Name: 原子力显微镜检查DNA损伤识别核苷酸切除修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 了解原子力显微镜技术用于研究核苷酸切除修复系统中DNA损伤识别机制的方法。该技术可直接观察修复蛋白与DNA损伤位点的相互作用，为理解DNA修复过程提供重要的分子水平见解。

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PUC19N、含CPD的寡核苷酸以及p44分别由Samuel Wilson、Korbinian Heil和Thomas Carell，以及Gudrun Michels和Caroline Kisker惠赠。本研究工作获得了德国研究基金会（DFG）FZ82和TE-671/4项目基金的支持，资助对象为IT。

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对结合在包含特定靶位点的长DNA片段上的蛋白质结合位置进行原子力显微镜（AFM）统计分析，可以揭示蛋白质识别这些位点所采用的特定策略的有趣细节2,3,4,5,6。为了正确解读所获得的位置分布结果，必须精确知道DNA中靶位点的位置。这可通过将特定序列位点引入环状质粒DNA的已知序列位置，再利用限制性酶切技术切下包含该特定位点的DNA片段来实现。在AFM图像分析蛋白质结合位置时，仅能纳入长度正确的DNA片段（即与切下的完整片段长度一致），因为只有这些片段的靶位点位置是已知的。值得注意的是，此处所述的制备方法产生的是两端无法区分的线性DNA底物。因此，位置分布只能从0 × DNA长度（蛋白质结合于DNA片段末端）到0.5 × DNA长度（蛋白质结合于片段中心）进行测量和绘制。此外，对于未精确位于底物中心的靶位点，这些分布...

