Name: 육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 학습하세요 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환을 유도하는 세포 배양 기법을. microRNA-200과 GRHL2를 이용하여 암 침윤성과 치료 전략에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

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JAS는 듀크 암 연구소, 듀크 대학 비뇨 생식기 종양학 연구소 및 정형 외과의 듀크 대학교의 지원을 인정합니다. HL은 이론 생물 물리학에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation, NSF) 센터에 의해 지원되었다 (NSF PHY-1427654)와 NSF DMS-1361411, 텍사스 주 암 연구에 CPRIT로 (암 예방 및 텍사스 연구소) 학술 라이스 대학 (Rice University)에서. KEW는 NIH F32 CA192630 MKJ 지원하고 HL 메리 C. Farach-카슨 JN Onuchic 사미르 M. Hanash, 케네스 J 피엔타, 도널드 S. 코피 유용한 논의 혜택.

시약의 제조 1. <ol><li> 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 (5,000 U / ㎖) 500 ㎖의 DMEM에 5 mL의 50 ㎖를 첨가하여 세포를 DMEM 배양을 준비한다. 이 매체는 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 10 μM의 최종 농도 핵산 분해 효소가없는 물에 동결 건조 된 프라이머를 재현 탁. 저장 -20 ° C에서 프라이머를 재 - 중단. </li><li> radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS, 50 개 mM 트리스, pH를 8.0)을 준비한다. 사용하기 전에 프로테아제 억제제 칵테일 보충 및 사용시 얼음에 버퍼를 유지한다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 0.45 ㎛의 폴리 필터를 이용하여 멸균 물 및 주사기 필터에 10 ㎎ / ㎖의 폴리 브렌 (hexadimethrine 브로마이드)를 준비한다. 솔루션은 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> PBS 10 ㎖의 10 ㎎을 용해시켜 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드의 1 ㎎ / ㎖ 작업 용액을 제조 하였다. 4 ℃에서 보관하십시오.</li></ol> GRHL2 2. 렌티 바이러스 형질 도입 1 일 <ol><li> 접시 보충 DMEM 2 ㎖로 6 웰 플레이트에 웰당 3 × 105 HEK293T 세포. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 정량화. 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양 한 후 60 % 융합 - 셀 40이어야한다. </li></ol> 제 2 일 <ol start="2"><li> 1.8 pΔ8.9의 μg의 및을 pCMV-VSV의 0.2 μg의와 함께 혈청이없는 미디어의 200 μL에 2 빈 벡터의 μg의 (을 pCMV-UBC-EGFP) 또는 둘을 pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24 μg의 25 희석 -G 도우미 플라스미드. 별도의 튜브에, 형질 당 혈청이없는 배지 (두 샘플 400 μL 8 μL)을 200 μL의 지질 계 형질 감염 시약 4 μL 희석. 각 플라스미드 용액으로 형질 전환 시약 혼합물을 200 μL를 첨가하고 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> incuba 동안능은, 진공 흡인에 의해 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖로 세포를 세척함으로써 HEK293T 세포를 세척한다. 혈청이없는 미디어의 800 μL와 PBS를 교체합니다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 2 시간 동안 세포를 각 웰에 적하 단계 2.2에서 플라스미드 혼합물을 배양하고 20 분 후에, 트랜 스펙 션 시약 200 μL를 추가한다. </li><li> 조심스럽게 진공 흡인 형질 감염 배지를 제거하고 보충 된 DMEM 2 mL로 교체한다. 하룻밤 문화 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 참고 : HEK293T 세포는 느슨하게 부착합니다. 