Name: 다층 피질 칼슘 2+ 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 학습하세요 자유롭게 움직이는 마우스에서 다층 피질 칼슘 이미징 방법을 소형 형광 현미경과 프리즘 프로브를 활용하여 신경 회로 기능을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 시스템 신경과학 연구에 활용됩니다.

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저자들은 AAV1-GCaMP6f의 관대 한 기증으로 하워드 휴즈 의학 연구소의 Janelia Research Campus의 Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector (GENIE) 프로젝트의 V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger 및 K. Svoboda에게 감사드립니다. University of Pennsylvania 벡터 코어. 그들은 또한 공 촛점 현미경 검사 서비스에 NIH NS069375 보조금으로 지원되는 Stanford University의 A. Olson과 Neuroscience Microscopy Core에 감사드립니다.

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</ol>

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깨어있는 행동 중에 신경 회로 활동을 이해하는 것은 건강과 질병에서 효과적으로 뇌 기능을 해부하는 데 필요한 신경 과학적 조사의 핵심 단계입니다. 피질은 깨어있는 행동의 맥락에서 연구하는 데 특히 중요합니다. 왜냐하면 그것은 많은 중요한 감각,인지 및 실행 기능에서 중요한 역할을하기 때문입니다. 대뇌 피질의 기둥은 피질의 기본 기능 단위로 생각되며 피질 세포의 집단 수준 활동은 기둥 내의 물리적 위치에 따라 다르다고 알려져 있습니다. 예를 들어 체세포 감각 피질에서 2/3 층의 흥분성 뉴런은 주로 다른 신피질 영역으로 진행하고 다른 피질 네트워크를 변조합니다 30 , 더 깊은 층의 세포는 주로 시상과 같은 피질 하부 영역에 작용합니다 31 . 100의 활동 기록하기자유롭게 행동하는 피험자에서 서로 다른 층을 가로 질러 시간에 따라 동시에 사전에 지정된 피질 세포를 재현하는 것은 대뇌 유사 정보 흐름에 대한 우리의 이해를 크게 향상시켜 실시간 행동 정보 및 작업 관련 시간 정보에 의해 알린 피질 기둥의 미세한 기능 해부를 가능하게합니다. 저울. 이 수준의 신경 회로 데이터를 수집하는 것은 효율적이고 유선형의 소형 현미경 플랫폼을 사용하여 자유롭게 행동하는 피험자 (또는 원하는대로 머리 고정 피험자)에서 대규모 칼슘 2+ 영상을 수행 할 수있게합니다. 세포 형 특정 표적화를 가능하게하고, 만성적으로 이식 된 프리즘 프로브에 의해 제공되는 다층 시야를 이미징하기 위해 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약과 함께 사용되는이 프로토콜은 많은 가능한 응용 중 하나의 사례를 탐구했다 : 마우스의 체성 감각 대뇌 피질 처리 물리적으로 새로운 객체와 결합합니다 ( 그림 5 ).이것은 깨어 있고 자유롭게 행동하는 동물에서 여러 피질 층을 연구하기위한 세포 유형 특이적인 생체 내 접근법의 첫 번째 절차적인 일러스트레이션이며 능동적 인 두뇌의 층류 구조를 이해하는 데 사용할 수있는 실험 방법의 스펙트럼을 확장합니다. 이 기술에서 프리즘 프로브에 의해 가능해진 시각의 망원경 (periscopic) 시야는 관심 부위에 직접적으로 조직의 보존이 요구 될 때 다른 뇌 구조에 적용될 수있다. 예를 들어, CA3 이미징은 해마 기능의 중단없이 달성 될 수있다. Ca 2+ 활동을 이미징하기위한 프리즘 프로브 기반 접근법은 피질에 마이크로 프리즘을 물리적으로 삽입하고 영구적으로 삽입해야하는데, 이는 렌즈 프로브가 삽입되는 피질 병변의 생성과 동일합니다. 이것은 정점 수상 돌기 및 과정의 절단을 포함하여 국소 신경 회로에 혼란을 야기 할 수 있습니다. 티그의 절차는 또한 영역에서 glial 세포의 초기 활성화를 일으킬 것입니다, 이것은 프리즘 얼굴에서 약 150 μm의 조직에 국한 될 것으로 예상되고, 뇌가 치유 된 후 가라 앉을 것으로 예상 22 . 이 기술이 실험을 계획 할 때 동물의 정상적인 회로 해부학 및 / 또는 행동에 영향을 미치는지 고려하는 것은 매우 중요합니다. Behavioral Control Group은 교묘 한 실험 결과를 생성 할 수있는 기준 행동에 중요한 변경이 없도록 항상 수행되어야합니다. 신경 내학 적 조작, 다양한인지 적, 사회적, 운동 적 또는 고유의 행동 패러다임을 가진이 소형화되고 이동성 인 Ca 2+ 영상 기법을 사용하고 다른 생리적 측정 기준과 결합하면 행동 및 신호에서 신경 회로의 기능적 역할을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구가 심화되고 풍부해질 수 있습니다 처리 32 . 억압 또는 활동약물로 조절되는 특정 경로의 작용은이 기술을 사용하여 쉽게 연구 할 수있는 관련 행동에 영향을 줄 수 있습니다 33 . 칼슘 지시자의 표적을 변경해서 다른 세포 유형으로 밖으로 분기하는 것은 다른 강력하고 유용한 신청이고, 다양한 신경 회로 질문을 제시하는 실험적인 공구의 많은 창조적 인 조합을 가능하게합니다.