原子力显微镜（AFM）是一种用于分析蛋白质-DNA相互作用的有力技术1,2,3,4,5,6,7,8,9仅需少量样品即可在单分子水平上直接观察具有异质性的样品。这种异质性可能源于蛋白质的不同构象状态或寡聚状态。特别是在蛋白质-DNA样品中，蛋白质复合物可能因DNA的结合（无论是非特异性结合还是特异性结合至DNA上的特定靶位点）而呈现出不同的化学计量比和/或构象。异质性样品中还可能包含两种或多种不同类型的蛋白质，以及不同的蛋白质复合物形式例如，由单一类型蛋白质组成的同源复合物与由多种蛋白质组成的异源复合物）与DNA的相互作用方式可能存在差异。本文所讨论的研究利用原子力显微镜（AFM）在空气中对静态、干燥的DNA修复蛋白与含有损伤位点的长片段DNA（约900个碱基对，bp）结合样品进行成像。AFM具有较高的分子分辨率，可区分不同类型的蛋白质复合物，并确定蛋白质在DNA片段上的结合位置。重要的是，DNA底物中的损伤位点被引入至明确的位置。由于DNA中损伤位点的位置已知，因此通过分析蛋白质在DNA上的结合分布，可深入了解（不同）蛋白质复合物对损伤识别的特性差异。 例如，它们对特定类型损伤（相对于未受损DNA）的识别能力如何2,3,4,5,6它们在DNA上的位置还可用于区分特异性结合于损伤位点的蛋白质复合物与非特异性结合于DNA其他区域的复合物。对这两类不同复合物（特异性结合于损伤位点的复合物与非特异性复合物）进行分别表征，可揭示复合物在靶位点识别过程中可能发生的构象变化。
本文重点关注的DNA修复蛋白是负责核苷酸切除修复（NER）通路中损伤识别的解旋酶。在细菌中，NER由UvrA、UvrB和UvrC三种蛋白共同完成。UvrA负责在UvrA₂UvrB复合物中进行初始的损伤识别2UvrB2 DNA扫描复合物。在UvrB确认损伤后，该复合物转变为单体UvrB并结合于损伤位点，这一特异性复合物可进一步招募原核NER内切酶UvrC。UvrC切除包含损伤的短片段单链DNA（ssDNA，12–13 nt）。随后，由DNA聚合酶填补缺失的片段，最后由DNA连接酶将新合成的片段与原始DNA连接起来。9,10在真核生物中，核苷酸切除修复（NER）级联反应的大多数蛋白质属于大型多亚基转录因子IIH（TFIIH）复合物的一部分。在初始损伤识别之后 通过 三聚体CEN2-XPC-HR23B复合物招募TFIIH至DNA靶位点。当复合物内的XPD确认存在NER靶向损伤后，真核NER内切核酸酶XPG和XPF被招募，以切除包含该损伤的短片段（24–32 nt）单链DNA9,10此处特别研究了原核和真核核苷酸切除修复（NER）中的解旋酶UvrB和XPD。这些解旋酶需要DNA中的一个未配对区域（即DNA泡状结构），以便将其加载到两条DNA单链中的一条上，并随后在ATP水解供能下沿该单链进行易位。因此，在底物中除了DNA损伤外，还引入了作为蛋白质加载位点的DNA泡状结构。
特异性损伤DNA底物的制备方法此前已有描述11。该方法需要一个含有两个紧密相邻切刻酶（nickase）识别位点的环状DNA构建体（质粒）。在本研究中，使用了质粒pUC19N（2729 bp）（由NIEHS的S. Wilson实验室构建）。该质粒包含三个紧密相邻的Nt.BstNBI切刻酶识别位点，界定出一段48个核苷酸（nt）的区域。经切刻酶孵育后，可将这些位点之间的单链DNA片段切除，并用含有任意目标结构的寡核苷酸替换。每一步操作后，均通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。与原始的超螺旋质粒相比，切刻后的环状DNA因电泳迁移率较低而可被区分。通过使用一种仅在切刻区域之间的底物序列内切割的限制性内切酶进行消化，可评估DNA的切口形成以及特异性底物寡核苷酸对被移除片段的替换情况。因此，对于已形成切口的DNA，该酶无法使环状质粒线性化；而在插入特异性寡核苷酸后，线性化能力则得以恢复。最后，利用两个内切酶限制性位点（理想情况下为单一切割位点），可生成线性DNA底物，其长度可根据需要设计，目标位点位于特定位置，同时在损伤位点的5'或3'方向一定距离处形成一个DNA泡状结构。
可通过NER解旋酶对损伤位点的识别进行研究 通过 AFM成像。解旋酶在损伤位点处的DNA转位停滞，在DNA上的蛋白位置分布中表现为一个峰，表明损伤识别的发生。由于这些解旋酶的DNA转位具有方向性，呈5'至3'极性，因此损伤识别对加载位点位置（损伤上游或下游的DNA泡）的依赖性还可揭示损伤更倾向于在被转位的单链DNA链上还是在相反的未被转位的单链DNA链上被识别。5,9在接下来的部分中，将介绍所使用的方法，并简要讨论这些实验的主要发现。重要的是，类似于此处展示的DNA修复研究范例，原子力显微镜（AFM）成像可应用于不同DNA相互作用体系的研究，例如DNA复制或转录。8,12,13,14.