미디어 교체 접시 또는 플라스크의 바닥으로부터 세포를 제거하기 위해주의를 제한하여 수행되어야한다. </li></ol> 3 일 <ol start="5"><li> 보충 된 DMEM 2 ㎖로 형질 HEK293T 세포 플레이트에 6 웰 플레이트의 웰 당 3 × 105 RD 세포를 새로 고침 매체. 하룻밤 문화 전지. RD 세포는 시판 인간 횡문근 육종 세포주이다. </li></ol> 4 일 </P&gt; <ol start="6"><li> HEK293T 세포에서 바이러스 성 미디어를 수집합니다. 새로운 15ml의 원뿔형으로 HEK293T 세포 장소로부터 DMEM 배지 피펫. 조심스럽게 다시 다음 날을위한 인큐베이터에서 새로운 DMEM 매체와 장소 HEK293T 세포로 대체합니다. </li><li> 두 개의 새로운 50ml의 원뿔형 튜브 (GRHL2 형질 대한 빈 벡터 형질 다른 하나)로 10 밀리그램 / 바이러스 미디어 1 ㎖ 당 용액의 폴리 브렌 2 μL를 추가한다. 3 ml 주사기의 플런저를 제거하고 선단에 0.45 ㎛의 폴리 필터를 부착하여 주사기 필터 바이러스 매체. <ol><li> 주사기 배럴로 단계 260에서 수집 된 바이러스 미디어를 추가하고, 폴리 브렌을 함유하는 새로운 50 개 ㎖ 원뿔형 튜브에 미디어를 뛰어. 진공 흡인 RD 세포로부터 용지를 분리 RD 세포 바이러스 여과 매체를 추가한다. </li></ol></li></ol> 5 일 <ol start="8"><li> 바이러스 미디어가 수집 한 후 반복 일 4. HEK293T 세포는 폐기 될 수있다. </li></ol> 7 일 </강한&gt; <ol start="9"><li> 워시 RD의 PBS 1 ㎖로 세포를 200 0.05 % 트립신 μL 웰 당을 추가한다. 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션 보충 미디어 2 ㎖를 추가하고, 새로운 15ml의 원뿔에 세포 현탁액을 이동. 실온 대기음 매체에서 5 분 동안 원심 분리기 (250) XG 세포. DMEM 1 ㎖에 재현 탁은 (5 % FBS 및 1 %의 페니실린 스트렙토 마이신이 보충). 참고 : FBS의 높은 비율을 사용하여 유동 세포 계측법 동안 막힘이 발생할 수 있습니다 <ol><li> 유동 세포 계측법에 대한 필터 세포. 얼음 튜브 대신 파이프를 유세포 분석기로 30 μm의 필터를 사용하여 1 ㎖의 RD 세포 현탁액을 적용하기 위해 피펫을 사용한다. </li><li> 0.5ml의 DMEM을 함유하는 1.5 mL의의 마이크로 원심 튜브에 놓아 + EGFP 셀 26 얼음에 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충 장소. 플레이트는 EGFP + 배양 인큐베이터에서 12 웰 플레이트와 장소의 단일 웰에 첨가 DMEM 1 ㎖의 총 세포를 분류. ; 참고 : 흐름 계측법이 전달 후 EGFP + 세포의 수율은 일반적으로 저 (50000 개 세포)이다. 3 단계로 진행하기 14 일 전 - 세포는 10 배양해야 할 수도 있습니다. </li></ol></li></ol> 미르 200S 3. 역방향 형질 <ol><li> 반복 된 동결 / 해동 사이클을 피하기 위하여 -20 ° C에서 클레아없는 H 2 O. 나누어 축적량 및 저장소를 사용하여 결과 miR-200 모방 50 개 μM 주식을 준비한다. </li><li> 혈청이없는 배지 300 μL 300 μL의 혈청이없는 배지에서 50 μM 음성 대조군 miRNA를 9 μL 각 50 μM은 miR-200 모방 (미르 200A 미르-200B, 미르-200C) 3 μL를 추가한다. </li><li> 혈청이없는 배지 600 μL에 siRNA를 형질 특정 시약 6 μL를 첨가하고 두 튜브, 단계 3.2에서 두 미르 혼합물의 각 하나에이 혼합물을 300 μL를 나눈다. 형질 전환 시약 300 μL를 혼합하여, 각 단계에서 3.2 미르 혼합물의 300 μL를 결합. 방 TE에서 20 분 동안 인큐베이션mperature. </li><li> 배양하는 동안, 2.4 ㎖의 생성 된 제 2 또는 EV GRHL2 EGFP 발현 600000 개 + RD 세포의 세포 현탁액 처리 당 혈청 매체 (250 세포 / μL)을 준비한다. </li><li> 24- 웰 플레이트에서, 여섯 개 웰로은 miR-200 혼합 또는 단계 3.3 대조군 혼합물의 웰 당 100 μL를 추가 한 다음 각 미르 믹스 세 웰에 각각의 세포 현탁액을 400 μL를 추가한다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 밤새 인큐베이션 미디어 변경 완전히 다음날 DMEM을 첨가한다. 적절한 완충액 (하기 참조)을 이용하여 분석을 2 일 후, 세포를 수집한다. MET를 겪고 RD 육종 세포의 시간 경과 영상은 보충 자료로 사용할 수 있습니다. 이미지 자동 라이브 셀 이미 저 (27)를 사용하여 10 배 목적으로 각 웰마다 2 시간. </li></ol> 4. RNA 추출, 역전사 및 qPCR에 <ol><li> 표준 RNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출추출 키트 (24). 