피질은 주의력, 감각인지 및 하향식인지 조절 1 , 2 , 3 에서 동기 부여, 보상 및 중독 경로 4 , 5에 이르기까지 많은 복잡한 정신 및 행동 기능에서 필수적인 요소입니다. 기능의 기초가되는 전산 과정을 이해하는 것은 많은 정신 및 행동 장애에 대한 임상 적 이해를 향상시키는 중요한 목표입니다. 대뇌 피질 신경 회로 장애 또는 비 적응이 정신 분열병 6 , 자폐증 7 또는 강박 장애 8 과 같은 조건의 특징 인 인식 및 행동 이상을 일으킬 수 있다는 생각을 중심으로 정신과 질환 센터의 많은 현재 이론이 있습니다. 따라서, 공동에서 인구 수준의 신경 활동 데이터를 얻는 것동시 행동 정보의 적절한 컨텍스트 내에서 회로는 매우 중요하며 이상적으로는 미세한 신경 회로 해부를위한 특정 세포 유형을 목표로 할 수 있습니다. 이식 형 그라디언트 굴절률 (GRIN) 마이크로 렌즈와 함께 소형화 된 현미경은 피질 14 , 15 , 16을 포함한 가능한 뇌 영역 9 , 10 , 11 , 12 , 13 의 다양성에서 자유롭게 움직이는 조건에서 뉴런 앙상블에 대한 광학 액세스를 가능하게합니다. 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약과 결합 된 이동 현미경 검사 시스템을 사용하면 많은 뇌 영역에서 며칠에서 수주에 걸쳐 수백 개의 뉴런을 포괄하는 동일한 세포 집단의 일관된 영상을 얻을 수 있으며,바이러스 벡터 또는 형질 전환 기술을 사용하여 특정 세포 유형을 유 전적으로 표적으로한다. 피질은 서로 다른 기능을 지원하고 피질 층 17 , 18 , 19 내의 세포의 위치에 따라 다른 뇌 영역에 연결하는 것으로 알려져 있으므로 깨어있는 행동 대상에서 동시에 다층 신경 활동을 얻는 데 관심이 있습니다. 여기서 우리는 피질 ( 그림 1 )의 다층보기를 제공하는 이식 프리즘 프로브와 쌍을 이루는 소형 형광 현미경 20을 사용하여 며칠 동안 자유롭게 행동하는 마우스에서 형광으로 표시된 수백 개의 뉴런을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 프리즘 프로브는 두 개의 분리 된 GRIN 렌즈로 구성됩니다 : 프리즘과 원통형 릴레이 렌즈 ( 그림 1 ). 현미경으로부터의 빛은 형광으로 표지 된프로브의 프리즘 부분의 빗변으로부터 반사 된 후, 프리즘 프로브의 촬상면을 따라 위치 된 셀을 포함한다. 세포로부터 방출 된 빛은 프리즘의 빗변으로부터 반사되어 현미경의 목적을 통해 수집되어 현미경의 센서에 도달합니다. 이 절차에 사용 된 프리즘 프로브는 표준 stereotaxic 장비와 함께 사용하기 쉽게되어 있습니다. 소형 형광 현미경 (20 )은 세포가 Ca 2+에 민감한 유 전적으로 코드화 된 형광 지시약으로 특이 적으로 표지 된 후, 단일 세포 분해능을 갖는 연결 집단에서 활동 전위에 의해 유발 된 Ca 2+ 과도 현상을 검출한다. 이 프로토콜에서 우리는 바이러스 벡터 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)에 인코딩 된 칼슘 2 + 표시기를 삽입하고, 프리즘 프로브를 삽입하고, 현미경을 설치 한 다음 somatosensory (S1 뒷다리) 신경 활동 데이터 동물 폭로d를 자유 탐사 중에 새로운 물체 표면으로 이동시킵니다 ( 그림 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized 초정밀 소형 동물 스테레오택시 기구</td><td>Kopf</td><td>모델 963SD</td><td>수술</td></tr>용 <tr><td>스테레오스코프</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>수술 및 이미징</td></tr><tr><td>미니 직장 서미스터 프로브 (.062"/1.6 mm 직경) - 1/4" Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>수술</td></tr>용 <tr><td>히팅 패드 5 X 12.5 cm&nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>수술</td></tr><tr><td>DC 온도 컨트롤러</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>수술</td></tr><tr><td>마이크로 주사기 펌프</td><td>세계 정밀 기기</td><td>UMP3 모델; 직렬 155788 F110</td><td>수술</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &mu; L 주사기</td><td>세계 정밀 기기</td><td>NANOFIL</td><td>수술</td></tr><tr><td>35 G 베벨 팁 나노 필름 NDL 2PK</td><td>세계 정밀 기기</td><td>NF35BV-2</td><td>수술</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>세계 정밀 기기</td><td>503598</td><td>수술</td></tr><tr><td>버 마이크로 드릴</td><td>미세 과학 도구</td><td>19007-05</td><td>수술</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>이미징</td></tr><tr><td>AAV1입니다. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>펜 벡터 코어</td><td>AV-1-PV3435</td><td>수술</td></tr><tr><td>케토프로펜</td><td>빅터 메디컬</td><td>5487</td><td>수술</td></tr><tr><td>카프로펜</td><td>빅터 메디컬</td><td>1699008&nbsp;</td><td>외과</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knifes</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView 임플란트 키트</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>수술 및 이미징</td></tr><tr><td>ProView 프리즘 프로브 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm 길이</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>수술 및 이미징</td></tr><tr><td>Kwik-Sil 접착제 팩</td> 2 <td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>수술</td></tr><tr><td>Kwik-Cast 실란트</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>수술 및 이미징</td></tr><tr><td>미니어처 광학 마운팅 포스트</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>이미징</td></tr><tr><td>현미경 베이스 플레이트</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>이미징</td></tr><tr><td>현미경 베이스 플레이트 커버</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>이미징</td></tr></tbody></table>

