Name: 의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근 포도상 구균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 탠덤 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하여 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 대사 산물을 추출하고 정량하는 방법을. 이 기술은 영양소 고갈 조건에서 세균의 대사와 병원성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독립 수상에 NIH 통로 (GM 099,893을 부여) 교수 시작 기금 SRB에,뿐만 아니라 연구 프로젝트 그랜트 (GM 042219 부여)에 의해 부분적으로 투자되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작업을 제출하기로 결정에서 아무런 역할이 없었다.

버퍼 솔루션 1. 준비 <ol><li> 인산 완충 식염수 준비, 초순수로 1 배의 최종 농도로 10 배 PBS의 원액을 희석하여 (PBS pH를 7.4) (증류수 및 탈) 물. </li><li> 아세토 니트릴 2 ㎖, 메탄올 2 ㎖, 초순수 H 2 O 1 ㎖, 포름산 19 μL (0.1 mM의 최종 농도)을 조합하여 켄칭 용액을 준비한다. </li><li> LC-MS 초순수에 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 용매를 준비한다. </li><li> 아세토 니트릴, 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 LC-MS를 용제 B를 준비한다. 참고 : 모든 솔루션은 최고 순도의 시약을 사용할 수 (일반적으로 고성능 액체 크로마토 그래피 등급)로 작성한다. 솔루션은 각 실험 전에 신선 준비하고 사용하기 전에 얼음에 보관해야합니다. </li></ol> 정상 상태 S. 구균 성장 2. 설립 <ol><li> 행진 S.의 aureu냉동 글리세롤로부터 트립신 콩 한천 (TSA)에서 격리에 대한 관심의 변종. 16-24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 트립 틱 소이 브로스 (TSB) 각 균주의 단일 콜로니로 멸균 유리 배양 관의 다른 적합한 배지 4 mL로 접종한다. 경사 부화 (~ 70 ° 각도) 16-20 시간 동안 37 ° C에서 분 (RPM) 당 60 회전으로 회전. 주 : 세포 생리학에 영향을 미치는 단계 2.2에 기재된 것과 비롯한 표준 방법을 사용하여 하룻밤 배양시 산소 구배 쉽다. 따라서, 우리는 (참조 단계 2.4-3.2, 아래) 생물학적 정상 상태를 보장하기 위해 여러 백 희석 전략을 채택하고있다. </li><li> 600 나노 미터 (OD 600)의 단계 2.2에서 배양 물의 광학 밀도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 광학 기준 (공백)로 멸균 배지를 사용한다. 멸균 TSB 배지 0.05 50 용액의 OD 600에 이들 세포를 희석 별도의 250 ML 드롱 (37 ° C로 미리 예열). </li><li> 인큐BATE 280 rpm에서 진탕 수조에서 37 ℃에서 배양. </li><li> 30 분마다 600 개 OD 측정을; 광학 밀도가 증가함에 따라, 그들이 분광 광도계 흡광도의 선형 범위 내에 유지되도록 TSB와 배양액을 희석 할 필요가있다. </li><li> 단계 2.5에서 배양 ~ 0.8-1.0의 OD (600)를 획득하면, 0.01 ~ 0.05의 OD 600에 37 ° C TSB 50 ㎖로 계대를 반복 2.4 2.5 단계. </li></ol> 3. 