추출 된 RNA는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> RNA 농도를 정량화. 해동 얼음에 RNA와 함께 작동합니다. , RNA 농도를 정량화 제조사의 프로토콜에 따라 플레이트 리더 분광 광도계로 260 nm에서 UV 흡광도를 측정한다. 핵산 분해 효소가없는 물을 낮은 농도의 모든 샘플을 희석. </li><li> 상보 적 DNA (cDNA의) 총 RNA로 역전사를 수행한다. 20 μL의 반응 부피 24 효소 및 뉴 클레아없는 물을 역 PCR 완충액의 dNTP 믹스 (100 mM)을 랜덤 헥사 머 프라이머와 총 RNA의 덜 100 NG를 결합하지 않는다. 제조의 프로토콜에 따라 RT주기를 실행합니다. cDNA를 -20 ° C에서 장기 저장할 수 있습니다. </li><li> 뉴 클레아 제 무 H 2 O 80 μL에 100 μL에 20 μL 반응 희석 </li><li> 형광 기반 인터 염료 배 qPCR의 마스터 믹스를 5 μL, 각각 10 μM의 프라이머 0.06 μL를 섞어샘플 당 희석 RT 반응 ND 2 μL. </li><li> 형광 기반의 마스터 믹스 제조 업체의 프로토콜에 따라 실행 qPCR에. </li><li> 델타 CT 법에 의해 mRNA의 상대적인 양을 정량화 GAPDH로 정상화. 각 치료 그룹에 대한 표준 편차 ± 생물 복제의 평균 mRNA 발현을 그린다. 참고 : 등의 RNase없는 플라스틱 및 시약을 사용하는 등 RNases과 접촉을 피하기 위해 RNA로 작업 할 때 특별한 예방 조치가 취해 져야한다. 비 일회용 장비는 RNases을 제거하기 위해 사용하기 전에 처리해야합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 염색 <ol><li> 24- 웰 포맷에서 RD 세포로부터 진공 흡인 단계 3.6 대기음 미디어 다음. </li><li> 웰당 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 500 μL를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 15 분 (RT) 동안 배양. 정착 이후, 인산 장소 세포 밤새 필요한 경우 39 ° C에서 생리 식염수 (PBS) 및 스토어 버퍼. </li><li> Permeabilize 하시려면PBS + 0.2 % 트리톤 X100 500 μL를 첨가하고, RT에서 30 분 동안 배양하여 세포. 진공 흡인, permeabilization 버퍼를 제거하고 PBS로 3 회 세척 하였다. </li><li> 5 % 소 혈청 알부민 500 μL (BSA) / PBS에서 차단하고 RT에서 30 분 동안 세포를 배양한다. 세포를 밤새 필요한 경우 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 차 항체 희석을 준비한다. 15 ML 원뿔로 5 % BSA 피펫 200 μL / 웰 당 PBS (12 웰 = 2.4 mL) 및 5 % BSA 1 ㎖ 당 1 차 항체 μL를 추가 / PBS를 필요로했다. 진공 흡인 차단 완충액을 제거하고, 각 웰에 희석 된 일차 항체의 200 μL 분주. <ol><li> 1 세포를 인큐베이션 : 5 % BSA에서 희석 된 1000 개 차 항체 / PBS 실온에서 1 시간 동안 또는 밤새 4 ℃에서. 부화 후, PBS로 세포를 두 번 씻는다. </li></ol></li><li> 상기와 같이, 5 % BSA / PBS 동량의 차 항체 희석을 준비한다. 2,000 희석 : 1을 사용하여 원적외선 염료 복합 이차 항체를 추가합니다. 또한 추가믹스 훽스트 염료 1 ㎍ / mL로. PBS를 제거하고 각 웰에 믹스 200 μL를 추가합니다. <ol><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. PBS로 3 회 세척, PBS에서 셀을두고 호일을 사용하여 빛으로부터 세포를 보호합니다. 필요한 경우 세포를 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 650 나노 미터 - 여기 파장 (594)와 반전 된 표면 형광 현미경의 400 배의 총 배율에서 이미지 셀. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 3.6에서 세포를 씻으십시오. 얼음, 1X RIPA 50 μL와 세포를 Lyse 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 버퍼입니다. </li><li> 15 분 동안 4 ℃에서 락 해물을 5 분 샘플을 명확히하기위한 고속 (20,000 XG)에 1.5 ㎖의 튜브에 해물을 원심 분리 수집. 필요한 경우 세포 용 해물은 -80 ° C에서 장기 저장할 수 있습니다. </li><li> 브래드 포드 분석을 이용하여 총 단백질을 정량화 된 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질의 동일한 양 나누어지는. 