다층 피질 칼슘

이 실험 절차의 전반적인 목표는 칼슘 지표를 사용하여 자유롭게 행동하는 생쥐의 피질 뉴런 여러 층에 걸친 뉴런 활동을 동시에 시각화하고, 소형 헤드 마운트형 형광 현미경을 이용해 신경 회로의 기능을 이해하는 것입니다. 이 방법은 정보가 피질의 여러 층을 통해 어떻게 전파되는지와 같은 시스템 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 인코딩된 대규모 뉴런 집단을 자유롭게 행동하는 동물의 여러 피질 층에 걸쳐 시간에 따라 안정적으로 시각화할 수 있다는 점입니다.

자유롭게 행동하는 동물에서 여러 피질 층의 유전적으로 인코딩된 뉴런을 시각화하기 위해 다음의 절차를 수행해야 하며, 본 프로토콜에서는 자유롭게 행동하는 마우스에서의 프리즘 프로브 이식, 베이스플레이트 설치 및 생체 내 영상 촬영(in vivo imaging)을 중점적으로 다룹니다. 이 절차를 시작하려면, 바이러스 주입 1~2주 후에 동물을 정위 고정 장치에 배치하고, 70% ethanol로 소독하고 렌즈 페이퍼로 닦아 프리즘 프로브 이식 수술을 준비합니다. 다음으로, 0.5 millimeter 버(burr)가 장착된 마이크로 드릴을 사용하여 원형의 두개골 절개술을 시행합니다.

두개골 절개창의 직경이 프리즘 직경보다 약간 더 크게 되도록 하십시오. 그다음, 프리즘을 피질에 삽입했을 때 평평한 면이 바이러스 주입 지점을 향하며 150~200 µm 반경 내에 위치하도록 절개창의 위치를 잡으십시오. 그 후, 미세 핀셋을 사용하여 경막을 제거하십시오.

뇌 조직이 노출되면 항상 멸균 식염수로 조직을 촉촉하게 유지하십시오. 이렇게 하면 조직에 압력이 계속 가해집니다. 프리즘 프로브 삽입 시 뇌 조직의 압력을 완화하기 위해, 정위 고정 장치의 전극 홀더 암에 직선형 절개 칼을 부착하여 삽입 경로를 만드십시오.

나이프 플레이트가 두개골의 곡면과 수직을 이루고 바이러스 주입 컬럼과 평행한 평면에 위치하도록 각도를 조절하여 장착하십시오. 나이프를 개두술 부위 위, 내측 가장자리를 따라 바이러스 주입 지점에서 외측으로 약 200 microns 떨어진 곳에 배치하고 절삭날이 후방을 향하게 하십시오. 나이프 팁이 연질막(pia)에 닿았을 때 Z축을 영점 조절하십시오.

그 다음, 프리즘 프로브가 삽입될 깊이까지 서서히 내립니다. 이어서, 프리즘의 앞쪽 가장자리가 들어갈 경로를 만들기 위해 칼을 후방으로 1 mm 이동시킵니다. 정위 고정 장치 암 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 초당 10 µm씩 천천히 칼을 후퇴시키고, 절개 부위에 멸균 식염수에 적신 겔 폼 스펀지를 얹습니다.

그 다음, 렌즈 홀더를 이전 단계의 나이프와 동일한 각도로 뇌정위 조작기 암에 부착합니다. 프리즘의 평평한 면이 절개 부위 위에 오고 바이러스 주입 컬럼과 평행하도록 프리즘을 정렬합니다. 프리즘이 올바른 각도에 위치하면, 이 프로브의 경우 뇌 표면으로부터 최종 Z 레벨 1.1 millimeter까지 10 micron씩 점진적으로 뇌 속으로 내립니다.

25 gauge 바늘을 사용하여 두개골 절제술 부위의 프리즘 주변에 노출된 조직을 매우 얇은 엘라스토머 접착제 보호층으로 덮습니다. 렌즈가 두개골 절제 부위 내부에서 움직이는 것을 방지하기 위해, 엘라스토머 접착제가 경화된 후 25 gauge 바늘을 사용하여 시아노아크릴레이트 접착제를 도포함으로써 프리즘 렌즈의 유리를 엘라스토머 접착제 층 위의 인접한 두개골에 부착합니다. 시아노아크릴레이트 접착제가 경화되면, 렌즈 홀더의 나사를 풀고 조심스럽게 현미경을 제거합니다.

그 다음, 프리즘 프로브가 안정적으로 식립된 상태가 되도록 정위 고정 조작기 암을 천천히 후퇴시킵니다. 주변의 견인된 근육 조직에 닿지 않게 주의하며, 노출된 두개골 표면을 덮도록 임플란트 주변에 치과용 아크릴 또는 시아노아크릴레이트 접착제를 도포합니다. 이렇게 두개골의 넓은 영역을 두개 캡으로 덮어주면, 나중에 베이스 플레이트를 부착하는 데 도움이 됩니다.

그 후, 실리콘 접착제 시린지에서 촉매와 베이스를 혼합한 다음, 엘라스토머 한 방울을 프리즘 프로브 커프 내부에 넣어 프로브 렌즈 상단을 덮어 손상과 먼지 유입을 방지합니다. 프리즘 프로브를 이식하고 1주일에서 10일 후에, 이식된 프리즘 프로브를 통해 조직 내의 바이러스 발현 여부를 확인합니다. 이를 위해 이식된 프리즘 프로브 렌즈 표면의 실리콘 접착제 캡을 제거합니다.