시료 채취 설치 <ol><li> 적절한 용기에 분쇄 된 드라이 아이스의 침대를 준비 (예를 들어, 유리 접시, 얼음 통, 또는 냉각기). </li><li> 배양액의 광 밀도 수확 원하는 지점에 접근, ≥5 분간 미처리 35mm 페트리 접시 드라이 아이스에 미리 냉각 용액을 1 mL의 담금질을 추가한다. 참고 : &quot;원하는 수확 포인트는&quot;실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 m를 조사했다etabolites 호기성 성장시에,이 상태의 주요 지표 아세테이트 배설 후 지수 성장기 (32, 33) 중 아세트산 다시 동화를 포함한다. 일반적으로,이 시점은 특정 성장 단계 (예를 들어, 지수 위상) 내에 있어야한다. 이 스테이지와 연관된 특정 OD 600의 값이 상이한 균주 및 성장 배지 사이에서 변할 수있다. </li><li> 고무 마개 (-20 ℃로 예비 냉각)을 스테인리스 필터 프릿을 배치하고 하우스 진공 또는 진공 펌프에 연결된 진공 플라스크 위에 배치. </li><li> 진공을 적용하고 상부에 혼합 된 셀룰로오스 에스테르 막 (0.22 ㎛의 공극 크기)을 배치했다. 주 : 상기 유리 재와 동등한 직경의 필터를 사용하고 적절하게 시료가 필터를 통과하기보다는 가장자리 위로 인출되도록이 필터를 중앙에 중요하다. 빙냉 멸균 H와 막의 습윤 2 O 도움멤브레인 포지셔닝. </li></ol> 4. 샘플 수확 <ol><li> OD 600 ~ 0.4-0.5에서 배양 플라스크에서 13 mL로 제거하는 혈청 피펫을 사용하여 필터에 시료를 적용. </li><li> 전체 샘플을 여과 한 후, 즉시 중간 관련된 대사 물질을 씻어 빙냉 PBS의 ≥5 ml로 필터를 세척 하였다. </li><li> 진공을 해제하고 프릿에서 필터를 제거하기 위해 무균 핀셋을 사용한다. 미리 냉각 된 용액으로 급랭 필터 (셀 측 아래) 전환. 액체가 신진 대사 활동을 체포, 세포의 급냉을 보장하기 위해 제거 된 즉시 (초, 즉) 신속 위의 단계를 수행하는 것이 중요하다 : 참고. </li><li> ≥20 분 동안 드라이 아이스에 종결 용액에 필터를 품어. </li><li> 페트리 접시 필터 (셀 측까지)를 반전 및 t 떨어져 세포를 헹구어 마이크로 피펫을 사용하여 무균 핀셋을 사용하여그는 종결 용액에 막. </li><li> 및 켄치 용액에 세포를 부유 한 후 다시 0.1 mm 실리카 비드 ~ 100 μL를 함유하는 멸균 2ml의 충격 내성 튜브에 세포 현탁액을 전송. 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서이 보관하십시오. </li></ol> 5. 대사 추출 <ol><li> 젖은 얼음에 녹여 샘플 사이클 사이의 드라이 아이스 냉각 2 분주기와, 6000 rpm으로 30 초 네 버스트와 균질의 세포 파괴. </li><li> 최대 속도로 미리 냉장 · 냉동의 microcentrifuge에서 15 분 동안 용 해물을 명확하게 (즉, ≤4 ℃에서 18,213 XG). </li><li> 깨끗한 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 6 단계에서 잔류 펩티드 함량의 정량 마이크로 원심 튜브에 시료의 작은 부분을 전송; -80 ° C에서 나머지를 저장합니다. 주 : 예비 샘플의 부피는 단계 6.1에서 사용 된 BCA 분석에 따라 달라진다. 이샘플은 즉시 분석을 위해 젖은 얼음에 저장 또는 -80 ° C에서 냉동해야합니다. </li></ol> 6. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석법 <ol><li> 각 샘플에 대한 잔류 펩타이드 농도를 결정하는 단계 5.4의 샘플을 이용하여, 키트 제조업체의 지침대로 BCA 분석을 수행한다. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> LC-MS, 용매 B 75 μL 75 μL S. 