 잘못된 위치를 나타냅니다. 이 경우 바늘을 제거하고 이전 사이트에 근접한 절차를 반복하십시오. </li></ol></li><li> 정맥 주사 후 24 및 48 시간 에 생체 내 BLI (단계 2 참조)를 수행 하여 유전자 발현을 시각화하십시오. </li></ol> 2. In Vivo BLI 참고 : DPBS에 15 mg / mL D-luciferin의 새로운 원액을 미리 준비하고 0.22 μm 필터링 장치를 사용하여 필터 살균 한 후 -20 ° C에 보관하십시오. <ol><li> 맑은 플렉시 유리 마취 챔버에 생쥐를 놓습니다. 이소 플루 란 챔버가 가득 차 있는지 확인하십시오. 동물을 마취 할 준비가되면 펌프 (left) 및 챔버 (오른쪽) 스위치가 켜져 있습니다. isoflurane 다이얼을 유도 용으로 2.5 %, 유지 보수 용으로 2 %로 돌립니다. IVIS 챔버 내부의 동물은 이미지 수집 중에 isofluorane 마취 2.5 % 이하로 유지됩니다. </li><li> 마우스가 완전히 anesthetized 후, 이미징하기 전에 intraperitoneal 경로 15 분 D - luciferin 솔루션 10 ML / kg bodyweight를 주입하십시오. 참고 : D - luciferin의 운동 후 신호 피크의 시간을 결정하기 위해 D - luciferin에 대한 운동 연구가 수행되어야합니다. </li><li> 생체 내 이미징 시스템을 열고 검정 cardstock (완료시 폐기) 조각으로 줄 지어 이미지 챔버를 준비합니다. 올바른 마취를 위해 필요에 따라 코 콘을 놓습니다 (마우스 당 하나의 원추체 사용). 참고 : 마취를기구에 공급하는 튜브는 분할되어 동일한 마취 농도가 이미징 시스템 내부에있는 마취 매니 폴드에 연결됩니다. </li><li> b에서 마우스를 옮기십시오 (최대 5 개).황소를 이미징 시스템의 매니 폴드에 부착 된 코 콘에 연결하고 문을 닫습니다. 이미지 수집은 5 분간 지속됩니다. </li><li> 다음과 같이 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 BLI를 획득하십시오. <ol><li> 소프트웨어를 초기화하십시오. 생체 내 이미징 시스템 획득 제어 패널에서 발광 (Luminescent) 옆에 체크 표시를하십시오. Excitation Filter 설정이 Block이고 Emission Filter 설정이 Open인지 확인하십시오. </li><li> 화살표를 클릭하십시오 : 발광 이미징 모드의 경우 5 분 노출 시간, Binning 8 및 F / Stop 1을 선택하십시오. 사진 이미징 모드에서 Binning 4 및 F / stop 8을 선택하십시오. </li><li> 필드보기 드롭 다운 목록에서 D, 19 cm 및 제목 높이 1.5 cm를 선택합니다. 이미지를 수집 할 준비가되면 획득을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 이미지 수집이 완료되면 마우스를 다시 새장에 넣습니다. </li><li> 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 특정 지역에서 방출되는 광자를 정량화하십시오. <ol><li> 딸깍 하는 소리 <strong&gt; ROI 도구 팔레트의 도구. ROI 도구 의 유형 드롭 다운 목록에서 측정 ROI 를 선택합니다. </li><li> 사각형 아이콘을 클릭하고 한 동물의 흉부를 덮을 적절한 크기의 제곱 된 ROI를 그립니다. 각 동물에 대한 ROI를 복사하여 붙여 넣어 같은 크기의 ROI를 얻으십시오. ROI 도구 패널에서 ROI 측정을 클릭하여 ROI 의 전체 강도를 측정합니다. </li><li> 세션 동안 이미지 또는 시퀀스에서 생성 된 모든 ROI (ROI 당 ROI)에 대한 ROI 측정 데이터를 관찰합니다. 내보내기를 클릭하고 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 프로 염증성 자극으로 마우스 챌린지 참고 : 친 염증성 자극으로 마우스를 공격하기 전에 생체 내 BLI로 기준 활성을 확인하십시오 (2 단계 참조). in vivo 유전자 전달과 mous 사이 에 최소 7 일이 경과해야합니다.