Name: 차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 학습하세요 식물 잎 조직에서 고품질 세포소기관 DNA를 분리하는 차등 원심분리법과 메타 분획법을 비교하는 방법을. 차세대 시퀀싱에 적합한 DNA 품질 평가 기술을 익혀보세요.

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우리는 미국 농무부 농업 연구청과 국립 과학 재단 (IOS 1025881 및 IOS 1361554)으로부터 자금을 지원하고 싶습니다. 우리는 R. Caspers에게 온실 유지 관리 및 식물 관리에 감사드립니다. 우리는 Illumina 라이브러리 준비 및 시퀀싱이 수행 된 Minnesota Genomics Center 대학에도 감사드립니다. 저널 편집자와 4 명의 익명의 평론가가 우리 원고를 더욱 강화시킨 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 OECD가 일본의 동료들과 협력 프로젝트를 위해 이러한 프로토콜을 통합하는 SK와의 협력에 감사한다.

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<li>Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+extraction+and+assembly+methods+for+simultaneously+obtaining+plastid+and+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes.</a> PLoS One. 9 (9), e108291(2014).</li>
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저자는 경쟁적 이익이 없다고 선언합니다. 이 간행물의 상호 또는 상업 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기위한 목적 일 뿐이며 미 농무부 (US Department of Agriculture)의 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 기회 균등 제공자이자 고용주입니다.

지금까지 대부분의 organellar sequencing 연구는 특정 DC를 풍부하게하는 전통적인 DC 방법에 초점을두고 있습니다. 모스 ( 40)를 포함하여 다양한 식물로부터 세포 소기관을 분리하는 방법이 설명되었다. 밀 15 및 귀리 11 과 같은 단핵구; 아라비돕시스 11 , 해바라기 17 , 유채 14 등의 족자입니다. 대부분의 프로토콜은 잎 조직 13 , 14 , 15 , 16 , 17<...