프로브 렌즈 표면을 검사하고, 이미지 획득 표면이 깨끗한지 확인하기 위해 렌즈 페이퍼와 70% ethanol을 사용하여 이물질을 조심스럽게 닦아냅니다. 다음으로, 현미경에 베이스플레이트를 부착하고 베이스플레이트 고정 나사를 조여 위치를 고정합니다. 그런 다음, 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암의 현미경 그리퍼에 현미경을 단단히 고정합니다.

그리퍼를 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암에 장착할 수 있는 막대에 부착하십시오. 그 다음, 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암을 사용하여 현미경을 프리즘 프로브 렌즈 위에 배치하십시오. 동물 스테이지의 측면과 후면에서 프리즘 렌즈를 관찰하여 방향을 시각적으로 확인하십시오.

현미경 대물렌즈와 프리즘 프로브의 광축을 정렬해야 합니다. 그 다음, 획득 소프트웨어를 실행하고 프로젝트를 선택한 후, 소프트웨어를 통해 현미경 LED를 켭니다. 정위 고정 장치의 조작 암을 이동시켜 획득 소프트웨어 상에서 삽입된 프리즘 프로브 렌즈의 상단 위상을 포커싱함으로써 현미경 정렬 상태의 품질을 평가하십시오.

정렬이 제대로 되면 프리즘 프로브 렌즈의 가장자리가 선명하게 보여야 합니다. 스테레오택식 조작 암을 사용하여 이식된 프리즘 프로브 상단의 현미경 물리적 거리를 조정함으로써 조직 내부의 원하는 초점 평면을 확보하십시오. 그런 다음, 치과용 아크릴 또는 시아노아크릴을 사용하여 베이스 플레이트를 아크릴 캡에 영구적으로 부착하여 틈새를 메우십시오.

베이스 플레이트를 동물의 머리에 접착할 때, 현미경 본체의 어느 부분이나 고정 나사에 접착제가 묻지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이제 그리퍼에서 현미경을 분리하고, 현미경으로부터 그리퍼를 후퇴시킵니다. 시아노아크릴레이트 또는 다른 투명 접착제를 사용한 경우, 주변 광선이 헤드 캡 내부로 누설되어 향후 실험 중에 획득하는 이미지에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 검은색 매니큐어 또는 검은색 치과용 시멘트로 덮어줍니다.

그런 다음, 베이스 플레이트 커버로 삽입된 프리즘 프로브를 보호합니다. 이 과정에서 현미경을 컴퓨터에 연결된 데이터 획득 박스에 연결하고 획득 소프트웨어를 실행합니다. 그 후, 베이스 플레이트 고정 나사를 반시계 방향으로 돌려 베이스 플레이트 커버를 들어 올려 제거합니다.

베이스 플레이트의 현미경을 동물 위에 거치하십시오. 현미경은 베이스 플레이트의 자석의 도움을 받아 제자리에 딸깍 소리를 내며 고정되어야 합니다. 그런 다음, 약간의 저항이 느껴질 때까지 베이스 플레이트 고정 나사를 조이십시오.

그 후, 데이터 수집에 사용할 획득 설정을 선택하며, 여기에는 데이터 캡처를 위한 프레임 속도가 포함됩니다. 설정을 선택할 때 이미지 히스토그램을 확인하여 신호 대 잡음비가 양호한지 확인하십시오. 그런 다음, 데이터 획득을 시작합니다.

녹화가 완료되면, 베이스 플레이트 고정 나사를 풀어 현미경을 조심스럽게 위로 당겨 베이스 플레이트에서 분리하십시오. 그 다음, 베이스 플레이트 커버를 다시 덮고 고정 나사를 가볍게 조입니다. 다음은 현미경이 장착된 동물이 행동 아레나 내의 물체들과 자유롭게 상호작용하는 모습입니다.

해당 시스템을 이용한 각성 상태의 행동 영상 촬영 동안, 마우스가 세 가지 서로 다른 환경에 노출되었을 때 체성감각 피질 뉴런의 활성을 기록하였습니다. 1일 차에는 오픈 필드, 2~4일 차에는 물체 익숙해지기, 그리고 5일 차에는 새로운 물체 노출 환경이었습니다. 칼슘 영상 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 세포를 추출한 후, 세포 위치에 해당하는 공간 필터를 현미경 기록 데이터의 평균 형광 강도 투영 이미지 위에 중첩시켰습니다.

흰색 점선은 2층, 3층 및 5층 세포를 구분합니다. 각 층의 세포 5개에서 얻은 해당 칼슘 추적 결과는 두 가지 서로 다른 행동 상황, 즉 대상 익숙해지기와 새로운 대상 노출 상황에서의 세포 발화 패턴을 보여줍니다. 마우스가 새로운 대상에 노출된 날에는 2층 및 3층 세포가 5층 세포에 비해 더 활성화되었습니다.

동물이 오픈 필드, 객체 익숙해지기 및 새로운 객체 탐색 단계에 있을 때, 표면 엔티티 플레이어들의 세포 활성을 나타낸 나머지 도표들입니다. 숙달되면, 각 기술은 적절히 수행될 경우 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 시스템 신경과학 연구자들은 드로닝 및 기타 질병 신경생리학 모델에서 다양한 행동 패러다임을 활용하여 서로 다른 뇌 영역의 특정 세포 유형을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

본 프로토콜을 통해 체성감각 피질의 여러 층을 라벨링하고, 프리즘 프로브를 삽입하며, 머리 장착형 초소형 현미경을 부착하는 방법에 대해 충분히 이해할 수 있습니다.