경미하고 일시적인 염증이 사라지도록 도전하십시오. <ol><li> 기관 삽관을위한 장비를 준비하십시오 ( 그림 1 및 그림 2 참조 ). <ol><li> 스프링 (C, E), 100 μL 주사기 (B) 및 일회용 게이지 (D)가있는 5 ml 일회용 주사기를 3 방향 멈춤 쇠 (A)에 연결하십시오. 시스템을 지지대 (H) 위에 놓습니다. 시스템을 지지대 (H) 위에 놓습니다. </li><li> PE190 마이크로 의료용 튜브 (F)를 일회용 게이지 (D)와 펜 세기 (G)에 연결하십시오. </li><li> 공기 800 μL로 5 ML 주사기를 채우고 3 방향 stopcock을 돌려. 참고 : 100 μl 주사기에 50 μl aspirating하여 Pseudomonas aeruginosa 문화 뜨는로 튜브를 채 웁니다 . </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig1.jpg" /> 그림 1 : 도식적 인 Represe기관 내 단일 장치 구성. (A) 3 방향 스톱 콕, (B) 100 μL 해밀턴 주사기, (C) 일회용 5 mL 주사기, (D) 일회용 게이지, (E) 스프링이 달린 일회용 5 mL 주사기, , (G) 펜 세기, (H) 지원. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig2.jpg" /> 그림 2 : 조립 된 기관 내 장치의 표현. ID는 그림 1 과 동일합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig2large.jpg" target="_blank">클릭하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="2"><li> 산소와 혼합 2.5 % isoflurane에 설정된 isoflurane 기화기 챔버를 사용하여 마우스를 마취. </li><li> 3 ~ 5 분 후 마취의 효과를 평가하기 위해 동물을 모니터링하십시오. 참고 : 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하려면 조심스럽게 다음 징후를 모니터링하십시오. 호흡 속도가 느려야하고, 목에 걸릴 때 팔이 늘어나지 않고 뒷다리가 자극을받을 때 반응이 부족해야합니다. 이러한 기준을 충족하지 못하면 다음 단계로 진행하기 전에 몇 분 정도 기다렸다가 다시 확인하십시오. </li><li> 마취 된 마우스를 플렉시 유리 삽관 플랫폼에 놓고 전치부에 걸고 와이어 위에 놓습니다. </li><li> 왼쪽 손으로 후두경을 켜고 (오른 손잡이 연구자 용) 뭉툭한 끝이 나는 포 셉을 잡으십시오. 후두 팁과 집게를 사용하여 부드럽게 입을 벌리십시오. </li><li> 혀를 당기고 h포 셉를 사용하는 측면에 오래 된. 후두쪽으로 칼날을 가이드하십시오. 후두경을기도가 열릴 때까지 90 ° 각도로 매우 가볍게 누르십시오. 후두경을 제자리에 잡습니다. </li><li> 다른 손을 사용하여 전달 튜브를 PE 튜브 끝에 연결하여 그것을 기관으로 삽입하십시오. 세 방향 밸브를 돌려 접종원을 전달하십시오. 튜브를 가능한 한 빨리 기관에서 꺼내십시오. 폐에 흡입 할 수있는 접종 물이 생길 때까지 마우스를 몇 초 동안 똑바로 세웁니다. 참고 :기도가 너무 오래 막히면 마우스가 질식하고 사망합니다. </li><li> 플랫폼에서 마우스를 제거하십시오. 회복 시간은 긴장에 따라 다를 수 있습니다. 수술 후 30 분 이내에 동물이 완전히 깨어 있도록 마우스를 부지런히 관찰하십시오. </li><li> Intraperitoneally 150 MG / kg D - luciferin을 주사하고 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 폐를 이미지 4, 24, 48 시간 후 기관지자극의 점적. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 특정 지역에서 방출되는 광자를 정량화하십시오. </li></ol>