<html> 게놈 시퀀싱은 중요한 식물 형질의 기본 유전 적 기초를 분석하는 강력한 도구입니다. 대부분의 게놈 시퀀싱 연구는 대부분의 유전자가 핵에 위치하므로 핵 게놈 내용에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, (진핵 생물에서) 미토콘드리아와 색소체 포함 organellar 게놈 (식물, 전문화 된 형태로, 엽록체, 광합성에서 작동)는 생명체의 개발, 스트레스 반응 및 전반적인 체력 1에 필수적인 중요한 유전 정보를 기여한다. Organellar 게놈은 일반적으로 핵 게놈 시퀀싱을위한 총 DNA 추출에 포함되지만 DNA 추출 이전에 세포 소기관 수를 줄이는 방법도 사용됩니다 2 . 많은 연구에서 전체 gDNA 추출물의 sequencing 결과를 사용하여 organellar 게놈 3 , 4 , 5 ,xref &quot;&gt; 6 , 7. 그러나 연구 대상이 세포 소기관 게놈에 초점을 맞추고있을 때 많은 gDNA가 핵산 염기 서열에&quot;손실 &quot;되어 있기 때문에 전체 핵산을 사용하면 시퀀싱 비용이 증가합니다. 적당한 게놈, bioinformatically 8 도전 2에 관한 것이다. 또한, 염기 서열의 정확한지도 위치를 해결 중복 핵 게놈 내로 소기관 사이 organellar 서열의 전사에 의한 읽기. 핵 게놈 organellar 게놈의 정제 하나이다 전략을 사용하여 미토콘드리아와 엽록체 사이의 상 동성 영역으로 매핑되는 판독을 분리 할 수 ​​있습니다. 많은 식물 종의 세포 소기관 게놈이 서열화되어 있지만, 소기관 게놈 다양성의 폭은 거의 알려져 있지 않습니다야생 개체군 또는 경작 된 육종 풀에서 이용 가능하다. Organellar 게놈은 또한 반복 서열 9 사이의 재조합으로 인해 중요한 구조적 재 배열을 거친 동적 분자로 알려져있다. 또한, 세포 소기관 게놈의 여러 사본이 각 세포 소기관에 포함되어 있으며, 여러 세포 소기관이 각 세포 내에 포함되어 있습니다. 이 게놈의 모든 사본이 동일하다는 것은 이질균이라고 알려져 있습니다. &quot;마스터 서클&quot;의 정경과는 달리 하위 게놈 서클, 선형 염색체, 선형 concatamers 및 가지 형 구조 10을 포함하여 organellar 게놈 구조의 더 복잡한 그림에 대한 증거가 증가하고 있습니다. 식물 세포 소기관 게놈의 조립은 상대적으로 큰 크기와 상당한 거꾸로 된 직접 반복에 의해 더욱 복잡해진다. 세포 기관 분리, DNA 정제 및 후속 유전체에 대한 기존의 프로토콜<html> 전자 시퀀싱은 종종 성가 시며 많은 양의 조직을 필요로하며 수백 g의 어린 잎 조직을 출발점 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17로 필요로 합니다. 이렇게하면 조직이 제한되어있을 때 세포 내 게놈 시퀀싱을 사용할 수 없게됩니다. 어떤 상황에서는, 세대 간 (through generational basis) 또는 교차점을 통해 유지되어야하는 수컷 멸균 계통에서 필요할 때와 같이, 종자의 양은 제한적이다. 이러한 상황에서 세포 내 소기관 DNA를 정제 한 다음 전체 게놈 증폭을 수행 할 수 있습니다. 그러나 전체 게놈 증폭은 구조적 변이, 하위 게놈 구조 및 이종성 수준을 평가할 때 특히 중요한 문제인 시퀀싱 바이어스를 도입 할 수 있습니다&gt; 18. 짧은 읽기 시퀀싱 기술에 대한 라이브러리 준비의 최근 발전은 전체 게놈 증폭을 피하기 위해 낮은 입력 장벽을 극복했습니다. 예를 들어, Illumina Nextera XT 라이브러리 준비 키트는 1 ng의 적은 DNA를 입력으로 사용할 수 있습니다 19 . 그러나 PacBio 또는 Oxford Nanopore 시퀀싱 기술과 같은 장시간 시퀀싱 응용 프로그램을위한 표준 라이브러리 준비에는 여전히 많은 양의 입력 DNA가 필요하며 이는 세포 내 게놈 시퀀싱에 대한 도전이 될 수 있습니다. 최근에, 입력량을 줄이고 마이크로 그램 - 양의 DNA를 얻기가 어려운 시료에서 게놈 시퀀싱을 용이하게하기 위해 사용자가 작성한 긴 판독 시퀀싱 프로토콜이 개발되었습니다 20 , 21 . 그러나, 고 분자량의 순수한 세포 내 소 분획을 이들 라이브러리 제제에 공급하는 것은 여전히 ​​어려운 과제이다. 우리는o 전체 게놈 증폭없이 NGS에 적합한 세포 내 DNA 농축 및 분리 방법을 비교 및 ​​최적화합니다. 구체적으로, 우리의 목표는 잎의 하위 샘플과 같이 제한된 출발 물질로부터 고 분자량 세포 기관 DNA를 풍부하게하는 우수 사례를 결정하는 것이 었습니다. 이 연구는 organellar DNA를 풍부하게하는 방법의 비교 분석을 제시한다 : (1) 상업적으로 이용 가능한 DNA CpG- 메틸 결합 도메인 단백질 풀다운 접근의 사용에 기초한 DNA 분획 프로토콜 (2) 수정 된 전통적인 분별 원심 분리 프로토콜 22 식물 조직에 적용 23 . 우리는 다른 식물 및 조직 유형으로 쉽게 확장 될 수있는 밀엽 조직으로부터 세포 기관 DNA를 분리하는 최상의 방법을 권장합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올(베타-메르캅토에탄올; BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올(이소프로필 알코올/이소프로판올), 생물 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>아가로스, Bio-Rad Cetified Megabase 아가로스</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1613108</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr><tr><td>저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>세라믹 분쇄 실린더, 3/8in x 7/8in</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브 고정용 조직 균질화기와 호환되는 극저온 블록</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 앱솔루트</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5m 용액, pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>겔 이미징 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겔 염색</td><td></td><td></td><td>GelRed 또는 Ethidium Bromide</td></tr><tr><td>분쇄 유봉, 