아우 레 우스의 추출물, 단계 1.4에서 제조 섞는다. </li><li> 소용돌이는 5 분 동안 13,000 XG에서 혼합 스핀합니다. </li><li> 액체 크로마토 그래피 (LC) 바이알로 상등액 100 μL를 배치하고 캡. 공기 방울이 샘플에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. </li><li> LC-MS의 자동 시료 주입기에 액정 유리 병을로드하고 소프트웨어의 실행 목록을 편집 &quot;오프라인 작업리스트 편집기.&quot; <ol><li> &quot;샘플 이름&quot;을 작성합니다 (예를 들어, 야생형-1), &quot;샘플 위치&quot;(예를 들어, P1-A1), &quot;방법&quot;(예를 들어, 개미CID-부정적인 방법) 및 &quot;데이터 파일&quot;(예를 들어, 야생형-1) 열입니다. 버튼 &quot;저장 작업리스트&quot;버튼을 클릭합니다. 은 &quot;질량 분석 데이터 수집 워크 스테이션&quot;소프트웨어 및 입력 이전에 저장된 작업 목록을 엽니 다. 연속 LC-MS 측정을 시작하려면 &quot;시작 작업 목록 실행&quot;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 액정 시스템과 TOF 분석기를, 컬럼에 샘플을 분리 비행 (TOF) 분광계의 시간에 열을 연결, 커플. 다음 이동상 구배를 사용하여 0~2 분간, 85 % 용매 B 단계; 3-5 분, 80 % 용매 B; 6-7 분, 75 % 용매 B; 8-9 분, 70 % 용매 B; 10-11.1 분 50 % 용매 B; 11.1-14 분, 20 % 용매 B; 14.1-24 분 및 5 % 용매 B; 85 % 용매 B로 10 분간 재 평형 기간 및 0.4 mL의 최소-1의 유속으로 끝난다. </li><li> 등용 매 펌프를 사용하여, 동시에 대량 축 교정하도록 실행와 레퍼런스 질량 용액을 주입. 참고 :이 단계표준 TOF 분석기 설명서를 기반으로합니다. <ol><li> 아세트산 D4 및 헥사 키스 (1H, 1H, 3H-테트라 플루오) 레퍼런스 질량 용액으로서 포스 파진의 실시간 보정을 수행 혼합물을 사용한다. 2.5 mL의 최소의 유량과 등용 펌프 -1 주입 대를 사용한다. </li></ol></li></ol> 이온 카운트 8. 일괄 수정 <ol><li> (1 복제, 예를 들어, 야생형) 일괄 보정 기준 시료로 제공하는 임의의 샘플을 나타낸다. </li><li> 기준 샘플 내의 모든 대사에 대한 이온 개수의 합을 계산한다. 모든 샘플이 계산을 반복합니다. </li><li> 비율을 생성하기 위해 참조 샘플의 총 이온 카운트하여 각 샘플의 총 이온 수를 나눈다. </li><li> 각 대사 물에 대한 일괄 이온 보정 계수를 획득하기 위해 상기 샘플 / 기준 비율에 의해 시료 내의 각 대사 물질에 대한 이온의 수를 나눈다. </li></ol> 9. 펩타이드 정규화 <ol><li> 디각 대사 물에 대해 정규화 된 값을 생성하는 단계 6에서 BCA 분석으로 결정된 펩티드 농도 8 단계에서 얻어진 각 시료에 대하여 일괄 보정 이온 카운트 값 ivide. 주의 : 단계 9.1에서 얻어진 각 대사 물질의 정규화 일괄 배치 이온 보정 계수를 직접 변형을 비교 및 통계 분석 (-test 예, 맨 - 휘트니 U)을 실시 할 수있다. 대안 적으로, 공지의 대사는 변경하거나 치료 또는 유전 적 배경에 의해 분해 대사 물질 인한 변화를 검출하기 위해 정규화로서 사용될 수있다한다. 추출 완충액 L - 발린 또는 gluraric 산 기지 량의 포함은 시료 처리 (34) 중에 손실을 보정하기 위해 사용될 수있다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