<ol><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+to+asthma-chronic+obstructive+pulmonary+disease+overlap+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).</li>
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<li>Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+in+cystic+fibrosis%3A+pathogenesis+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies.</a> Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).</li>
<li>Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+anti-inflammatory+therapeutics+in+asthma+and+chronic+obstructive+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease.</a> Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).</li>
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<li>Cacalano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+B+cell+expansion+in+mice+that+lack+the+murine+IL-8+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog.</a> Science. 265 (5172), 682-684 (1994).</li>
<li>Simonet, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+impaired+neutrophil+migration+in+mice+overexpressing+human+interleukin-8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8.</a> J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).</li>
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<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+lung+inflammation+in+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice.</a> J Transl Med. 14 (1), 226(2016).</li>
<li>De Simone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genetic+background+influences+the+response+to+the+opportunistic+Pseudomonas+aeruginosa+infection+altering+cell-mediated+immunity+and+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication.</a> PLoS One. 9 (9), e106873(2014).</li>
</ol>

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이전 연구 11 에서 bIL-8-Luc 의존성 BLI와 BAL 마커 사이의 대조가 나타났다. 그것은 마우스 균주 내 민감도 차이에 의존했다. 이러한 이유 때문에 bIL-8-Luc 모델을 다른 마우스에 처음 적용하기 위해서는 BLI와 표준화 된 염증 표지자 모두에서 염증 반응에 대한 초기 연구가 필요합니다. 마우스 transfection은 경미한 폐 염증과 DNA 주입 후 3 ~ 4 일까지 BLI가 검출 할 수있는 bIL-8-Luc의 활성화를 유발합니다 ( 그림 4 ). 그런 다음 1 주일 후에 완전히 사라집니다. 유전자 전달 후 bIL-8-Luc의 발현은 생체 내 BLI에 의해 검증되어야하는데, 이는 다음 실험 단계의 성공을위한 필수 조건이기 때문입니다. 7 일 및 마우스 챌린지 이전에 기준선 활성화를 conf에 기록해야합니다형질 감염에 의해 유발 된 염증의 소멸을 확인하십시오. ...

천식, 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD), 낭포 성 섬유증 (CF) 및 기관지 확장증과 같은 만성 폐 질환은기도 염증을 특징으로합니다. 기도 염증은 부종, 세포 침투, T 임파구 및 비만 세포 활성화,기도 분비 증가 및 과도한 콜라겐 침착을 특징으로합니다. CF는 다 체계 장애로 사망률 및 이환율의 주요 원인은 폐 악화의 증가로 인한 폐 세균 감염입니다. 폐 기능의 저하는 결과 1 , 2 , 3 , 4를 예견한다. 호흡기의 염증 상태는 일반적으로 가래와 같은 하부기도와 상부기도로부터 유도 된 물질에서 염증 과정 동안 모집 된 면역 마커의 평가를 통해 관찰되며,ults. 기관지 내시경도 시행됩니다 5 . Murine 모델은기도 염증으로 특징 지어지는 질병의 발병 기전과 진화를 조사하고 효과적인 치료법이나 치료법이 아직 밝혀지지 않은 유용한 도구입니다. 폐 감염과 염증의 동물 모델은 천식과 숙주 - 병원체 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다. 예를 들어, 인간의 상태 ( 예 : 담배 연기 노출, LPS, 엘라 스타 제, 오발 부민, 폴리 I : C 등 )를 모방하는 화학 물질의 역할 물론 위의 조합으로) 6 . 염증 관련 매개 변수를 측정하려면 박테리아 부하, 폐의 사이토 카인 및 기관지 폐포 세척액 (BAL)과 같은 요인을 측정하기 위해 침입 접근이 필요하므로 동물을 희생해야합니다. 또한 조직 검사가 종종 필요합니다. 염증 반응 속도론에 대한 정보를 얻을 수있는 가능성은 num쥐. 따라서 동물을 희생 할 필요없이 이러한 정보를 얻을 수있는 기술은 기술적, 윤리적, 경제적 및 운영상의 기반에 가치가 있습니다. IL-8은 염증 과정에서 필수적인 역할을하며 백혈구를 염증 조직에 모집합니다. 그것은 염증 경로 활성화 연구를위한 분자 판독 값을 나타냅니다. MIP-2 및 KC는 마우스에서 인간 IL-8의 기능 상 동체 일 수있다. 마우스는 단지 하나의 가능한 IL-8 수용체, 인간 CXCR2 7,8 의 동족체를 발현하지만, 이들은 리포터 유전자를 유도하는 이종 IL-8 유전자 프로모터를 조절할 수있다. 폐 염증 쥐 모델은 소 IL-8 프로모터 / 루시퍼 라 아제 리포터 구조물이 마우스에서 트랜스 활성화 될 수 있다는 관찰 후에 최근에 개발되었다. 이 기능을 통해 생체 내 이미징 (BLI)을 통해 생체 내 염증 반응을 모니터링 할 수 있습니다.nimals 9 . 이 모델은 세균 exoproducts ( 예 : LPS 또는 세균성 균주에 의해 방출 된 제품) 또는 TNFα 10,11에 의해 유발 된 염증을 연구하기 위해 채택되었습니다. 약물 발견 과정은 CF, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 폐 질환을 치료할 수있는 새로운 항 염증 분자의 개발 및 최적화에 중점을두고 있습니다. 이 새로운 화학 물질은 똑똑한 임상 시험의 설계를 용이하게하기 위해 특정 임상 표현형과 연결될 수있는 동물 모델에서 신속하고 편리하게 시험되어야합니다.