2mL 원추형 튜브</td><td></td><td></td><td></td>용 와이드 팁</tr><tr><td>Guanidine-HCl, 8M 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>용해 효소 Trichoderma harzianum</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>자기 랙</td><td>ThermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, LoBind 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes, 표준 nuclease-free 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge, 냉장</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>범례 X1R</td><td>또는 동급의 제품은 50 mL 튜브, Oak Ridge 튜브 및 1.5 mL 튜브용 로터로 최소 18,000 x g에 도달할 수 있어야 합니다</td></tr>. <tr><td>마이크로 원심분리기, 실온</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>또는 이와 동등한 제품은 1.5 mL 및 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브용 로터를 사용하여 최소 18,000 x g에 도달할 수 있어야 합니다</td></tr>. <tr><td>Microcon DNA 고속 흐름 원심 필터 장치</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth, 깔때기</td><td>EMD Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Parafilm M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 냄비 및 쟁반</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈(PVP)</td><td>Fisher</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>펄스 필드 겔 전기영동 장비(예: CHEF DR III)</td><td>bio-Rad</td><td>1703697</td><td></td></tr><tr><td>정제 비드, Agencourt AMpureXP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 20/g 게놈 팁 DNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB(용리 버퍼)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA 추출 버퍼 세트</td><td>Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 기계(예: Roche Light Cycler 480)</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트 밀봉 필름</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트, 96웰 플레이트</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>큐비트&nbsp; 어세이 튜브</td>: <td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 광범위 스펙트럼 어세이 키트</td>, <td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td></td></tr>, <tr><td>Qubit 고감도 어세이 키트</td><td>, Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr>, <tr><td>RNaseA,</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr>, <tr><td>혈청학적 피펫(20mL) 및 피펫 보조기,</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>소형 깔때기, 시료당 1개</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>소프트 페인트 브러시, 샘플</td><td></td><td></td><td></td>당 2</tr><tr><td>개 SPEX SamplePrep 2010 Geno / Grinder 또는 다른 유형의 조직 균질화 기</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>또는 다른 유사한 조직 균질 기. 조직 균질기에 접근할 수 없는 경우 미리 냉각된 모르타르와 절굿공이에서 분쇄하는 것으로 충분합니다(자세한 내용은 프로토콜 참조). 그러나 균질화기는 보다 일관된 결과를 제공하고 총 균질화 시간이 단축됩니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Omnipure</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>써모믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>튜브 회전기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브, 50mL 원추형 폴리프로필렌</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>튜브, 50mL 고속 폴리프로필렌&nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>예: Nalgene Oakridge 튜브 또는 동등한</td></tr><tr><td>질석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 목욕</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물, 멸균 및 인증된 Nuclease-free&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1481</td><td></td></tr><tr><td>물, 멸균 milliQ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 dna 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