<table><tbody><tr><td>分子力探针（MFP）3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>原子力显微镜（AFM）</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>计算机</td></tr><tr><td>ThermoMixer 及 1.5 mL 块</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>用于DNA制备的加热块</td></tr><tr><td>Rotilabo 恒温金属浴 H 250 &amp;以及适用于 0.5 mL 离心管的模块</td><td>卡尔·罗斯有限公司</td><td>Y264.1 &amp;& Y267.1</td><td>用于蛋白质-DNA 孵育的加热块</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>伯乐生命科学有限公司</td><td>1704467</td><td>带有凝胶灌注装置和电源的电泳槽</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1645050</td><td>电泳电源</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D 配转子</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>台式离心机</td></tr><tr><td>Ultra-Lum 电子紫外透射仪 MEB-15</td><td>超亮</td><td>900-1322-02</td><td>紫外照射台</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>紫外分光光度计</td></tr><tr><td>TKAX-CAD 加 0.2 &amp;mu;m胶囊滤器</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>去离子水过滤装置</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 上的 MFP 软件</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>原子力显微镜软件</td></tr><tr><td>ImageJ（开源Java图像处理）</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>Excel（Microsoft Office）</td><td>微软公司</td><td>N/A</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>统计数据分析与绘图软件</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>奥林巴斯</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM悬臂梁</td></tr><tr><td>V-5级白云母</td><td>SPI Supplies</td><td>1805</td><td>云母片</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore 爱尔兰有限公司</td><td>UFC505096</td><td>离心过滤器</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>琼脂糖凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>Rotilabo 纤维素滤纸 111A 型</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司</td><td>AP59.1</td><td>原子力显微镜沉积印迹纸</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0.02 &amp;mu;m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>注射器滤器</td></tr><tr><td>SSpI，BspQI</td><td>新英格兰生物实验室（NEB）</td><td>R0132, R0712</td><td>用于DNA底物制备的限制性内切酶</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>用于DNA制备对照的限制性内切酶</td></tr><tr><td>切刻限制性内切酶 Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs（NEB）</td><td>R0607</td><td>nickase</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>新英格兰生物实验室（NEB）</td><td>M0202S</td><td>连接酶</td></tr><tr><td>Tris、HEPES</td><td>卡尔·罗斯有限公司</td><td>4855, 9105</td><td>缓冲液化学试剂</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，KCl，MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>盐类化学品</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>盐类化学品</td></tr><tr><td>DTT、TCEP、EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>化学品/试剂</td></tr><tr><td>琼脂糖，乙酸，HCl</td><td>卡尔·罗斯有限公司</td><td>2267, 3738, K025</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ATP</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司</td><td>K054</td><td>核苷酸</td></tr><tr><td>表1中的寡核苷酸#1</td><td>Biomers</td><td>定制</td><td>互补DNA寡核苷酸</td></tr><tr><td>表1中的寡核苷酸#2、#3和#6</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>定制</td><td>含荧光素的寡核苷酸</td></tr><tr><td>寡核苷酸 #4&amp;nbsp; 以及表1中的#5</td><td>私有（可从 TriLink 或 GlenResearch 等供应商获取）</td><td></td><td>含环嘧啶二聚体的寡核苷酸</td></tr><tr><td>SafeSeal反应管 0.5 mL和1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 和 72.706</td><td>孵育管</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM0311</td><td>DNA 标准分子量标记</td></tr><tr><td>6x 浓缩凝胶上样缓冲液（紫色）</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>DNA上样染料</td></tr><tr><td>Midori Green&amp;nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>DNA染料</td></tr></tbody></table>

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的dna损伤识别

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

原子力显微镜成像是一种研究蛋白质-DNA相互作用的有力技术。这种单分子方法能够在异质样品中同时分辨不同的分子及分子组装体。在DNA相互作用蛋白体系的特定背景下，可以由此区分不同形式的蛋白质复合物及其在含有DNA片段的靶位点上的结合位置。本文介绍了一种将原子力显微镜应用于原核和真核生物核苷酸切除修复（NER）系统中DNA损伤识别研究的方法。文中描述了DNA和蛋白质样品的制备步骤，并提供了实验及数据分析的详细信息。这些数据有助于得出关于NER蛋白如何实现靶位点验证策略的重要结论。有趣的是，它们表明真核NER系统针对不同类型的DNA损伤采取了不同的识别与鉴定机制。此外，参与原核和真核NER系统的两种不同解旋酶具有各自独特的结构特性，这解释了这两个系统所表现出的不同策略。重要的是，这些实验和分析方法不仅可应用于DNA修复研究，同样也可广泛用于其他DNA相互作用蛋白体系的研究，例如参与复制或转录过程的系统。

基于蛋白质复合物体积区分不同类型的复合物
原核生物核苷酸切除修复（NER）解旋酶UvrB的解旋酶活性在结合DNA后得到增强22,23。UvrB需要DNA中的一个未配对区域（即DNA泡状结构），才能正确加载到两条单链DNA中的一条上。体内，这种DNA结构由NER级联中的另一个蛋白质介导的DNA相互作用提供；而在体外实验中，可在双链DNA片段中靠近靶向损伤的位置人工引入泡状结构。蛋白质-蛋白质相互作用也能增强UvrB对DNA的结合能力9。然而，一旦UvrB加载到DNA上，其活性似乎不再依赖于蛋白辅因子9。相比之下，真核生物NER解旋酶XPD需要与蛋白p44相互作用才能激活其解旋酶活性，p44与XPD一样，在体...

