재조합 및 유전자 표적화
현대 생물학에서 가장 널리 사용되는 도구 중 하나는 제한 효소를 가진 분자 복제이며, 이는 DNA 단편 간에 호환되는 끝을 만들어 결합 할 수 있습니다. 그러나, 이 기술은 크거나 복잡한 DNA 구조물 생성을 위한 그것의 적용성을 제한하는 특정 제한이 있습니다. 이러한…
동종 재조합에 의한 복제, 또는 재결합, 크게 높은 처리량 유전 공학을 수행하는 연구원의 능력을 향상시켰습니다. 고전적인 분자 복제는 벡터와 인서트의 소화를 필요로하여 "재결합"을 위해 호환되는 끝을 생성하지만 특히 게놈 DNA의 스트레칭과 같은 더 긴 서열에서 영역을 분리하려고 할 때, 항상 관심 영역 을 중심으로 고유하게 절단되는 효소를 제한하지 않으며, 지역 내 또는 다른 서열의 다른 곳에서는 그렇지 않다. 이러한 제한 부위의 필요성을 피함으로써, 재결합은 유전 공학 구조를 만드는 훨씬 더 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
이 비디오에서는 유전자 재조합의 원리를 소개하고, 유전자 표적 벡터를 재결합하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공하고, 이러한 기술의 여러 응용 분야에 대해 논의할 것입니다.
먼저 재조합이 무엇이며 어떻게 적용할 수 있는지에 대해 살펴보겠습니다.
유전 적 재조합은 DNA 분자 사이의 정보의 교환을 수반한다. "동종 재조합"에서 유사하거나 동일한 DNA 서열의 상대적으로 큰 스트레칭이 교환됩니다. 세포는 이중 가닥 나누기를 복구하기 위하여 이 프로세스를 사용하고, 성적으로 재생하는 진핵생물은 또한 유전 다양성을 증가시키기 위하여 meiosis 도중 동종 염색체 사이에서 이것을 실행합니다.
동종 재조합은 "유전자 표적화"라고 불리는 세포에서 특정 내인성 로시의 변형을 포함하여 여러 가지 실험 적 목적을 위해 활용되었습니다. 그것은 또한 유전 구조의 공학에 적용됩니다, 라는 프로세스 "재결합," 유기체의 게놈을 대상으로 DNA의 큰 뻗어에 수정을 만들기 위해 특히 유용합니다. 이렇게 하기 위하여는, 연구원은 "게놈 도서관" 또는 긴 게놈 DNA 단편을 포함하는 벡터의 세트를 각각 이용할 수 있습니다. 일반적으로 세균 클론에 전파되는 다양한 유형의 라이브러리가 만들어졌으며 상업 또는 비영리 저장소에서 주문할 수 있습니다. 게놈 라이브러리의 가장 일반적으로 사용되는 유형 중 하나는 150-350 킬로베이스 사이의 삽입 크기를 수행 할 수있는 세균성 인공 염색체 또는 BAC라고합니다.
구조를 재결합하기 위해서는 과학자들은 동종 재조합이 발생하는 유기체가 필요합니다. 효모 Saccharomyces cerevisiae는 자연적으로 "재조합 유능한"이며 벡터와 삽입 사이의 동종 재조합을 쉽게 수행 할 수 있습니다. 또 다른 일반적으로 적용 된 시스템은 박테리아 대장균에서재구성되는 박테리오파지 람다에서 "빨간색"단백질을 사용합니다. 벡터는 이전에 확립된 적색 발현 세균균종에서 재결합될 수 있거나, 또는 적색 시스템 구성 요소를 코딩하는 플라스미드 인코딩은 박테리아로 재결합기판과 함께 공동 변환될 수 있다.
이제 프로토콜을 통해 재결합하여 유전자 타겟팅 벡터를 만들어 보겠습니다.
이 프로토콜의 목적은 특정 유전자에 표적으로 한 변경을 가진 유전자 변형마우스를 만드는 것입니다. 간단히, 관심 있는 유전자에 원하는 수정은 BAC에서 이루어집니다; 수정된 서열은 표적 벡터로 "검색"되고, 이 벡터는 유전자 표적화를 위한 배아 줄기 세포로 전염된다. 줄기 세포는 그 때 유전으로 변형된 동물을 생성하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 최종 절차에 대한 지침은 JoVE 과학 교육 비디오 "모델 유기체의 유전 공학"을 참조하십시오.