식물 세포 소기관 게놈은 복잡한 구조 및 / 또는 서브 게놈 조각을 형성하기 위해 페어링 또는 재조합을 거칠 수있는 크고 반복적 인 요소를 포함합니다. Organellar 게놈은 또한 주어진 세포 또는 조직 유형 (heteroplasmy) 내의 혼합물에 존재하며, 아형의 다량은 발육 기간 동안 또는 스트레스하에있을 때 (부분 화학량 론적 이동) 변화 할 수있다. 세포 기관 게놈 구조와 기능에 대한 더 깊은 이해를 위해서는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이 필요합니다. 전통적인 sequencing 연구는 organellar DNA를 얻기 위해 몇 가지 방법을 사용합니다 : (1) 대량의 시작 조직이 사용되면 균질화되고 차등 원심 분리 및 / 또는 기울기 정화가 이루어집니다. (종자, 재료 또는 공간이 한정되어있는 경우, 즉) (2) 조직의 작은 양이 사용된다면, 동일한 프로세스는 (1) 충분한 DNA를 얻기 위해 전체 게놈 증폭 다음과 같이 수행된다. (3) 생물 정보학 분석은 seq전체 게놈 DNA를 분석하고 세포 기관 판독을 분석합니다. 이러한 모든 방법에는 고유 한 문제점과 단점이 있습니다. (1)에서 이와 같이 많은 양의 시작 조직을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. (2)에서, 전체 게놈 증폭은 시퀀싱 바이어스를 도입 할 수있다; (3)에서 핵과 세포 내 게놈 간의 상동 성은 집합과 분석을 방해 할 수있다. 거대한 핵 게놈을 가진 식물에서, organellar DNA를 풍부하게하여 생물 정보학 분석을위한 서열화 비용 및 서열 복잡성을 줄이는 것이 유리하다. 여기에서 전통적인 차동 원심 분리 방법과 네 번째 방법 인 CpG- 메틸 풀다운 방식을 비교하여 총 게놈 DNA를 핵 및 세포 내 분획으로 분리합니다. 두 가지 방법 모두 미토콘드리아와 엽록체의 비율이 다르긴하지만 세포 내 소기관 서열에 대해 고도로 농축 된 DNA 인 NGS에 충분한 양의 DNA를 생산합니다. 우리는 밀 잎 조직을위한 이러한 방법의 최적화를 제시하고 주요 이점과 d샘플 입력, 프로토콜 용이성 및 다운 스트림 응용 프로그램의 맥락에서 각 접근법의 단점.