<table><tbody><tr><td>FMT 2500 형광 단층 촬영 시스템</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>실험용 빌더</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina serie II 전임상 In Vivo; 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>실험용 빌더</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 750 FAST</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10001EX</td><td>빛으로부터 보호하고 프로브를 4°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>암컷 근친 교배 BalbC</td><td>Harlan Laboratories Italy</td><td></td><td>사용하기 전에, 동물들은 적어도 5 일 동안 현지 사육 조건</td></tr><tr><td>bIL-8-Luc 플라스미드</td>에 순응했다 이탈리아 <td>파르마</td><td></td> 대학교 수의학과 플라<td>스미드를 -20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>pGL3basic vector</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>벡터를 -20 &deg로 저장합니다. C</td></tr><tr><td>JetPEI DNA 형질주입 시약</td><td>Polyplus 형질주입</td><td>201B-001G</td><td>DNA와 JetPEI 혼합물은 7</td></tr><tr><td>D-루시페린 칼륨염 1 g</td><td>Perkin Elmer Inc.</td>의 최종 N/P 비율로 공식화되었습니다.<td>122796</td><td>빛으로부터 보호하고 -20°C에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Living Image 소프트웨어</td><td>Caliper Life Sciences,Experimental</td> <td>Builder</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Cytokine Assay Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>M60-009RDPD</td><td>를 흡입하지 마십시오. C</td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>Penn-century model DP-4M Dry power insufflator</td><td>Penn-century</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>가스 마취 시스템 XGI-8</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>PE190 마이크로 의료 튜브</td><td>2biological instruments snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>바늘 없는 주사기 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>가위로 피스톤 보드 자르기</td></tr><tr><td>Hamilton 0,10 mL (모델 1710)</td><td>Gastight</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-way Stopcock</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>Syringe with needle 1 mL</td><td>Pic 용액</td><td>3,071,260,300,320</td><td>바늘 없이 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 공급 튜브 18ga x 50 mm</td><td>2biological instruments snc</td><td>FTP-18-50</td><td>팁을 비스듬히 자릅니다&nbsp;</td></tr></tbody></table>

il-8 transiently transgenized 마우스 모델<em&gt; in vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

기도 염증은 세균 감염과 관련이 있으며 폐 질환의 주요 결정 인자입니다. 여러 요인의 염증 유발 능력을 생체 내에서 측정하는 것은 어려우며 기관지 폐포 세척 및 동일 장소 에서 종양 시각화를 배제한 현장 분석을위한 폐 제거와 같은 말단 절차가 필요합니다. 여기에서, 폐 염증은 이종 IL-8 bovine promoter의 조절하에 루시퍼 라 아제 리포터 유전자를 발현하는 transiently transgenized mice에서 Pseudomonas aeruginosa 배양 상등액 (SN)의 기관 내 점적을 통해 유도된다. 폐에서의 루시퍼 라제 발현은 점안 후 2.5-48 시간의 시간대 에 생체 내 생물 발광 이미지 (BLI) 분석에 의해 모니터링된다. 이 절차는 2 ~ 3 개월 이내에 여러 번 반복 할 수 있으므로 동일한 마우스에서 염증 반응을 평가할 수 있습니다동물을 해산 할 필요가있다. 이 접근법은 실시간으로 폐에서 작용하는 항 염증 인자의 모니터링을 허용하며, 기능적 및 약리학 적 연구에 적합하다.