시작하려면, 관심의 게놈 순서를 포함하는 BAC 클론이 확인되고 주문된다. 다음으로, 30-50베이스페어 균등 영역을 포함하는 상동성 무기 또는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 관심 유전자를 수정하는 데 사용되는 DNA "카세트"를 생성하는 PCR 반응의 프라이머로 사용됩니다. 이 카세트는 전형적으로, 예를 들면, 많은 공개적으로 이용 가능한 플라스미드에서 쉽게 증폭될 수 있는 선택 마커로 작동할 수 있는 항생 저항 유전자를 포함합니다. BAC 세균 클론은 전기화에 의해, 예를 들어, 적색 시스템 구성 요소를 인코딩하는 플라스미드와 함께 변형되고, 그 다음에 는 상동성 암 함유 카세트가 뒤따릅니다. 박테리아는 재조합을 유도하기 위하여 적당한 온도에서 배양됩니다.
BAC에서 수정된 시퀀스를 복구하기 위해 "검색" 벡터는 수정 부위 주변의 여러 킬로베이스를 포함하는 모동성 무기를 포함하는 프라이머를 사용하여 선형화되고 증폭됩니다. 이러한 벡터 백본은 BAC 세균 클론으로 변형되고 재결합이 다시 유도된다. 벡터는 BAC로부터 적절한 시퀀스를 "검색"하여 "갭 복구"됩니다. 이는 수정된 서열을 둘러싼 게놈 DNA에 상동성인 영역뿐만 아니라, 수정된 관심서열을 포함하는 유전자 표적화 벡터를 초래한다. 이러한 벡터는 내인성 균질 재조합 기계가 수정된 서열을 해당 궤적으로 표적으로 하여 숙주 게놈을 변화시키는 배아 줄기 세포로 정제, 선형화 및 도입될 수 있다.
이제 재조합 기반 엔지니어링 기술의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
첫째, 연구원은 단백질 복합체를 연구하기 위하여 세균게놈을 빠르고 쉽게 설계하기 위하여 재결합을 사용할 수 있습니다. 여기서, 카세트는 순차적 펩타이드 친화성 태그뿐만 아니라 카나마이신 저항 선택 마커를 관심 있는 유전자의 3¢F 끝으로 재결합하도록 설계되었다. 이 벡터는 그 때 빨간 "재조합 유능한" 대장균으로소개되고, 성공적인 재조합제는 선택적 매체를 사용하여 격리되었다. 태그된 단백질 복합체는 태그에 강하게 결합하는 단백질을 사용하여 생화학적으로 정제되었고, 질량 분석법에 의해 분석되어 관심 있는 단백질의 상호 작용 파트너를 식별하였다.
재결합 및 유전자 표적화는 또한 질병 톡소플라즈마를 일으키는 원인이 되는 의무적인 세포내 기생충 Toxoplasma 곤디와같은 기생 유기체의 게놈을 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 표적 벡터는 효모에서 재결합되었고, 여기서 관심 유전자를 측면시키는 게놈 서열이 선택 마커 주위에 배치되었다. 벡터는 그 때 기생충으로 선형화되고 전기화되었다. 선택적 매체에서 희석 도금을 제한하는 것은 성공적인 재조합제를 분리하는 데 사용되었으며, 기생충의 상동성 재조합 기계는 게놈 서열을 엔지니어링 된 서열로 대체하여 관심있는 유전자를 삭제했습니다. 표적 영역의 PCR은 양성 재결합 이벤트를 확인했습니다.
마지막으로, 서브클론 플러스 삽입 또는 SPI로 알려진 절차는 갭 수리 및 카세트 삽입이 동시에 발생하는 것을 고안하여 재결합 공정을 더 간단하고 유연하게 만듭니다. 이 공정의 성공에 중요한 것은 최대 180bp의 다중 상동성 무기의 적절한 설계로, 재조합 효율을 높이기 위해 기존의 재결합보다 더 길다. PCR에 의해 소염 플라스미드 및 삽입 카세트에 호모로지 암을 통합한 후, 그들은 함께 적색 표현 BAC 클론으로 변형되었고, 재결합이 유도되었다. 성공적으로 재결합된 구문은 PCR 또는 제한 다이제스트 분석에 의해 확인되었습니다.