이 원고에 제시된 프로토콜은 식물 조직에서 세포 기관 DNA를 풍부하게하는 두 가지 방법을 설명합니다. 여기에 제시된 조건은 밀의 조직 최적화를 반영합니다. 프로토콜의 주요 단계, 필요한 조직 입력 및 DNA 출력의 비교는 그림 1에 설명되어 있습니다. 우리가 테스트 한 DC 프로토콜의 단계는 이전에 설명한 것과 비슷한 조건을 따른다 ( 그림 1A ). 수확 된 조직은 신선하게 처리해야하며 차별화 된 원심 분리 및 / 또는 그라디언트를 적용하여 손상되지 않은 세포 기관을 분리해야합니다. 소기관이 용해되기 전에 핵 DNA가 제거되고 마지막으로 DNA가 추출되어 하류 적용에 사용됩니다. 대조적으로, MF 프로토콜에서, 식물 조직은 사용 전에 수확되고 저장 될 수 있으며, 손상되지 않은 세포 소기관은 필요하지 않습니다. 그 대신, 핵 및 세포 기관 DNA는 전체 gDN...

2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 ​​최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

이 실험의 전반적인 목표는 차세대 염기서열분석에 적합한 식물 잎 조직에서 고품질 소기관 DNA(플라스티드 및 미토콘드리아 DNA)를 분리하는 데 사용되는 두 가지 방법을 비교하는 것입니다. 이러한 방법은 분류군 전반에 걸친 소기관 다양성의 정도, 소기관 게놈 염기서열 또는 구조의 변화가 발달 및 스트레스 반응에 미치는 영향과 같은 식물 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 두 가지 기술, 즉 하나의 특정 소기관 유형에 대해 농축하는 차등 원심분리 방법과 더 작은 냉동 조직 샘플에서 총 소기관 DNA를 회수하는 메타 분획 기술을 비교할 것입니다.밀 묘목을 재배하는 표준 절차는 모서리 당 4-6 개의 씨앗이있는 정사각형 화분에 질석으로 씨앗을 심는 것입니다. 화분을 16시간 조명 주기로 온실로 옮깁니다. 매일 식물에 물을 주십시오.발아 시 과립 20-20-20 MPK 비료 1/4 티스푼으로 식물에 비료를 주고 발아 후 7일 후에 다시 비료를 줍니다. 밀 묘목의 adulation을 위해, 씨앗을 심고 표준 절차에서와 같이 식물을 돌보십시오. 그러나 화분을 어두운 성장실에 넣으십시오.어두운 성장실에서 이러한 묘목을 키우는 것의 대안은 온실의 식물을 덮고 적절한 환기를 제공하는 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 소기관을 분리하는 것입니다. 5g의 신선한 조직을 채취하여 얼음 위의 식힌 비커에 넣고 차갑고 멸균된 물로 헹굽니다.가위를 사용하여 잎 조직을 약 1cm 조각으로 자르고 두 개의 세라믹 분쇄 실린더가 들어 있는 미리 냉각된 50mm 튜브에 직접 넣습니다. 절차 내내 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 교차 오염을 방지하려면 샘플 사이에 가위를 교체하는 것이 중요합니다.샘플을 흄 후드로 가져가 각 50ml 튜브에 20ml의 STE 버퍼를 추가합니다. 조직을 분쇄하는 기구에 있는 pre-chilled 저온 가는 구획으로 표본을 놓고 분당 1, 750 회전으로 30초 동안 표본을 갈아줍니다. 샘플을 얼음 위에 약 1분 동안 놓습니다.샘플 위치를 회전하고 분당 1, 750회 회전으로 30초 더 분쇄합니다. 샘플을 얼음 양동이에 다시 넣습니다. 각 샘플에 대해 얼음에 넣은 깨끗한 50ml 튜브에 깔때기를 삽입하고 깔때기에 여과 천 한 겹을 놓습니다.여과 천에 5ml의 STE 완충액을 미리 적셔 흐름을 저장합니다. 균질화된 조직을 깔때기에 붓습니다. 분쇄 튜브를 15ml의 STE 버퍼로 헹구고, 튜브를 다시 뚜껑을 덮고 뒤집어 벽과 뚜껑을 헹구고 내용물을 깔때기에 붓습니다.세라믹 스톤을 조심스럽게 제거한 다음 여과 천을 짜서 깔때기에 짜냅니다. 교차 오염을 방지하려면 샘플 간에 장갑을 교체하십시오. 엎지르지 않도록 튜브 캡을 파라핀 필름으로 감쌉니다.2, 000 x G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 다음으로, 혈청학 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인하고 밀폐 개스킷이 단단히 밀봉된 50ml 고속 원심분리 튜브에 넣습니다. 저울에 작은 얼음 비커를 놓고 저울을 찢고 각 상층액의 무게를 잰다.0.1 그램 안에 관을 균형을 잡기 위하여 STE 완충기를 사용하고 그 후에 18, 000 x G에 20 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 분리기를 이용하십시오. 원심분리가 완료되면 샘플을 흄 후드에 다시 넣고 상층액을 폐기합니다. 펠릿에 1ml의 ST 버퍼를 추가하고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 부드럽게 다시 부유시킵니다.24ml의 ST 버퍼를 추가하여 25ml의 최종 부피를 얻습니다. 현탁액으로 붓을 부드럽게 휘젓어 섞은 다음 붓을 제거하기 전에 튜브 측면에 있는 붓을 눌러 모든 액체를 제거합니다. 관을 균형을 잡기 후에, 18, 000 x 20 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 G 에 분리기.이 원심분리 중에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA의 1 용액을 준비하고 샘플당 200마이크로리터를 1.5ml 튜브로 분주합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 버리고 튜브를 닦아냅니다. 