브린2- 머 캅토 에탄올이 보충 된 RIPA 완충액과 3X 램리 로딩 완충액을 사용하여 동일한 부피 샘플 g. </li><li> 95 ° C에서 5 분 동안 1X 램 믈리 시료 완충액 로딩 샘플을 인큐베이션하고 45 분 동안 200 V에서 4-12 % 트리스 - 글리신 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 실행. 세포주에 따라 단백질 적재 범위의 양. 어떤 경우에는, 총 단백질의 50 ~ 100 μg의는 중간 엽 세포 라인에서 E-cadherin의를 감지하기 위해 필요합니다. </li><li> 1X 트리스 - 글리신 전송 버퍼에서 50 V에서 2 시간 동안 니트로 셀룰로오스 막 상으로 전달 단백질. </li><li> 실온에서 밤새 또는 BSA 기반 차단 완충액 4 ° C에서 1 시간 동안 차단 막. </li><li> 차단 완충액 5 mL 중에 1000 농도로 희석 멤브레인을 추가하고 부드러운 실온에서 또는 밤새 4 ℃에서 1 시간 동안 흔들 함께 배양 1 주에서 항체를 희석. 0.05 % 트윈 20과 함께 PBS에서 세척 막을 3 회. </li><li> 적외선 형광 결합 secondar 함께 RT에서 1 시간 동안 막을 인큐베이션예 1에서 항체 : 위와 블로킹 완충액에 희석 20,000. </li><li> 0.05 % 트윈 20과 함께 PBS로 막 두 번 세척하고 PBS에 다음 한 시간. </li><li> 표준 적외선 형광 검출을 이용하여, 화상을 막. </li></ol> 7. 앵커리지 독립적 인 성장 분석 참고 : 자세한 부드러운 한천 분석 프로토콜의 28을 참조하십시오. <ol><li> 온수욕에서 42 ° C로 예열 멸균 배 DMEM 배지. 이 시간 동안, 열은 3 분 동안 전자 레인지에서 1 % 아가로 미리 멸균. 필요하거나 완전히 용해 될 때까지로 한 번에 추가로 30 초 동안 전자 레인지. 42 ° C의 물을 욕조에 아가로 이동합니다. </li><li> 무균 후드에서 42 ° C의 물과 함께 비이커에 50ml의 원뿔형 튜브를 배치하고, 1을 1 % 아가 로즈 및 배 DMEM 배지를 혼합 : 6 웰 플레이트에 웰 당 혼합물을 1.5 mL의 1 비율 회계. 항상 DMEM 아가로 오스 피펫 오류에 대해 설명 할 / 추가로 준비하고 거품을 피하기 위해. </li><li> 받는 사람 혼합물을 추가기포를 확보하지 웰의 측면, 형태 및 RT에서 30 분 동안 방치하자. </li><li> 하부 층이 고화되는 동안 미디어를 흡입하고 1 ㎖의 PBS로 한번 세척 3 단계에서 형질 RD 세포의 각 그룹을 준비한다. 대기음 PBS 및 0.05 % 트립신, 0.2 mL를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 단일 세포 현탁액을 형성하기 위하여 미디어 씹다 세포를 0.8 mL의 트립신을 중화. 15 mL의 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 세포를 세어 웰 당 10,000 세포에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산한다. </li><li> 완전히 용해 될 때까지 한 번에 30 초 다음 3 분 동안 전자 레인지에서 0.6 % 아가로 가열한다. 42 ° C의 물을 욕조에 아가로 이동합니다. </li><li> 무균 후드에서 42 ° C의 물과 함께 비이커에 50ml의 원뿔형 튜브를 놓는다. 6 웰 플레이트에 웰 당 1.5 ㎖의 혼합물을 제조 한 비 : 1의 0.6 % 아가로 희석 세포 현탁액을 혼합한다. 항상 피펫 오류를 설명하는 혼합 아가로 오스 / 여분의 세포 현탁액을 준비하고거품을 방지한다. 참고 : 여기에 42 ° C에서 작동하는 것이 중요합니다. 온도가 너무 낮 으면, 혼합물 도금 전에 고체화되고, 42 ° C 이상의 온도가 세포 생존에 영향을 미칠 것이다. </li><li> 세포를 여러 번으로 분쇄하여 잘 혼합 및 기포 형태를 보장하지 웰에 세포 혼합액을 추가하고, 실온에서 20 분 동안 응고하자. </li><li> 각 보충 미디어 2 용액을 웰에 첨가하고 플레이트를 인큐베이터를 이동. <ol><li> 3~4주 또는 다세포 식민지 형성 할 때까지 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 진공 흡인에 의해 용지를 제거 할 때 한천을 만지지 않도록주의하십시오. 대안 적으로, 액체 매질의 상층을 제거하는 P1000을 사용한다. </li><li> 200 μL 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 용액을 첨가하여 (1 밀리그램 / PBS 용액에서) 소프트 한천 플레이트 얼룩과 37 ℃에서 밤새 배양 접시. 영상 PBS로 다음날 매체를 교체합니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 40X 총 배율에서 이미지 우물. </li><li> 식민지 지역 및 번호 ImageJ에에 분석을 수행합니다. 