당신은 재결합에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오에서는 재조합의 원리와 유전 공학, 재결합 프로젝트의 프로토콜 및 마지막으로 이러한 기술의 여러 응용 분야에서 어떻게 사용할 수 있는지에 대해 논의했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
동종 재조합에 의한 복제, 또는 재결합, 크게 높은 처리량 유전 공학을 수행하는 연구원의 능력을 향상시켰습니다. 고전적인 분자 복제는 벡터와 인서트의 소화를 필요로하여 "재결합"을 위해 호환되는 끝을 생성하지만 특히 게놈 DNA의 스트레칭과 같은 더 긴 서열에서 영역을 분리하려고 할 때, 항상 관심 영역 을 중심으로 고유하게 절단되는 효소를 제한하지 않으며, 지역 내 또는 다른 서열의 다른 곳에서는 그렇지 않다. 이러한 제한 부위의 필요성을 피함으로써, 재결합은 유전 공학 구조를 만드는 훨씬 더 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
이 비디오에서는 유전자 재조합의 원리를 소개하고, 유전자 표적 벡터를 재결합하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공하고, 이러한 기술의 여러 응용 분야에 대해 논의할 것입니다.
먼저 재조합이 무엇이며 어떻게 적용할 수 있는지에 대해 살펴보겠습니다.
유전 적 재조합은 DNA 분자 사이의 정보의 교환을 수반한다. "동종 재조합"에서 유사하거나 동일한 DNA 서열의 상대적으로 큰 스트레칭이 교환됩니다. 세포는 이중 가닥 나누기를 복구하기 위하여 이 프로세스를 사용하고, 성적으로 재생하는 진핵생물은 또한 유전 다양성을 증가시키기 위하여 meiosis 도중 동종 염색체 사이에서 이것을 실행합니다.
동종 재조합은 "유전자 표적화"라고 불리는 세포에서 특정 내인성 로시의 변형을 포함하여 여러 가지 실험 적 목적을 위해 활용되었습니다. 그것은 또한 유전 구조의 공학에 적용됩니다, 라는 프로세스 "재결합," 유기체의 게놈을 대상으로 DNA의 큰 뻗어에 수정을 만들기 위해 특히 유용합니다. 이렇게 하기 위하여는, 연구원은 "게놈 도서관" 또는 긴 게놈 DNA 단편을 포함하는 벡터의 세트를 각각 이용할 수 있습니다. 일반적으로 세균 클론에 전파되는 다양한 유형의 라이브러리가 만들어졌으며 상업 또는 비영리 저장소에서 주문할 수 있습니다. 게놈 라이브러리의 가장 일반적으로 사용되는 유형 중 하나는 150-350 킬로베이스 사이의 삽입 크기를 수행 할 수있는 세균성 인공 염색체 또는 BAC라고합니다.
구조를 재결합하기 위해서는 과학자들은 동종 재조합이 발생하는 유기체가 필요합니다. 효모 Saccharomyces cerevisiae는 자연적으로 "재조합 유능한"이며 벡터와 삽입 사이의 동종 재조합을 쉽게 수행 할 수 있습니다. 또 다른 일반적으로 적용 된 시스템은 박테리아 대장균에서재구성되는 박테리오파지 람다에서 "빨간색"단백질을 사용합니다. 벡터는 이전에 확립된 적색 발현 세균균종에서 재결합될 수 있거나, 또는 적색 시스템 구성 요소를 코딩하는 플라스미드 인코딩은 박테리아로 재결합기판과 함께 공동 변환될 수 있다.
이제 프로토콜을 통해 재결합하여 유전자 타겟팅 벡터를 만들어 보겠습니다.
이 프로토콜의 목적은 특정 유전자에 표적으로 한 변경을 가진 유전자 변형마우스를 만드는 것입니다. 간단히, 관심 있는 유전자에 원하는 수정은 BAC에서 이루어집니다; 수정된 서열은 표적 벡터로 "검색"되고, 이 벡터는 유전자 표적화를 위한 배아 줄기 세포로 전염된다. 줄기 세포는 그 때 유전으로 변형된 동물을 생성하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 최종 절차에 대한 지침은 JoVE 과학 교육 비디오 "모델 유기체의 유전 공학"을 참조하십시오.