모든 작은 분자 대사는 중앙 대사 경로에서 공통의 기원을 통해 서로 연결되어있다. 기하 급수적으로 성장하는 동안 박테리아 세포는 특정 조건 하에서 생리 상태의 스냅 샷을 제공하는 생물학적 대사 안정 상태에있다. 코디 ILV와 GTP에 응답하여 영양 자족을 모니터링합니다. ILV 및 GTP 풀 강하 같이, 코디 활성 가능성 점진적 영양분 고갈 (30)의 증가에 적응하는 그것의 표적 유전자의 발현을 조절, 감소된다. 코디 결핍 균주 ILV 및 GTP 환경에서 소모하는 것처럼 행동하지만만을 코디 숙달 균주 성장 거동에 대하여 매우 경미한 차이 (도 1)를 나타낸다. 따라서, 이들 균주의 대사 물질의 정상 상태 풀의 비교는 영양분이 부족한 경우 신진 대사가 재구성되는 정도를 공개 할 수있는 독특한 기회를 우리에게 제공한다. 그것은 주목해야한다 OU코디 활성 (ILV하고 GTP가 지수 상에 가장 풍부하다) 최대화 될 때 R 실험 대사 존재비를 조사. 그러나 다른 ...

세균성 병원체는 호스트 환경에서 많은 도전에 맞설해야합니다. 면역 세포에 의한 직접 공격뿐만 아니라, 호스트는 세균의 생존과 복제, 생성 영양 면역 1, 2 필수 영양소를 담즙산이. 이러한 적대적 환경에서 살아 남기 위해, 세균성 병원균은 병원성 인자를 배포합니다. 이러한 요소 중 일부는 박테리아가 면역 반응을 회피 할 수 있도록; 다른 인자는 조직 유래 성분 3, 4, 5를 소비하여 누락 된 영양소를 보충 할 수 있도록 세균 등 히알루, thermonuclease, 리파제 등의 소화 효소를 분비를 포함한다. 실제로, 병원성 세균, 6 인자 (7)의 생산 세포의 생리 학적 상태를 묶어 규제 시스템 진화, <s<html> 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9, 10까지. 증거의 성장 몸은 신진 대사 및 독성을 연결하는 중요한 레귤레이터로 코디를 가리 킵니다. 먼저 디 펩티드 퍼 미아 제 (DPP) 유전자 (11)의 리프레로서 고초균에서 발견되지만, 코디는 현재 거의 모든 낮은 G + C 그램 양성 세균 (12, 13)에 의해 생성되는 것으로 알려져 및 조절되는 탄소가 관여하는 유전자 수십 질소 대사 14, 15, 16, 17, 18, 19. 병원성 종에서, 코디는 가장 중요한 독성 유전자 (20), (21)의 일부의 발현을 제어하고,. EF &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 코디 리간드의 두 개의 클래스에 의해 DNA 결합 단백질로 활성화되어 분지 쇄 아미노산 (BCAA를, 이소류신, 류신 및 발린 [ILV])과 GTP 전사 이러한 영양소가 풍부하면., 코디 억압 (또는 어떤 경우에, 자극). 이러한 영양소가 제한 될 때, 코디 활동이 점차 감소되고, - 경로를 다시하는 것은 중앙 대사에 연결된 다양한 대사 경로를 통해 전구체하는 경사 전사 반응을 초래 28, 29, 30. 질량 분석기 (LC-MS)에 결합 된 액체 크로마토 그래피 탠덤 정확하게 저분자 세포 대사 (31)를 식별하고 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. transc와 결합 할 때riptome 분석 (예, RNA-SEQ)는이 분석 워크 플로우 환경이나 영양 스트레스에 반응하여 발생하는 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기서는 LC-MS를 통해 포도상 구균 세포 및 후속 분석 대사 추출을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 S. aureus에 생리학 코디의다면 발현 성 효과를 보여주기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>Material/Equipmenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Culture Flask (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>사이드암 플라스크, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>3-홀 고무 스토퍼, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 필터 홀더/frit</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 35mm</td><td>코닝</td><td>430588</td><td>조직 배양 처리되지 않음</td></tr><tr><td>혼합 셀룰로오스 에스테르 막, 0.22 &mu; m 기공 크기</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>내충격성 튜브, 2mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>실리카 비드, 0.1mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 균질화 Bertin</td><td>Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Cogent Diamond 수소화물 타입 C 컬럼</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td></tr><tr><td>Quat 펌프, 1290 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>빈 펌프, 1290 시리즈</td><td>애질런트</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>밸브 드라이브, 1290 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isocratic 펌프, 1290 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, 1290 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>샘플러, 1290 시리즈</td><td>애질런트</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>온도조절기, 1290 시리즈</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chemical</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar,</td><td>Granulated Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>고체 매체는 1.5% [w/v] 한</td></tr><tr><td>천 인산염 완충 식염수(pH 7.4)를 포함합니다. 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td> 초순수 아세토니트<td>릴로 신선을 1x로 희석합니다.</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; 독성</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>질량 분석의 경우 98%</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strain</ strong</td><td>>Species</td><td>Strain</strong</td><td>>Genotype</td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>wild type</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&Delta; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">a나열된 화학 물질 및 재료는 설명된 방법에 따라 다르며 표준 실험실 화학 물질 또는 소모품은 포함하지 않습니다.</td></tr></tbody></table>

