차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

이 실험의 전반적인 목표는 차세대 염기서열분석에 적합한 식물 잎 조직에서 고품질 소기관 DNA(플라스티드 및 미토콘드리아 DNA)를 분리하는 데 사용되는 두 가지 방법을 비교하는 것입니다. 이러한 방법은 분류군 전반에 걸친 소기관 다양성의 정도, 소기관 게놈 염기서열 또는 구조의 변화가 발달 및 스트레스 반응에 미치는 영향과 같은 식물 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 두 가지 기술, 즉 하나의 특정 소기관 유형에 대해 농축하는 차등 원심분리 방법과 더 작은 냉동 조직 샘플에서 총 소기관 DNA를 회수하는 메타 분획 기술을 비교할 것입니다.

밀 묘목을 재배하는 표준 절차는 모서리 당 4-6 개의 씨앗이있는 정사각형 화분에 질석으로 씨앗을 심는 것입니다. 화분을 16시간 조명 주기로 온실로 옮깁니다. 매일 식물에 물을 주십시오.

발아 시 과립 20-20-20 MPK 비료 1/4 티스푼으로 식물에 비료를 주고 발아 후 7일 후에 다시 비료를 줍니다. 밀 묘목의 adulation을 위해, 씨앗을 심고 표준 절차에서와 같이 식물을 돌보십시오. 그러나 화분을 어두운 성장실에 넣으십시오.

어두운 성장실에서 이러한 묘목을 키우는 것의 대안은 온실의 식물을 덮고 적절한 환기를 제공하는 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 소기관을 분리하는 것입니다. 5g의 신선한 조직을 채취하여 얼음 위의 식힌 비커에 넣고 차갑고 멸균된 물로 헹굽니다.

가위를 사용하여 잎 조직을 약 1cm 조각으로 자르고 두 개의 세라믹 분쇄 실린더가 들어 있는 미리 냉각된 50mm 튜브에 직접 넣습니다. 절차 내내 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 교차 오염을 방지하려면 샘플 사이에 가위를 교체하는 것이 중요합니다.

샘플을 흄 후드로 가져가 각 50ml 튜브에 20ml의 STE 버퍼를 추가합니다. 조직을 분쇄하는 기구에 있는 pre-chilled 저온 가는 구획으로 표본을 놓고 분당 1, 750 회전으로 30초 동안 표본을 갈아줍니다. 샘플을 얼음 위에 약 1분 동안 놓습니다.

샘플 위치를 회전하고 분당 1, 750회 회전으로 30초 더 분쇄합니다. 샘플을 얼음 양동이에 다시 넣습니다. 각 샘플에 대해 얼음에 넣은 깨끗한 50ml 튜브에 깔때기를 삽입하고 깔때기에 여과 천 한 겹을 놓습니다.

여과 천에 5ml의 STE 완충액을 미리 적셔 흐름을 저장합니다. 균질화된 조직을 깔때기에 붓습니다. 분쇄 튜브를 15ml의 STE 버퍼로 헹구고, 튜브를 다시 뚜껑을 덮고 뒤집어 벽과 뚜껑을 헹구고 내용물을 깔때기에 붓습니다.

세라믹 스톤을 조심스럽게 제거한 다음 여과 천을 짜서 깔때기에 짜냅니다. 교차 오염을 방지하려면 샘플 간에 장갑을 교체하십시오. 엎지르지 않도록 튜브 캡을 파라핀 필름으로 감쌉니다.

2, 000 x G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 다음으로, 혈청학 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인하고 밀폐 개스킷이 단단히 밀봉된 50ml 고속 원심분리 튜브에 넣습니다. 저울에 작은 얼음 비커를 놓고 저울을 찢고 각 상층액의 무게를 잰다.

0.1 그램 안에 관을 균형을 잡기 위하여 STE 완충기를 사용하고 그 후에 18, 000 x G에 20 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 분리기를 이용하십시오. 원심분리가 완료되면 샘플을 흄 후드에 다시 넣고 상층액을 폐기합니다. 펠릿에 1ml의 ST 버퍼를 추가하고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 부드럽게 다시 부유시킵니다.

24ml의 ST 버퍼를 추가하여 25ml의 최종 부피를 얻습니다. 현탁액으로 붓을 부드럽게 휘젓어 섞은 다음 붓을 제거하기 전에 튜브 측면에 있는 붓을 눌러 모든 액체를 제거합니다. 관을 균형을 잡기 후에, 18, 000 x 20 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 G 에 분리기.

이 원심분리 중에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA의 1 용액을 준비하고 샘플당 200마이크로리터를 1.5ml 튜브로 분주합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 버리고 튜브를 닦아냅니다. 각 고속 원심분리기 튜브에 300마이크로리터의 STE 완충액을 추가하고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

200마이크로리터의 DNA 1 용액이 들어 있는 미리 준비된 1.5ml 튜브에 페인트 브러시를 넣고 페인트 브러시를 휘젓아 브러시에 끼어 있는 잔여 펠릿을 제거합니다. DNA의 1 용액을 고속 원심분리기 튜브에 피펫으로 넣고 부드럽게 소용돌이치며 섞습니다. 각 튜브의 상단에 파라핀 필름을 감고 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.