플롯은 생물 복제의 콜로니 수는 표준 편차를 ± 의미한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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육종은 중간 엽 계보의 희귀하지만, 매우 공격적인 암이다. 자신의 중간 엽 혈통에도 불구하고, 육종의 부분 집합은 더 상피와 같은 상태로 형질 전환을 겪을 것으로 보인다. 더 상피와 같은 종양을 가진 환자가 24 덜 공격적으로이 MET-같은 스위치는, 예후 관련이있다. 임상 관련성에도 불구하고, 육종 이러한 형질 전환을 운전하는 분자 메커니즘을 해결 몇몇 연구가있다. 육종 세포에서 MET-같은 전환을 검토하기 위해, 우리는 상피 요인 GRHL2와 미르-200 가족의 발현을 결합하여 MET-유도 모델을 개발했다. 이 방법은 급속히 형태와 유전자 발현 변화에 의해 측정되는 더 많은 상피 추천 될 육종 세포를 유도한다. 육종 세포에서 MET를 유도하기 위해이 프로토콜을 사용하여 육종 침략 등을 드라이브 표현형에서 이러한 전환의 영향의 연구를 용이하게마이그레이션, 침입, 증식과 죽음에 저항하는 방법으로 생물학에서 이러한 변경의 각 약물 저항...

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

표현형 가소성 세포 표현형 사이의 가역적 인 변화를 의미하고, 일반적으로 두 가지 유형, 상피 간 간엽 (EMT) 전환 및 중간 엽 간 상피 천이 (MET)로 분할된다. 이 표현형의 가소성은 개발 및 상처 치유 1과 다세포 생물의 정상적인 과정에서 중요한 역할을한다; 그러나,이 같은 경로 유전자 발현 프로그램 또한 섬유증, 질병을 초래할 수있다 (검토를 2, 3, 4), 암 전이 (참고 문헌 5, 6, 7의 평가 8). 전이 동안, 예를 들어, EMT 세포 극성, 세포 - 세포 상호 작용을 방해하고, 침략 9, 10 추진하고 있습니다. 함께, EMT 기여암 세포의 보급을 촉진하는 표현형 상태로의. 또한 EMT는 암 세포 대사 (6)의 규제 완화 약물 저항 (11), (12)의 개발을 포함 공격적인 표현형을 유도 다른 표현형 변화, 증가 된 종양 개시 능력 (13), (14)와 면역 회피 15 호스트의 호스트로 이끈다. 표현형 소성 잘 암의 진행에서 연구되고있다; 그러나, 육종은 표현형의 가소성을 나타낸다. 암의 표현형 가소성 같은 드라이버 중 일부는 또한 육종 소성 및 공격성에 기여하는 것처럼 흥미롭게도,이 나타납니다. 예를 들어, 육종 환자의 순환 성 종양 세포 (CTCS은)는 EpCAM, 일반적으로 상피 세포 (16)에서 발견되는 세포 표면 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. ADDI전통적으로, 250 개 연조직 육종 샘플 상피 형상 또는 간엽 같은 유전자 발현에 기초로 분류 하였다. 상피와 같은 바이오 마커의 서명이있는 환자는 중간 엽 같은 바이오 마커의 서명 (17)을 가진 환자보다 더 나은 예후를했다. 이것은 더 상피와 같은 암 환자보다 중간 엽 같은 종양 18 환자에 비해 더 나은 결과를 보유하고있는 많은 암과 일치한다. 일부 육종이 생체와 MET와 일치 유전자 발현 경로를 표시하지만,이 표현형 가소성의 분자 토대는 잘 이해되지 유지. 육종 MET의 메커니즘과 드라이버를 연구하기 위해 우리는 두 가지 상피 특정 요소를 사용하여 MET 유도의 모델을 개발, 마이크로 RNA (은 miR) -200 가족과 grainyhead 같은 2 (GRHL2). 미르-200S는 messen의 3 &#39;의 UTRs에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는 작은 비 RNA를 코딩하는 가족게르 RNA와 단백질에 방지 번역. 미르 141, 미르 (200A)를 포함 하나, 미르-200B, 200C 미르, 미르-429을 포함한 타 - 미르-200 가족 개의 서브 그룹들로 구성된다. 미르-200 계열의 구성원은 상피 조직에 충실 미르-200S 손실은 암 (19)의 전이와 관련된다. 미르-200 계열은 정상 조직에 비해 20 연조직 육종에서 하향 조절된다. 미르-200S 유사하게, GRHL2 상피 개발 (21)에 대한 중요 핵심 레귤레이터이다. GRHL2 전사 인자는 E-cadherin의 상피 유전자를 상향 조절하는 방법은 두 가지 작용 1) 상피 세포에서 GRHL2 직접 EMT 마스터 레귤레이터 억압을 ZEB1 22; 2) GRHL2 직접 상피 유전자 (23)의 전사를 활성화합니다. 우리의 이전 연구는 것으로 나타났습니다 육종 세포 미르-200S와 GRHL2의 결합 된 표현MET-같은 표현형 (24)를 유도한다. 여기서는은 miR-200S 및 GRHL2의 이소성 발현하여 육종 세포에서 MET 유도 시험 관내 모델을 작성하는 구체적인 프로토콜을 제안한다.