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

세균성 병원균을 저지하기위한 노력의 일환으로, 호스트는 종종 감염의 사이트에있는 영양소의 이용을 제한 할 수 있습니다. 이 제한은 규제 요인은 세포의 신진 대사를 조절, 대응되는 키 대사의 존재비를 변경할 수 있습니다. 최근에는 단백질과 RNA의 숫자가 독성 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했다. 예를 들어, 코디 단백질 분지 쇄 아미노산 및 GTP의 레벨에 응답하고 널리 낮은 G + C 그램 양성 세균에 보존된다. 황색 포도상 구균의 글로벌 레귤레이터로서, 코디 독성 대사 유전자 수십개의 표현을 제어한다. 우리는 황색 포도상 구균이 코디가 부분적으로 잠재적 호스트 환경에서 발생하는 영양소 제한 조건에 적응하기위한 노력의 일환으로 자사의 대사 상태를 변경하는 데 사용하는 가설을 세웠다. 이 논문은 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 이용하여 S. 구균에서 대사를 추출하여 분석하는 방법을 설명trometry,이 가설을 테스트하기 위해 개발 된 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 연속 chemostat 문화를 사용하지 않고 생물학적 정상 상태와 일정한 통기를 유지하는 등 엄격하고 재현성을 보장 모범 사례를 강조한다. USA200의 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균에 대한 상대 UAMS -1- 모 균주를 분리은 동질 코디 돌연변이 아스파 테이트 (예를 들어, 트레오닌과 이소류신) 유래의 아미노산의 현저한 증가를 나타내 및 (그 전구체 감소 예, 아스파라긴산 및 O의 -acetylhomoserine ). 이러한 결과는 RNA-서열 분석으로 얻어진 전사 데이터와 상관 관계가 다음 코디 널 돌연변이의 10 및 800 배 사이의 상향 조절이 경로의 유전자가 있었다. 사체와 대사 체의 글로벌 분석을 커플 링하는 것은 환경이나 영양 스트레스에 직면했을 때 박테리아가 PHY를에 잠재적 인 통찰력을 제공하고, 신진 대사를 변경하는 방법을 밝힐 수영양 결핍과 관련된 iological 변화는 감염 동안 경험했다. 이러한 발견은 새로운 항 감염 제 및 치료제의 개발을위한 방법을 포장 할 수있다.

우리는 풍부하고 복잡한 배지에서 체외 성장 동안 S. 구균 세포 내 대사 풀을 분석 하였다. 원리 증명 된 바와 같이, 우리는 비교 메티 실린 감수성 S. 구균 골수염 간 대사 프로파일 UAMS -1- (야생형 [WT]) 및 글로벌 전사 조절 코디 (Δ 코디) (26)가없는 동종의 균주를 분리. 프로토콜의 단계 2에 기술 된 바와 같이 정상 상태에서, WT 및 코디 균주의 지수 배양, TSB 배지에 설립되었다. 야생형과 코디 -null 돌연변이 문화의 성장 동작은 성장 수율과 속도 (그림 1)에서 경증 차이, 유사 하였다. RNA-SEQ 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여, 우리와 다른 아스파 테이트에서 파생 된 아미노산의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 여러 유전자가 코디 -null...