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过 以核苷酸切除修复系统为例，展示了单分子原子力显微镜成像技术。文中描述了DNA和蛋白质样品制备的步骤，以及原子力显微镜实验的操作与分析细节。

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

原子力显微镜成像是一种研究蛋白质-DNA相互作用的有力技术。该单分子方法能够同时解析不同...

本原子力显微镜实验的总体目标是解析DNA修复蛋白与DNA损伤位点之间的相互作用，并区分不同蛋白质复合物与DNA的相互作用方式。该方法有助于回答DNA修复领域中的关键科学问题，例如特定的DNA修复系统如何实现对DNA中靶标损伤位点的识别。该技术的主要优势在于，我们能够直接观察并分析参与DNA损伤识别过程的各种复合物类型。演示该实验步骤的是Nicolas Wirth，他在本科研究期间应用了这一方法。首先，通过在质粒中产生单链DNA缺口来制备合适的DNA底物；接着，用修饰过的单链DNA寡核苷酸填补缺口；最后，使用适当的限制性内切酶将质粒DNA线性化。在这些实验中，双链DNA底物长度约为1,000个碱基对，包含一个DNA损伤位点以及一个用于蛋白质加载的未配对区域，称为DNA泡。接下来，通过先用移液器将10x反应缓冲液和水加入微型反应管中，制备用于原子力显微镜（AFM）分析的蛋白质-DNA样品，然后加入待研究的DNA和蛋白质。例如，此处加入100纳摩尔的DNA样本以及各1微摩尔的真核生物核苷酸切除修复蛋白XPD和p44。然后将反应体系置于37摄氏度的加热块中孵育30分钟。孵育结束后，短暂离心收集样品。接下来，准备一个云母基底用于放置样品。使用手术刀从较大的云母条上切割出一块一厘米乘一厘米的云母片。然后，使用一段粘性胶带剥离云母的顶层，以暴露出一个干净、平坦且具有解剖学光滑表面的基底。用原子力显微镜沉积缓冲液将蛋白质-DNA样品稀释50至100倍，并立即取20微升稀释后的样品滴加到云母表面。稀释倍数取决于样品浓度。样品滴加到云母表面后，立即用几毫升过滤的去离子水冲洗3到4次，并吸去多余液体。使用温和的氮气流吹干样品。最后，用胶带将样品边缘固定在显微镜载玻片上。将样品置于原子力显微镜（AFM）载物台中央，并使用磁性垫片将显微镜载玻片固定在载物台上。然后，将原子力显微镜（AFM）探针插入探针 holder 中。在夹具下拧紧螺丝，用手拧紧即可，将探针固定在 holder 内。固定后，将探针 holder 插入 AFM 测量头中。使用定位螺丝将样品移至中心位置。将原子力显微镜（AFM）测量头放置在样品上方，确保测量头的支脚稳定地置于载物台的凹槽内。接着，调整AFM激光束，使其对准悬臂背面，以获得最佳信号强度。在AFM视频窗口中观察反射信号，粗略调整激光位置。对于此款AFM型号，转动AFM测量头右侧和后侧的旋钮，调节AFM激光的X和Y方向位置，使其对准悬臂末端中心。随后，通过两个旋钮微调激光位置，以优化探测器的总和信号。通过调节探测器阵列上下两个二极管信号的差值为零，将原子力显微镜（AFM）激光反射引导至探测器中心。对于该型号的AFM，执行此步骤时需旋转测量头左侧的螺丝。接下来，在软件中进入主控面板的调谐窗口，以确定悬臂的共振频率。选择与驱动悬臂振荡的压电元件（Piezo）输入电压为一伏相对应的振幅，然后将振荡频率设置为比共振频率低约5%。接着执行自动频率调谐，并将振荡相位归零。在开始成像前，让系统静置约一小时以达到热平衡，从而避免漂移。当准备开始成像时，在软件主面板中设置一个保护性的设定点，并通过选择“engage”来准备将探针接近样品表面。手动降低AFM探头的前轮，直至达到保护设定点。然后，小心地进一步降低前轮，直到Z传感器信号完全向左伸展。启动振动振荡台并关闭声学隔离罩。接着，在原子力显微镜（AFM）软件中使用滚轮调节，逐步降低设定值，使AFM针尖与样品实现精细接触。为在排斥状态下进行轻敲模式成像，需继续降低设定值，直至相位信号略低于自由状态下的相位水平。然后，开始扫描样品。在扫描面积为 4 微米 × 4 微米或 8 微米 × 8 微米的区域时，分别采用 2,048 或 4,096 的像素分辨率，并以每秒 2.5 微米的扫描速度进行扫描；随后点击“Do Scan”按钮。