<table><tbody><tr><td>Countess 자동화 카운터</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Starting Block(PBS) 차단 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA 기반 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Agarose 범용 LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS 버퍼</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>러닝 버퍼</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>전송 버퍼</td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m 니트로셀룰로오스</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼 (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA 모방 음성 대조군 #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA 모방</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA 모방</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA 모방</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>무혈청 매체</td></tr><tr><td>항-에카데린 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>항-베타 액틴</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>항-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>안티-토끼 AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 및 인산염 억제제</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; 흐름용 m 필터</td></tr><tr><td>: GAPDH-F,</td><td>IDT,</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC,</td></tr><tr><td>GAPDH-R,</td><td>IDT,</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr>, <tr><td>Ecadherin-F</td>, <td>IDT,</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr>, <tr><td>Ecadherin-R</td>, <td>IDT,</td><td></td><td>CGCTCTCTCCCGAAAC,</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td>, <td>IDT,</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC,</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>, IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>니트로 블루 테트라졸륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>헥사디메트린 브로마이드</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>폴리브레렌</td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>352063</td><td></td><td>유세포 분석 튜브</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>역전사 키트</td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

표현형 소성은 세포가 일시적으로 다른 혈통의 특성을 얻을하는 현상을 말한다. 암 진행하는 동안, 표현형의 가소성은 침공, 보급 및 전이를 구동한다. 표현형 가소성 연구의 대부분은 상피 유래 암의 맥락에서되었지만 실제로, 그것은 mesenchymal- 유사한 현상을 겪고 육종의 부분 집합으로, 또한 표현형의 가소성을 전시, 기원 중간 엽 있습니다 육종을 밝혀 상피 성 전이 (MET). 여기서는 각각 순차적 GRHL2 및 미르 200 패밀리는 세포 형질 도입 및 형질 전환을 이용하여 표현 육종 환자 samples.We 관찰이 메티오닌과 같은 현상을 모방 미르-200 가족 grainyhead 같은 2 (GRHL2)를 포함하는 방법을 개발 더 나은 육종 세포에서 이러한 형질 전환의 분자 토대를 이해합니다. 미르 200S 및 GRHL2 표현 육종 세포는 상피 향상된 characterist 입증세포 형태와 상피와 중간 엽 바이오 마커의 변화에 ​​ICS. 이러한 방법을 사용하여 앞으로의 연구는 더 나은 등의 이동, 침윤, 전이 성향 및 치료 저항 등의 육종 세포에 대한 MET-같은 프로세스의 표현형의 결과를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

육종 세포에서 MET 유도를위한 스키마 육종 세포에서 MET와 같은 변화의 도입을위한 일반적인 타임 라인은도 1에 도시되어있다. 프로토콜은 미르-200 계열 (도 1b)의 형질 GRHL2 하였다 (도 1a)을 열 변환하는 것으로 시작한다. GRHL2 또는은 miR-200 가족만으로는 표현할 때 RD 세포의 모양에 영향을 미칠 수 없었다하지만 함께 GRHL2 미르-200S의 이소성 발현 RD 상피 세포와 같은 형태 변화의 결과. 증가 된 세포 - 세포 접촉 (도 1C)와 더 둥근 모양으로 방추형의 세포 형태의 변화. 육종 세포에서 MET-같은 ...