부화하는 동안 소용돌이치면서 부드럽게 섞습니다. 넓은 오리피스가 있는 피펫 팁을 사용하여 튜브에서 펠릿 혼합물을 부드럽게 피펫으로 빼내고 1.5ml의 낮은 결합 튜브에 넣습니다. 500마이크로리터의 400밀리몰 EDTA, pH 8.0을 고속 원심분리기 튜브에 추가합니다.

잔류 펠릿을 완전히 제거하고 EDTA를 펠릿 혼합물이 들어있는 낮은 결합 튜브로 옮기기 위해 부드럽게 피펫을 넣으십시오. 반전으로 부드럽게 섞습니다. 18, 000 x G에서 20분 동안 섭씨 4도에서 원심분리기.

그 후, 상등액을 버리고 각 튜브를 닦아내고 즉시 DNA 분리를 위해 펠릿을 사용하십시오. 이 방법에서는 상용 DNA 추출 컬럼을 사용하여 추출한 총 유전체 DNA에서 소기관 DNA를 농축합니다. 제조업체의 지침에 따라 필요한 양의 MBD2 FC 단백질 결합 마그네틱 비드를 준비하고 총 입력 DNA의 1-2마이크로그램을 사용하도록 반응을 확장합니다.

이 시연에서는 1마이크로그램의 총 입력 DNA에 160마이크로리터의 비드가 필요합니다. 메틸화된 핵 DNA를 캡처하려면 각 개별 샘플에 대해 160마이크로리터의 MBD2 결합 마그네틱 비드가 들어 있는 튜브에 1마이크로그램의 입력 DNA를 추가하고 넓은 보어 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 최종 농도 1x를 위해 적절한 부피의 5x bind 세척 버퍼를 추가하고 넓은 보어 팁으로 샘플을 위아래로 피펫팅하여 몇 번 혼합합니다.

튜브를 실온에서 15분 동안 회전시킵니다. 풀다운의 성공을 위해서는 배양 중에, 특히 상당한 비드 응집이 있는 경우 비드를 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 비드 응집을 방지하고 메틸화된 DNA가 당겨지도록 하려면 넓은 구멍의 피펫 팁으로 샘플을 부드럽게 피펫팅하고 배양 내내 샘플을 2-3회 튕깁니다.

DNA와 마그네틱 비드 혼합물이 들어 있는 튜브를 간단히 돌립니다. 튜브를 마그네틱 랙에 최소 5분 동안 올려 놓고 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 용액은 투명하게 나타나야 하며 메틸화되지 않은 소기관이 풍부한 DNA를 함유하고 있어야 합니다.

넓은 보어 팁을 사용하여 비드를 방해하지 않고 투명화된 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 깨끗하고 결합력이 낮은 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 20도 또는 80도에서 보관하십시오. 전체 게놈 DNA에서 3개의 소기관 특이적 함축물과 두 가지 방법으로 얻은 소기관 DNA 분획의 상대적 풍부도를 평가하기 위해 급성 PCR 분석법을 사용했습니다.

전반적으로, 데이터는 차등 원심분리 방법이 우선적으로 미토콘드리아를 농축한다는 것을 나타냅니다. methylfractionated total genomic DNA의 unmethylated fraction은 두 organellar implicons의 상당한 농축을 보여줍니다. 미토콘드리아 또는 엽록체 중국 봄 및 크리스 재배 밀 참조 게놈에 매핑된 판독 비율은 QPCR 결과와 일치합니다.

차등 원심분리는 미토콘드리아 DNA가 더 풍부한 DNA를 수율하고 메틸분획법은 두 소기관 게놈의 선천적 풍부함을 반영하는 DNA를 수율합니다. E를 포함한 시료 라벨은 우측화된 시료를 지정하고, NE는 비관적 시료를 지정합니다. 흥미롭게도, 우상화(idyllation)는 세포기관 풍부도를 변화시키지 않았다.

두 방법 모두에서 미토콘드리아 또는 엽록체 참조 게놈의 이론적 적용 범위는 12개의 라이브러리가 재다중화되는 경우에도 100배 범위를 초과합니다. 총 게놈 DNA는 포스트 필드 젤 전기영동에서 확산된 도말로 이동하고 50kmbase를 초과합니다. 메틸분획 후 핵 분획은 크기가 감소하지만 약 50 킬로염기 중심을 유지하며, 이는 메틸프랙티오안티드 DNA가 긴 판독 염기서열분석에 가장 적합하다는 것을 시사합니다.

일단 숙달되면 두 가지 소기관 DNA 추출 기법을 적절하게 수행할 경우 샘플 수집에서 최종 제품 평가에 이르기까지 하루에서 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 메틸분획 기법은 조직 투입량이 극히 낮기 때문에 희귀하고 까다로운 샘플에 대한 소기관 DNA 연구의 범위를 크게 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 차등 원심분리는 다운스트림 연구에 미토콘드리아 DNA만 필요한 경우 여전히 선호될 수 있습니다.

마찬가지로, 원심분리 단계는 원하는 경우 플라스티드 DNA를 우선적으로 추출하도록 조정될 수 있습니다. 두 소기관 DNA 추출 방법 모두 차세대 염기서열분석에 적합한 DNA를 생성하지만, 메틸분획법은 Long Read 염기서열분석에 이상적인 고분자 속도의 DNA를 생성합니다.