의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근

본 샘플링 방법의 전반적인 목표는 이후 Tandem Liquid Chromatography-Mass Spectrometry를 통해 정량 분석하기 위해 Staphylococcus aureus로부터 대사체 샘플을 수집하는 것입니다. 저희 연구실은 인간 건강과 관련된 박테리아의 대사와 병원성 사이의 상호작용을 연구하는 데 관심을 두고 있습니다. 현재 저희는 인간의 기회감염성 병원균인 Staphylococcus aureus를 모델 생물로 사용하고 있습니다.

우리가 답하고자 하는 핵심 질문 중 하나는 숙주 감염 중 영양분 고갈에 직면했을 때 박테리아가 자신의 생리와 병원성을 어떻게 조절하는가 하는 점입니다. 이 기술은 활발하게 성장하는 세포의 생리적 상태를 최소한으로 교란하면서, 여러 대사 경로 간의 특정 대사물질 분포에 대한 스냅샷을 제공한다는 점에서 유리합니다. 우선, 냉동 글리세롤 스톡으로부터 관심 있는 S.aureus 균주를 tryptic soy agar에 분리 도말하십시오.

세포를 37 °C에서 16-24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 멸균된 유리 배양 튜브에 4 mL의 tryptic soy broth(TSB)를 넣고 각 균주의 단일 콜로니를 접종합니다. 배양액을 기울인 상태에서 회전시키며 37 °C에서 16-20시간 동안 배양합니다.

분광광도계를 사용하여 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600으로 약칭)를 측정합니다. 이 측정값을 바탕으로, 250 mL Delong 플라스크에 담긴 50 mL의 멸균 TSB 배지를 사용하여 세포의 OD600이 0.05가 되도록 희석합니다. 배양액을 37 °C의 항온 수조에서 280 rpm으로 진탕 배양합니다.

30분마다 OD600 값을 측정합니다. 광학 밀도가 증가함에 따라, 분광 광도계의 선형 흡광도 범위 내로 유지하기 위해 TSB로 배양액을 희석해야 할 수도 있습니다. 세포가 성장하는 동안, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 사용 가능한 최고 순도의 시약을 사용하여 추출 완충액을 새로 준비합니다.

배양액의 OD600이 0.8에서 1.0 사이에 도달하면, 이를 미리 데운 신선한 TSB 50 mL에 OD600 0.01에서 0.05가 되도록 계대 배양하고, 배양 및 측정 단계를 반복합니다. 유리 접시, 아이스 버킷 또는 쿨러와 같은 적절한 용기에 분쇄된 드라이아이스 층을 준비합니다. 배양액의 광학 밀도가 원하는 수확 시점에 가까워지면, 처리되지 않은 35 mm 페트리 접시에 퀀칭 용액(quenching solution) 1 mL를 넣고 드라이아이스 위에서 최소 5분 동안 사전 냉각합니다.

본 실험의 목적상, 원하는 수확 시점은 흡광도(optical density) 약 0.4에서 0.5 사이입니다. 다만, 이는 실험 목표에 따라 변경될 수 있습니다. 다음으로, 고무 마개에 스테인리스 스틸 필터 프리트를 끼우고, 이를 하우스 진공 시스템 또는 진공 펌프에 연결된 감압 플라스크 위에 배치합니다.

진공을 가하고, 그 위에 혼합 셀룰로오스 에스테르 막을 배치합니다. 모든 세포가 수집될 수 있도록 프릿과 동일한 직경의 필터를 사용하십시오. 특정 조건에서의 대사체 함량 스냅샷을 제공하기 위해서는 가능한 한 빠르게 세포를 수집하고 대사 활동을 중단시키는 것이 매우 중요합니다.

짧은 지연이라도 세포의 정상 상태 생리에 영향을 미칠 수 있습니다. OD600 수치가 0.4에서 0.5 사이일 때, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 플라스크에서 13 mL의 배양액을 제거하십시오. 샘플을 즉시 필터에 도포하십시오.

전체 시료의 여과가 완료되면, 배지 관련 대사물을 씻어내기 위해 5 mL 이하의 얼음처럼 차가운 PBS로 필터를 즉시 세척하십시오. 그 다음 진공 상태를 해제하고 멸균 핀셋을 사용하여 프릿에서 필터를 제거하십시오. 필터를 미리 냉각시킨 퀀칭 용액(quench solution)에 거꾸로 넣으십시오.

필터를 드라이아이스 상의 정지 용액(quench solution)에 넣어 최소 20분 동안 배양합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 페트리 접시 안의 필터를 뒤집은 다음, 마이크로파이펫을 이용해 세포를 멤브레인에서 정지 용액으로 씻어내립니다. 세포를 정지 용액에 재부유시킨 후, 약 100 microliters의 0.1 mm 실리카 비드가 들어 있는 멸균 2 mL 충격 방지 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다.

이를 드라이아이스나 -80°C에서 보관하십시오. 대사체 추출을 시작하려면, 먼저 시료를 젖은 얼음 위에서 해동합니다. 그 다음, 사이클 사이에 드라이아이스에서 2분간 냉각 기간을 두며, 6000 rpm에서 30초씩 4회 작동시켜 균질기로 세포를 파쇄합니다.

미리 냉각된 냉장 마이크로 원심분리 튜브에 라이세이트를 넣고 최대 속도로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 맑게 합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로피펫을 사용하여 샘플의 일부를 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 잔류 펩타이드 함량을 정량합니다.

샘플의 나머지는 80 °C에서 보관하십시오. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 통한 대사물질 분석은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. CodY 단백질은 이러한 영양소의 농도 감소에 반응하여 수십 개의 유전자 발현을 조절하므로, 분지쇄 아미노산 고갈을 조사하기 위해 CodY 결손 돌연변이체를 사용하였습니다.

codY 돌연변이는 S.aureus 세포의 성장 속도에 거의 영향을 미치지 않습니다. 3시간 시점에서 광학 밀도가 감소하는 것은 역희석 단계를 나타내며, 이는 수확 전 세포 분열 횟수를 증가시키고 밤샘 배양 동안 축적된 다양한 분자들을 희석시킵니다. 두 균주의 전사체에 대한 RNA 서열 분석 결과, 아스파르트산 계열 아미노산 합성에 관여하는 유전자들의 발현에 유의미한 변화가 있음이 나타났습니다.

여기에서 유전자 이름 아래의 숫자는 야생형 균주와 비교했을 때 codY 결손 돌연변이체에서 나타나는 발현량의 배수 변화를 나타냅니다. 추출된 대사물질을 LC-MS로 정량 분석한 후, 두 균주 간의 풍부도를 비교하였습니다. 아스파르트산 계열 아미노산과 관련된 일부 화합물에 집중해 보면, aspartate 및 O-acetylhomoserine과 같은 전구체의 풍부도가 codY 돌연변이체에서 감소한 것을 알 수 있습니다.

반대로, threonine 및 isoleucine과 같은 최종 산물은 증가합니다. 여기서 점선은 본 실험의 함량 변화에 대한 기준선을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 액체 크로마토그래피 질량 분석법(liquid chromatography mass spectrometry)을 통한 정량을 위해 Staphylococcus aureus에서 대사물을 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 프로토콜은 일부 수정 후 다른 세균 종의 대사물질 수집에도 적용 가능합니다. 세균은 역동적인 환경에 반응하므로, 샘플링으로 인해 유도될 수 있는 잠재적인 생리학적 변화를 최소화하기 위해 여과 및 세척 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 또한 샘플링 과정 동안 프릿(frit)과 PBS를 차갑게 유지함으로써 이러한 변화를 최소화할 수 있습니다.