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 육종에서 발생하는 중간엽-상피 전이의 표현형적 결과물을 연구하는 것입니다. 이 방법은 상피세포 유사 육종이 왜 중간엽세포 유사 육종에 비해 더 우수한 예후를 보이는지에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 육종의 중간엽-상피 전이와 관련된 하위 유전자 조절 네트워크 및 표현형을 연구할 수 있는 쉽고 재현 가능한 수단을 제공한다는 점입니다.육종의 표현형 가소성을 더 잘 이해함으로써, 육종을 보다 완만한 상피 세포 유사 상태로 전환할 수 있게 하는 치료적 개입 방법을 찾고자 합니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 학부생인 Jackson Xu와 Shivee Gilja가 진행하겠습니다. 형질 도입 첫째 날, 첨가제가 포함된 DMEM 2 mL가 담긴 6-웰 플레이트의 두 개 웰에 각각 3 × 10⁵개의 HEK293T 세포를 분주하십시오.플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포의 합일도(confluency)가 40-60%여야 합니다.다음으로, 1.8 µg의 p delta 8.9와 0.2 µg의 pCMV-VSV-G 헬퍼 플라스미드가 포함된 200 µL의 무혈청 배지가 들어 있는 각각의 튜브에, 2 µg의 공벡터(empty vector)와 GRHL2를 포함하는 벡터 2 µg을 각각 희석합니다. 다른 튜브에는 transfection당 200 µL의 무혈청 배지에 지질 기반 transfection 시약 4 µL를 희석합니다. 두 개의 샘플의 경우 8 µL와 400 µL가 됩니다.각 플라스미드 용액에 200 µL의 transfection 시약 혼합물을 첨가한 후, 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그동안 진공 흡입기를 사용하여 HEK293T 세포에서 배지를 제거합니다. PBS 1 mL로 세포를 한 번 헹군 다음, PBS를 800 µL의 무혈청 배지로 교체합니다.20분이 지나면, 플레이트의 각 웰에 transfection reagent-plasmid 혼합물 400 µL를 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다. 배양 접시를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 진공 흡입 장치를 사용하여 transfection 배지를 조심스럽게 제거합니다.HEK293T 세포는 부착력이 약하므로, 배지를 흡입할 때 세포가 디쉬나 플라스크 바닥에서 떨어지지 않도록 주의하십시오. 흡입한 배지를 2 mL의 보충된 DMEM으로 교체합니다. 세포를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 형질전환된 HEK293T 세포의 배지를 교체한 후, 웰당 2mL의 보충된 DMEM이 담긴 6웰 플레이트의 각 웰에 3x10⁵개의 RD 인간 횡문근육종 세포를 분주합니다. 두 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 넷째 날, 피펫을 사용하여 HEK293T 세포에서 바이러스 배지를 수집하고, 이를 두 개의 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 하나는 공백 벡터를 포함하는 렌티바이러스용이며, 다른 하나는 GRHL2 플라스미드를 포함하는 렌티바이러스용입니다.배지를 새로운 DMEM으로 조심스럽게 교체하고 HEK293T 세포를 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 공벡터 형질전환용과 GRHL2 형질전환용으로 각각 구분하여 두 개의 새로운 50 mL 원심관에 바이러스 배지 1 mL당 10 mg/mL polybrene 2 µL를 첨가합니다. 3 mL 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기 팁에 0.45 µm polyethersulfone 필터를 장착합니다.이전에 수집한 바이러스 배지를 시린지 배럴에 넣고, polybrene이 들어 있는 새 50 milliliter 원심 분리 튜브 중 하나에 주입합니다. 다른 샘플에 대해서도 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 진공 흡입을 통해 RD 세포의 배지를 제거하고, 필터링된 각 바이러스 배지 샘플 2 milliliter를 RD 플레이트의 서로 다른 웰에 추가합니다.RD 세포를 가습 인큐베이터 내 37°C에서 배양합니다. 다음 날, 바이러스 배지 수집 과정을 반복하고, 이전에 감염시킨 RD 세포가 들어 있는 동일한 웰에 감염 배지를 추가합니다. 바이러스 배지를 수집한 후 HEK293T 세포는 폐기해도 됩니다.세포를 이틀 더 배양합니다. 7일째에 RD 세포를 1 mL의 PBS로 세척한 후, 각 웰에 0.05% trypsin 200 µL를 첨가합니다. 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.