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

본 샘플링 방법의 전반적인 목표는 이후 Tandem Liquid Chromatography-Mass Spectrometry를 통해 정량 분석하기 위해 Staphylococcus aureus로부터 대사체 샘플을 수집하는 것입니다. 저희 연구실은 인간 건강과 관련된 박테리아의 대사와 병원성 사이의 상호작용을 연구하는 데 관심을 두고 있습니다. 현재 저희는 인간의 기회감염성 병원균인 Staphylococcus aureus를 모델 생물로 사용하고 있습니다.우리가 답하고자 하는 핵심 질문 중 하나는 숙주 감염 중 영양분 고갈에 직면했을 때 박테리아가 자신의 생리와 병원성을 어떻게 조절하는가 하는 점입니다. 이 기술은 활발하게 성장하는 세포의 생리적 상태를 최소한으로 교란하면서, 여러 대사 경로 간의 특정 대사물질 분포에 대한 스냅샷을 제공한다는 점에서 유리합니다. 우선, 냉동 글리세롤 스톡으로부터 관심 있는 S.aureus 균주를 tryptic soy agar에 분리 도말하십시오.세포를 37 °C에서 16-24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 멸균된 유리 배양 튜브에 4 mL의 tryptic soy broth(TSB)를 넣고 각 균주의 단일 콜로니를 접종합니다. 배양액을 기울인 상태에서 회전시키며 37 °C에서 16-20시간 동안 배양합니다.분광광도계를 사용하여 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600으로 약칭)를 측정합니다. 이 측정값을 바탕으로, 250 mL Delong 플라스크에 담긴 50 mL의 멸균 TSB 배지를 사용하여 세포의 OD600이 0.05가 되도록 희석합니다. 배양액을 37 °C의 항온 수조에서 280 rpm으로 진탕 배양합니다.30분마다 OD600 값을 측정합니다. 광학 밀도가 증가함에 따라, 분광 광도계의 선형 흡광도 범위 내로 유지하기 위해 TSB로 배양액을 희석해야 할 수도 있습니다. 세포가 성장하는 동안, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 사용 가능한 최고 순도의 시약을 사용하여 추출 완충액을 새로 준비합니다.배양액의 OD600이 0.8에서 1.0 사이에 도달하면, 이를 미리 데운 신선한 TSB 50 mL에 OD600 0.01에서 0.05가 되도록 계대 배양하고, 배양 및 측정 단계를 반복합니다. 유리 접시, 아이스 버킷 또는 쿨러와 같은 적절한 용기에 분쇄된 드라이아이스 층을 준비합니다. 배양액의 광학 밀도가 원하는 수확 시점에 가까워지면, 처리되지 않은 35 mm 페트리 접시에 퀀칭 용액(quenching solution) 1 mL를 넣고 드라이아이스 위에서 최소 5분 동안 사전 냉각합니다.본 실험의 목적상, 원하는 수확 시점은 흡광도(optical density) 약 0.4에서 0.5 사이입니다. 다만, 이는 실험 목표에 따라 변경될 수 있습니다. 다음으로, 고무 마개에 스테인리스 스틸 필터 프리트를 끼우고, 이를 하우스 진공 시스템 또는 진공 펌프에 연결된 감압 플라스크 위에 배치합니다.진공을 가하고, 그 위에 혼합 셀룰로오스 에스테르 막을 배치합니다. 모든 세포가 수집될 수 있도록 프릿과 동일한 직경의 필터를 사용하십시오. 특정 조건에서의 대사체 함량 스냅샷을 제공하기 위해서는 가능한 한 빠르게 세포를 수집하고 대사 활동을 중단시키는 것이 매우 중요합니다.짧은 지연이라도 세포의 정상 상태 생리에 영향을 미칠 수 있습니다. OD600 수치가 0.4에서 0.5 사이일 때, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 플라스크에서 13 mL의 배양액을 제거하십시오. 샘플을 즉시 필터에 도포하십시오.전체 시료의 여과가 완료되면, 배지 관련 대사물을 씻어내기 위해 5 mL 이하의 얼음처럼 차가운 PBS로 필터를 즉시 세척하십시오. 그 다음 진공 상태를 해제하고 멸균 핀셋을 사용하여 프릿에서 필터를 제거하십시오. 필터를 미리 냉각시킨 퀀칭 용액(quench solution)에 거꾸로 넣으십시오.필터를 드라이아이스 상의 정지 용액(quench solution)에 넣어 최소 20분 동안 배양합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 페트리 접시 안의 필터를 뒤집은 다음, 마이크로파이펫을 이용해 세포를 멤브레인에서 정지 용액으로 씻어내립니다. 세포를 정지 용액에 재부유시킨 후, 약 100 microliters의 0.1 mm 실리카 비드가 들어 있는 멸균 2 mL 충격 방지 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다.이를 드라이아이스나 -80°C에서 보관하십시오. 