bIL-8-Luc 일시적 형질 전환 마우스 모델은 분비 된 독성 인자를 함유하는 농축 된 박테리아 상등액 (30x)으로 항원 투여 된 마우스에서 폐 염증의 생체 내 모니터링을 위해 사용되었다. 유도 된 염증 반응은 BLI 신호의 증가로서 생체 내 이미징에 의해 검출 가능 하였다. BLI 시그널은 5 시간에서 24 시간 사이 최고 피크에 도달 했음에도 불구하고 프로 염증성 활성이 점안 후 2.5 시간에 명확하게 검출되었으며 48 시간 ( 그림 3 )에서 여전히 검출 가능했습니다. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig3.jpg" /> 도 3 : IL-8 일시적 형질 전환...

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 박테리아 배양 상청액과 같은 염증성 자극제를 이용한 비침습적 유발 후, 마우스의 폐 염증을 실시간으로 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 어떤 박테리아 생성물이 호흡기 감염 질환의 원인이 되는지와 같은 숙주-병원체 상호작용에 관한 구체적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비침습적이라는 점과 동일한 동물을 대상으로 시간에 따라 반복적인 모니터링이 가능하다는 점입니다.설치 단계를 텍스트만으로 학습하기는 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 절차 시연은 제 연구 그룹의 외부 협력자인 Francesca Ruscitti, Angela Sandri, Federico Boschi가 진행합니다. in vivo 유전자 전달을 위해, 먼저 핵산 복합체를 실온으로 가온하십시오.다음으로, 실험 동물의 꼬리를 50~53°C의 온수에 30초 동안 데웁니다. 꼬리 정맥이 확장되면 생쥐를 적절한 보정 장치에 고정시키고, 확장된 꼬리 정맥에 27~30게이지 바늘을 20~30도 각도로 삽입하여 화합물 200$\mu$L를 주입합니다. 전체 용량이 모두 투여되면 바늘을 제거하고 주입 부위를 압박합니다.24~48시간 후, 생체 발광 이미징 15분 전에 완전히 마취된 복합 주입 동물 최대 5마리에게 갓 조제한 D-Luciferin을 kg당 10 milliliters로 복강 내 주사합니다. 인비보 이미징 시스템을 열고 이미징 챔버 안에 검은색 카드지를 넣은 다음 마우스를 이미징 챔버에 넣습니다. 인비보 이미징 시스템 소프트웨어를 실행하고 시스템을 초기화합니다.luminescent 항목 옆에 체크 표시를 하고, excitation filter는 block으로, emission filter는 open으로 설정되었는지 확인하십시오. luminescent 이미징 모드에서는 노출 시간을 5분, binning을 8, F/Stop을 1로 선택하십시오. photograph 이미징 모드에서는 binning을 4, F/Stop을 8로 선택하십시오.시야(field of view) 메뉴에서 19 by 19 cm 면적과 피사체 높이 1.5 cm인 D 시야를 선택하십시오. 모든 파라미터 설정이 완료되면 Acquire를 클릭하여 동물을 촬영합니다. 영상 획득이 끝나면 동물을 케이지로 돌려보내고 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.특정 관심 영역에서 방출되는 광자를 정량화하려면, 이미징 시스템 소프트웨어를 열고 관심 영역 도구를 선택하십시오. 유형 메뉴에서 측정 관심 영역(Measurement Region of Interest)을 선택하고 사각형 도구를 사용하여 동물 한 마리의 흉부 주변에 사각형 관심 영역을 그리십시오. 이 관심 영역을 복사하여 다른 모든 동물에게 붙여넣어 동일한 크기의 관심 영역들을 생성한 다음, 관심 영역 측정(Measure Region of Interest)을 클릭하여 모든 관심 영역의 총 강도를 측정하십시오.그런 다음 Export를 클릭하고 관심 영역(ROI) 측정 데이터가 저장될 폴더를 선택하십시오. 생체 내 유전자 전달 후 최소 7일이 지나면, 5 mL 주사기를 스프링, 100 µL Hamilton 주사기, 일회용 게이지와 함께 3방향 스톱콕(three-way stop cock)에 연결합니다. PE 190 마이크로 의료용 튜브 조각을 일회용 게이지와 펜 센트리 바늘(pen sentry needle)에 연결하십시오.5 mL 시린지에 공기 800 µL를 채웁니다. 스톱콕을 돌려 100 µL 시린지에 상층액을 채워 튜브에서 빨아들인 다음, 마취된 실험용 마우스를 플렉시글라스 삽관 플랫폼에 놓고 절치 부분을 고정하여 동물을 고정합니다. 비우세손으로 후두경을 켜고, 다른 쪽 손으로는 뭉툭한 끝의 포셉과 후두경 팁을 사용하여 입을 조심스럽게 벌립니다.포셉을 사용하여 혀를 옆으로 당기고 후두경 블레이드를 입 뒷부분으로 안내합니다. 기관의 입구가 보일 때까지 후두경을 90도 아래 방향으로 매우 부드럽게 누릅니다. 다른 한 손을 사용하여 PE 튜빙 끝에 연결된 전달 튜브를 기관 내로 삽입하고, 3방향 밸브를 돌려 Pseudomonas aeruginosa 접종액을 투여한 후, 모든 접종액이 투여되는 즉시 튜브를 빠르게 제거합니다.접종물이 폐로 흡입될 수 있도록 마우스를 몇 초 동안 똑바로 세운 자세로 유지합니다. 마지막으로, 접종된 동물에 D-Luciferin 150 milligrams per kilogram을 복강 내 주사하고, 기관 내 자극 설치 후 4, 24, 48시간에 in vivo imaging system으로 폐를 촬영한 뒤 앞서 시연한 대로 광자 정량을 수행합니다. 여기서는 앞서 시연한 대로 분비된 병원성 인자가 포함된 농축 박테리아 상층액으로 자극을 준 bovine interleukin-8 luciferase 일시적 형질전환 BALB/c 마우스의 폐 염증을 실시간 in vivo로 모니터링하기 위해 생물 발광 이미징을 사용하였습니다.유도된 염증 반응은 설치 후 이르면 2.5시간 만에 생물 발광 신호의 증가로 감지되었으며, 광자 방출은 5시간에서 24시간 사이에 정점에 도달하고 자극 후 최소 48시간까지 감지 가능한 상태로 유지되었습니다. 이 절차 이후에는 기관지폐포 세척과 같은 다른 방법을 수행하여 처리 후 생성된 면역 세포의 수와 종류에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 마우스에서 폐 염증을 유도하는 방법과 생물 발광 이미징을 이용하여 이를 체내(in vivo)에서 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