보충 배지 2 mL를 추가한 다음, 세포 현탁액을 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 상온에서 250 g로 5분 동안 세포를 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 배지를 흡입하여 제거하고, 5% FBS와 1% penicillin streptomycin이 보충된 DMEM 1 mL에 세포를 재현탁합니다.유세포 분석을 위해 세포를 필터링하려면, 피펫을 사용하여 1 mL의 RD 세포 현탁액을 멸균된 30 µm 튜브 톱 필터를 통해 유세포 분석용 튜브에 넣습니다. 튜브를 얼음에 둡니다. 유세포 분석기를 사용하여 EGFP 양성 세포를 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 0.5 mL의 DMEM이 들어 있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 분리합니다.분류된 세포를 다시 얼음에 둡니다. 공벡터와 GRHL2가 형질도입된 두 군의 EGFP 양성 세포를 각각 12-웰 플레이트의 개별 웰에 보충된 DMEM 1 mL씩 넣어 분주합니다. 그런 다음 배양을 위해 세포를 인큐베이터에 넣습니다.유세포 분석 후 EGFP 양성 세포의 수율은 보통 50,000에서 100,000 세포 범위로 상당히 낮습니다. 이 때문에 다음 단계로 진행하기 전, 세포를 10~14일 정도 추가로 배양해야 할 수도 있습니다. 마이크로 원심분리 튜브에 50 µM miR-200 mimic 각각 3 µL를 무혈청 배지 300 µL에 첨가하십시오.별도의 튜브에 50 µM 음성 대조군 micro RNA 9 µL를 무혈청 배지 300 µL에 추가합니다. 다음으로, 다른 마이크로원심분리 튜브에 siRNA 특이적 트랜스펙션 시약 6 µL를 무혈청 배지 600 µL에 추가합니다. 이 혼합물 300 µL를 두 개의 튜브로 나누어, 각각의 두 가지 miR 혼합물에 각각 하나씩 배분합니다.각 miR 혼합물 300 µL를 트랜스펙션 시약 300 µL와 혼합합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 처리당 250 cells/µL의 무혈청 배지가 포함된 2.4 mL 내에 MD 벡터 또는 GRHL2를 발현하는 EGFP 양성 RD 세포 600,000개를 세포 현탁액으로 준비합니다.24웰 플레이트의 6개 웰에 miR-200 또는 음성 대조군 혼합물을 웰당 100 µL씩 넣습니다. 그런 다음 각 miR 혼합물이 들어 있는 웰 3개에 각 세포 현탁액 400 µL를 넣습니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 배지를 완전 보충 DMEM으로 교체합니다. 이틀 후 적절한 버퍼를 사용하여 분석을 위해 세포를 수집합니다. 자동 살아있는 세포 이미징 장치의 10X 대물렌즈를 사용하여 2시간마다 각 웰을 촬영합니다.이 타임랩스 이미지는 GRHL2, EGFP 및 miR-200 miRNA를 발현하는 RD 세포에서 일어나는 중간엽-상피 전환(mesenchymal-epithelial transition, MET)을 보여줍니다. 세포는 방추형에서 조약돌 모양의 외형으로 변하며, 세포 간 접착이 증가하고 더 둥근 형태를 띠게 됩니다. 다른 처리 조건에서는 MET가 관찰되지 않습니다.대신, 세포는 세포 간 부착이 거의 없는 길쭉한 방추형 형태를 보입니다. MET 유도 과정 중, GRHL2 및 miR-200 과발현에 따른 RD 세포의 형태학적 변화는 qPCR 및 웨스턴 블로팅으로 측정한 결과 상피 마커인 E-cadherin의 상향 조절을 동반했습니다. miR-200s의 첨가는 E-cadherin 단독으로 상향 조절했으나, miR-200s와 GRHL2의 병용 과발현은 E-cadherin 발현을 시너지적으로 강화했습니다.면역형광 현미경으로 관찰한 결과, 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 상피세포 접착 분자인 EpCAM 및 TJP-1이 세포 간 접합부에서 증가하였습니다. 상피 단백질의 상향 조절은 QRT-PCR로 측정한 mesenchymal 유전자인 ZEB1 및 Notch1의 하향 조절과 동반되었습니다. MET 유도는 soft agar 성장 분석으로 측정한 RD 세포의 부착 독립적 성장을 감소시켰습니다.GRHL2의 과발현은 부착 독립적 성장을 증가시켰으므로, 소프트 아가(soft agar)에서의 성장 억제는 miR-200s 단독에 의해 유도되었습니다. 이는 GRHL2 발현이 부착 독립적 성장을 유도한다는 이전의 보고들과 일치합니다. 이 절차 이후, 육종에서의 MET(상피-간엽 전이)로 인한 표현형적 결과를 규명하기 위해 세포 이동, 침습, 전이 및 치료 반응의 변화를 측정하는 분석을 포함한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

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학습하세요 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환을 유도하는 세포 배양 기법을. microRNA-200과 GRHL2를 이용하여 암 침윤성과 치료 전략에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

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