각 고속 원심분리기 튜브에 300마이크로리터의 STE 완충액을 추가하고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.200마이크로리터의 DNA 1 용액이 들어 있는 미리 준비된 1.5ml 튜브에 페인트 브러시를 넣고 페인트 브러시를 휘젓아 브러시에 끼어 있는 잔여 펠릿을 제거합니다. DNA의 1 용액을 고속 원심분리기 튜브에 피펫으로 넣고 부드럽게 소용돌이치며 섞습니다. 각 튜브의 상단에 파라핀 필름을 감고 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.부화하는 동안 소용돌이치면서 부드럽게 섞습니다. 넓은 오리피스가 있는 피펫 팁을 사용하여 튜브에서 펠릿 혼합물을 부드럽게 피펫으로 빼내고 1.5ml의 낮은 결합 튜브에 넣습니다. 500마이크로리터의 400밀리몰 EDTA, pH 8.0을 고속 원심분리기 튜브에 추가합니다.잔류 펠릿을 완전히 제거하고 EDTA를 펠릿 혼합물이 들어있는 낮은 결합 튜브로 옮기기 위해 부드럽게 피펫을 넣으십시오. 반전으로 부드럽게 섞습니다. 18, 000 x G에서 20분 동안 섭씨 4도에서 원심분리기.그 후, 상등액을 버리고 각 튜브를 닦아내고 즉시 DNA 분리를 위해 펠릿을 사용하십시오. 이 방법에서는 상용 DNA 추출 컬럼을 사용하여 추출한 총 유전체 DNA에서 소기관 DNA를 농축합니다. 제조업체의 지침에 따라 필요한 양의 MBD2 FC 단백질 결합 마그네틱 비드를 준비하고 총 입력 DNA의 1-2마이크로그램을 사용하도록 반응을 확장합니다.이 시연에서는 1마이크로그램의 총 입력 DNA에 160마이크로리터의 비드가 필요합니다. 메틸화된 핵 DNA를 캡처하려면 각 개별 샘플에 대해 160마이크로리터의 MBD2 결합 마그네틱 비드가 들어 있는 튜브에 1마이크로그램의 입력 DNA를 추가하고 넓은 보어 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 최종 농도 1x를 위해 적절한 부피의 5x bind 세척 버퍼를 추가하고 넓은 보어 팁으로 샘플을 위아래로 피펫팅하여 몇 번 혼합합니다.튜브를 실온에서 15분 동안 회전시킵니다. 풀다운의 성공을 위해서는 배양 중에, 특히 상당한 비드 응집이 있는 경우 비드를 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 비드 응집을 방지하고 메틸화된 DNA가 당겨지도록 하려면 넓은 구멍의 피펫 팁으로 샘플을 부드럽게 피펫팅하고 배양 내내 샘플을 2-3회 튕깁니다.DNA와 마그네틱 비드 혼합물이 들어 있는 튜브를 간단히 돌립니다. 튜브를 마그네틱 랙에 최소 5분 동안 올려 놓고 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 용액은 투명하게 나타나야 하며 메틸화되지 않은 소기관이 풍부한 DNA를 함유하고 있어야 합니다.넓은 보어 팁을 사용하여 비드를 방해하지 않고 투명화된 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 깨끗하고 결합력이 낮은 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 20도 또는 80도에서 보관하십시오. 전체 게놈 DNA에서 3개의 소기관 특이적 함축물과 두 가지 방법으로 얻은 소기관 DNA 분획의 상대적 풍부도를 평가하기 위해 급성 PCR 분석법을 사용했습니다.전반적으로, 데이터는 차등 원심분리 방법이 우선적으로 미토콘드리아를 농축한다는 것을 나타냅니다. methylfractionated total genomic DNA의 unmethylated fraction은 두 organellar implicons의 상당한 농축을 보여줍니다. 미토콘드리아 또는 엽록체 중국 봄 및 크리스 재배 밀 참조 게놈에 매핑된 판독 비율은 QPCR 결과와 일치합니다.차등 원심분리는 미토콘드리아 DNA가 더 풍부한 DNA를 수율하고 메틸분획법은 두 소기관 게놈의 선천적 풍부함을 반영하는 DNA를 수율합니다. E를 포함한 시료 라벨은 우측화된 시료를 지정하고, NE는 비관적 시료를 지정합니다. 흥미롭게도, 우상화(idyllation)는 세포기관 풍부도를 변화시키지 않았다.두 방법 모두에서 미토콘드리아 또는 엽록체 참조 게놈의 이론적 적용 범위는 12개의 라이브러리가 재다중화되는 경우에도 100배 범위를 초과합니다. 총 게놈 DNA는 포스트 필드 젤 전기영동에서 확산된 도말로 이동하고 50kmbase를 초과합니다. 메틸분획 후 핵 분획은 크기가 감소하지만 약 50 킬로염기 중심을 유지하며, 이는 메틸프랙티오안티드 DNA가 긴 판독 염기서열분석에 가장 적합하다는 것을 시사합니다.일단 숙달되면 두 가지 소기관 DNA 추출 기법을 적절하게 수행할 경우 샘플 수집에서 최종 제품 평가에 이르기까지 하루에서 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 메틸분획 기법은 조직 투입량이 극히 낮기 때문에 희귀하고 까다로운 샘플에 대한 소기관 DNA 연구의 범위를 크게 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 차등 원심분리는 다운스트림 연구에 미토콘드리아 DNA만 필요한 경우 여전히 선호될 수 있습니다.마찬가지로, 원심분리 단계는 원하는 경우 플라스티드 DNA를 우선적으로 추출하도록 조정될 수 있습니다. 두 소기관 DNA 추출 방법 모두 차세대 염기서열분석에 적합한 DNA를 생성하지만, 메틸분획법은 Long Read 염기서열분석에 이상적인 고분자 속도의 DNA를 생성합니다.