시작하려면, 관심의 게놈 순서를 포함하는 BAC 클론이 확인되고 주문된다. 다음으로, 30-50베이스페어 균등 영역을 포함하는 상동성 무기 또는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 관심 유전자를 수정하는 데 사용되는 DNA "카세트"를 생성하는 PCR 반응의 프라이머로 사용됩니다. 이 카세트는 전형적으로, 예를 들면, 많은 공개적으로 이용 가능한 플라스미드에서 쉽게 증폭될 수 있는 선택 마커로 작동할 수 있는 항생 저항 유전자를 포함합니다. BAC 세균 클론은 전기화에 의해, 예를 들어, 적색 시스템 구성 요소를 인코딩하는 플라스미드와 함께 변형되고, 그 다음에 는 상동성 암 함유 카세트가 뒤따릅니다. 박테리아는 재조합을 유도하기 위하여 적당한 온도에서 배양됩니다.
BAC에서 수정된 시퀀스를 복구하기 위해 "검색" 벡터는 수정 부위 주변의 여러 킬로베이스를 포함하는 모동성 무기를 포함하는 프라이머를 사용하여 선형화되고 증폭됩니다. 이러한 벡터 백본은 BAC 세균 클론으로 변형되고 재결합이 다시 유도된다. 벡터는 BAC로부터 적절한 시퀀스를 "검색"하여 "갭 복구"됩니다. 이는 수정된 서열을 둘러싼 게놈 DNA에 상동성인 영역뿐만 아니라, 수정된 관심서열을 포함하는 유전자 표적화 벡터를 초래한다. 이러한 벡터는 내인성 균질 재조합 기계가 수정된 서열을 해당 궤적으로 표적으로 하여 숙주 게놈을 변화시키는 배아 줄기 세포로 정제, 선형화 및 도입될 수 있다.
이제 재조합 기반 엔지니어링 기술의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
첫째, 연구원은 단백질 복합체를 연구하기 위하여 세균게놈을 빠르고 쉽게 설계하기 위하여 재결합을 사용할 수 있습니다. 여기서, 카세트는 순차적 펩타이드 친화성 태그뿐만 아니라 카나마이신 저항 선택 마커를 관심 있는 유전자의 3¢F 끝으로 재결합하도록 설계되었다. 이 벡터는 그 때 빨간 "재조합 유능한" 대장균으로소개되고, 성공적인 재조합제는 선택적 매체를 사용하여 격리되었다. 태그된 단백질 복합체는 태그에 강하게 결합하는 단백질을 사용하여 생화학적으로 정제되었고, 질량 분석법에 의해 분석되어 관심 있는 단백질의 상호 작용 파트너를 식별하였다.
재결합 및 유전자 표적화는 또한 질병 톡소플라즈마를 일으키는 원인이 되는 의무적인 세포내 기생충 Toxoplasma 곤디와같은 기생 유기체의 게놈을 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 표적 벡터는 효모에서 재결합되었고, 여기서 관심 유전자를 측면시키는 게놈 서열이 선택 마커 주위에 배치되었다. 벡터는 그 때 기생충으로 선형화되고 전기화되었다. 선택적 매체에서 희석 도금을 제한하는 것은 성공적인 재조합제를 분리하는 데 사용되었으며, 기생충의 상동성 재조합 기계는 게놈 서열을 엔지니어링 된 서열로 대체하여 관심있는 유전자를 삭제했습니다. 표적 영역의 PCR은 양성 재결합 이벤트를 확인했습니다.
마지막으로, 서브클론 플러스 삽입 또는 SPI로 알려진 절차는 갭 수리 및 카세트 삽입이 동시에 발생하는 것을 고안하여 재결합 공정을 더 간단하고 유연하게 만듭니다. 이 공정의 성공에 중요한 것은 최대 180bp의 다중 상동성 무기의 적절한 설계로, 재조합 효율을 높이기 위해 기존의 재결합보다 더 길다. PCR에 의해 소염 플라스미드 및 삽입 카세트에 호모로지 암을 통합한 후, 그들은 함께 적색 표현 BAC 클론으로 변형되었고, 재결합이 유도되었다. 성공적으로 재결합된 구문은 PCR 또는 제한 다이제스트 분석에 의해 확인되었습니다.
당신은 재결합에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오에서는 재조합의 원리와 유전 공학, 재결합 프로젝트의 프로토콜 및 마지막으로 이러한 기술의 여러 응용 분야에서 어떻게 사용할 수 있는지에 대해 논의했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
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Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.