an-il-8-transiently-transgenized-mouse-model-for-vivo-long-term

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

출처 : 슈미츠, K.,  et al., 생쥐의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 이미징. J. Vis. 특급. (2017).이 비디오는 다음을 사용하여 시신경에서 실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE 유발 염증을 시각화하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 생물 발광 이미징. 여기에는 마우스 위치 지정, 시약 주입, 순차적 이미지 캡처를 포함하여 시간 경과에 따른 생물 발광의 변화를 모니터링하는 것이 포함됩니다.

EAE 마우스 모델의 생물 발광 이미징

장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.

쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

여기, 선물이 붙일 레이블된 인간의 자궁내 막 조각 쥐에 투입의 라이브 이미징에 대 한 프로토콜. 메서드를 모니터링을 통해 endometriotic 병 변 크기에 선택의 약의 효과 실시간으로 형광 기자에 의해 방출 되는 형광의 정량화를 공부 하 고 수 있습니다.

궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링

피부 부상에 타고 난 면역 반응의 실시간 탐지 및 쥐의 포도 상 구 균 감염에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 비교 LysM EGFP 여 쥐 (형광 neutrophils 보유) LysM EGFP와 잡종 immunodeficient 마우스 스트레인, 우리가 미리 감염에 대 한 우리의 이해 및 감염을 방지 하는 방법의 개발.

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

배우세요 생체 발광 영상을 이용해 마우스 폐 염증을 비침습적으로 실시간 모니터링하는 방법을. 동일한 동물을 반복적으로 관찰하여 호스트-병원체 상호작용을 장기간 연구할 수 있습니다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델

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