optimization-comparative-analysis-plant-organellar-dna-enrichment

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

메타유전체학(Metagenomics)을 사용하여 사일리지 소 사료의 마이크로바이옴을 조사했습니다. 분석은 샷건 염기서열분석(shotgun sequencing)으로 수행하였다. 이 접근법은 소 사료 내 미생물 군집의 구성을 특성화하는 데 사용되었습니다.

목초의 군 유전체학 분석

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

이 문서에서는 DNA 분리 및 매우 가난한 품질 DNA의 구조를 포함 하 여 식물 표본 상자 물자에서 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축을 위한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

타겟된 다음-세대 시퀀싱 질병 연구 및 임상 진단에서 점점 인기 끌고있다는 시간 및 비용 효율적인 접근 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 시퀀싱에 필요한 복잡 한 워크플로 및 질병을 유전 이체를 식별 하는 데 사용 하는 생물 정보학 과정을 제공 합니다.

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

이 프로토콜의 목적은 계산의 조합 및 벤치 연구를 사용 하 여 부분적 으로만 알려져 있을 수 있습니다 공동 정화 시퀀스에서 쉽게 분리 될 수 없는 새로운 시퀀스를 찾을 것입니다.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

본 프로토콜은 식물 기반 의약 물질을 인증하기 위해 DNA 바코드 기술을 사용하는 것을 설명하고 있으며, 약용 식물 Angelica sinensis (Oliv.) Diels가 그 예로 확인되었습니다.

약용 식물을 식별하기 위한 DNA 바코드 적용

학습하세요 식물 잎 조직에서 고품질 세포소기관 DNA를 분리하는 차등 원심분리법과 메타 분획법을 비교하는 방법을. 차세대 시퀀싱에 적합한 DNA 품질 평가 기술을 익혀보세요.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

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