通过 AFM 软件直接目视检查图像，预先筛选出相关的蛋白质-DNA 复合物。对于XPD样品，可能存在的复合物包括XPD-p44-DNA，以及由于XPD与p44分子质量不同而导致尺寸明显不同的XPD-DNA和p44-DNA。通过分析窗口中的截面工具，使用截面窗口光标测量DNA上各个蛋白质峰截面的高度和直径，以测定其体积。利用这些数值，结合简单的数学模型计算峰体积，从而验证复合物的类型。最后，使用一系列已知分子量的蛋白质对原子力显微镜（AFM）系统进行校准，以将这些体积转换为蛋白质及蛋白质复合物的近似分子量。若需确定其他特征，例如DNA片段长度、蛋白质复合物在DNA上的位置及其靶位点特异性或DNA条带角度，请参阅配套的文字版实验方案。图中显示的是一张原子力显微镜图像，包含三种不同类型的DNA结合复合物，可根据其不同大小加以区分。一类复合物仅包含解旋酶激活辅助因子p44，二类复合物仅包含XPD蛋白，三类复合物则同时包含XPD和p44，因为XPD对损伤位点的识别需要p44激活其解旋酶活性，且只有三类复合物表现出损伤识别能力。为了鉴定不同的损伤识别机制，测量了原核和真核NER解旋酶在DNA损伤位点（以红色标示）两侧的DNA泡状区域中，蛋白质沿5′或3′方向加载至DNA底物上的位置。在蛋白质定位分布图中，DNA损伤识别表现为在损伤位点处因结合增强而形成的峰。 原核生物NER解旋酶UVRB及其真核生物对应物XPD在识别环丁烷嘧啶二聚体（CPD）损伤时表现出不同的策略，提示其对DNA链具有不同的偏好性。具体而言，UVRB在被易位的链上识别CPD损伤，而XPD则优先在相反的、非易位的链上识别该损伤。一旦掌握，包括分析在内，该方法可在数小时至数天内完成。为了能够准确解读原子力显微镜（AFM）图像中的特征，并根据所研究的生物体系及科学问题精心设计DNA底物，使用高纯度的蛋白质和DNA样品至关重要。此外，整体性方法（如凝胶电泳、电泳迁移率变动或DNA切口实验）当然与这些AFM实验高度互补；这些方法有助于回答其他问题，例如DNA结合亲和力或DNA损伤切除活性。该技术是一种相对快速且简便的方法，可直接观察蛋白质-DNA复合物，这些复合物为我们提供了生物体系中发生过程的清晰图景。当然，这种方法不仅有助于理解DNA修复过程，还可应用于其他蛋白质-DNA体系。观看本视频后，您将能够较好地掌握如何制备您感兴趣的蛋白质-DNA体系样品，如何利用原子力显微镜（AFM）对其进行成像，以及如何提取有用参数以解释您的实验数据。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

原子力显微镜检查DNA损伤识别核苷酸切除修复

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基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

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单分子分析激光定位补骨脂素加合物

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激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本方案描述了一种非侵入性方法，可高效地鉴定处于S期的细胞，用于后续显微镜研究，例如通过激光微辐照检测DNA修复蛋白的招募情况。...

利用激光显微照射研究S期DNA的招募过程

本研究展示了一种在气动液滴操控平台上检测多位点核苷酸多态性的简单且可视化的方 法。利用该方法，整个实验过程（包括液滴操控和多位点核苷酸多态性检测）均可在接近23 °C的条件下完成，无需借助复杂的仪器设备。...

基于气动液滴操控平台的多位点核苷酸多态性可视化比色检测

了解原子力显微镜技术用于研究核苷酸切除修复系统中DNA损伤识别机制的方法。该技术可直接观察修复蛋白与DNA损伤位点的相互作用，为理解DNA修复过程提供重要的分子水平见解。

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

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