대사체 추출을 시작하려면, 먼저 시료를 젖은 얼음 위에서 해동합니다. 그 다음, 사이클 사이에 드라이아이스에서 2분간 냉각 기간을 두며, 6000 rpm에서 30초씩 4회 작동시켜 균질기로 세포를 파쇄합니다.미리 냉각된 냉장 마이크로 원심분리 튜브에 라이세이트를 넣고 최대 속도로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 맑게 합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로피펫을 사용하여 샘플의 일부를 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 잔류 펩타이드 함량을 정량합니다.샘플의 나머지는 80 °C에서 보관하십시오. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 통한 대사물질 분석은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. CodY 단백질은 이러한 영양소의 농도 감소에 반응하여 수십 개의 유전자 발현을 조절하므로, 분지쇄 아미노산 고갈을 조사하기 위해 CodY 결손 돌연변이체를 사용하였습니다.codY 돌연변이는 S.aureus 세포의 성장 속도에 거의 영향을 미치지 않습니다. 3시간 시점에서 광학 밀도가 감소하는 것은 역희석 단계를 나타내며, 이는 수확 전 세포 분열 횟수를 증가시키고 밤샘 배양 동안 축적된 다양한 분자들을 희석시킵니다. 두 균주의 전사체에 대한 RNA 서열 분석 결과, 아스파르트산 계열 아미노산 합성에 관여하는 유전자들의 발현에 유의미한 변화가 있음이 나타났습니다.여기에서 유전자 이름 아래의 숫자는 야생형 균주와 비교했을 때 codY 결손 돌연변이체에서 나타나는 발현량의 배수 변화를 나타냅니다. 추출된 대사물질을 LC-MS로 정량 분석한 후, 두 균주 간의 풍부도를 비교하였습니다. 아스파르트산 계열 아미노산과 관련된 일부 화합물에 집중해 보면, aspartate 및 O-acetylhomoserine과 같은 전구체의 풍부도가 codY 돌연변이체에서 감소한 것을 알 수 있습니다.반대로, threonine 및 isoleucine과 같은 최종 산물은 증가합니다. 여기서 점선은 본 실험의 함량 변화에 대한 기준선을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 액체 크로마토그래피 질량 분석법(liquid chromatography mass spectrometry)을 통한 정량을 위해 Staphylococcus aureus에서 대사물을 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 프로토콜은 일부 수정 후 다른 세균 종의 대사물질 수집에도 적용 가능합니다. 세균은 역동적인 환경에 반응하므로, 샘플링으로 인해 유도될 수 있는 잠재적인 생리학적 변화를 최소화하기 위해 여과 및 세척 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 또한 샘플링 과정 동안 프릿(frit)과 PBS를 차갑게 유지함으로써 이러한 변화를 최소화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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출처: Samuels, D. J. 외 황 색포도상구균의 대사물 분석을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석법 기반 탠덤 접근법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 S. aureus의 세포 내 대사산물을 식별하고 정량하는 방법을 보여줍니다. 대사물 추출, 펩타이드 정규화, 액체 크로마토그래피, 질량분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

S. aureus의 대사산물 분석을 위한 액체 크로마토그래피–질량분석법 기반 접근법

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

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캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

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리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

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의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근

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