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

생체 내 회로 및 세포 수준의 기능 영상은 뇌의 활동을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 2 광자 현미경으로 마우스 피질 뉴런의 고해상도 이미징은 피질 구조, 기능 및 소성에 대한 독특한 통찰력을 제공합니다. 그러나 이러한 연구는 고착 된 동물에 국한되어 연구 할 수있는 행동의 복잡성을 크게 줄입니다. 이 논문에서는 자유롭게 행동하는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 만성 형광 현미경 검사를 수행하는 절차를 설명합니다. 우리는 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 소형 형광 현미경을 사용하여 며칠 동안 새로운 대상 탐사 작업에 종사하는 마우스가 체세포 감각 피질의 여러 층에 걸쳐 수백 개의 뉴런의 칼슘 동역학을 동시에 시각화하고 기록했습니다. 이 기술은 다른 동물의 다른 뇌 영역에 적용되어 다른 행동 paradigms.

여기에 설명 된 프로토콜은 프리즘 프로브 ( 그림 1 )를 사용하여 자유롭게 행동하는 마우스에서 수 개의 대뇌 피질 뉴런에서 세로 다층 칼슘 2+ 영상을 수행하는 효과적이고 효율적인 방법을 설명합니다. 다층 피질 이미징에 대한 이전의 접근법은 머리 고정 동물 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 로 주로 제한되어왔다. 자유롭게 행동하는 맥락에서이 수준의 데이터를 얻기 위해, 소형화 된 현미경 플랫폼이 행동 유연성을 위해 사용되었습니다. 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지시약 (GCaMP6f)을 사용하여 특정 세포 집단 (CAMKII + 피질 세포)을 표적으로 삼았다. 만성 다층 시야를 제공하기 위해 프리즘 프로브를 선택했습니다. 그림 2 , 1 단계)에 주입했습니다 ( 그림 2 , 2 단계). 영상 세션 동안 현미경의 위치에 대한 안전하고 임시 도킹 역할을하는베이스 플레이트는 동물의 머리 위에 설치되었으며 ( 그림 2 , 3 단계), 깨어있는 행동 실험에서 여러 세포 층에 걸쳐 대뇌 피질의 활동을 시각화 할 수있었습니다 설치 ( 그림 2 , 4 단계). 원하는 세포 집단이 표적화되도록하기 위해 대표적인 마우스의 사후 뇌관 절 두뇌 단면을 프리즘 프로브 영역과 GCaMP6f 실험실에 상대적으로 표시된 시야와 함께 그림 3 에 표시했습니다somatosensory cortex의 Layer 2/3과 5에서 eled 뉴런. 깨어있는 행동을하는 시스템에서 체세포 감각 피질 뉴런의 활동은 마우스가 오픈 필드 (Day 1), 개체 익숙 함 (Day 2-4) 및 소설 개체 (Day 5)의 세 가지 환경에 노출되었을 때 기록되었습니다 그림 4 ). 1 일에 마우스는 어떤 물건도없는 행동 경기장에 배치되었습니다. 날 2-4에서 마우스는 같은 두 개의 텍스처가 다른 대상 (젤 패드와 나무 블록)으로 경기장에 배치되었습니다. 5 일째, 대상 중 하나가 새로운 대상으로 교체되었습니다. 동물은 매일 20 분 동안 5 일 동안 이미지화되었습니다. 칼슘 2 + 이미지 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 추출 후, 세포 위치에 해당하는 공간 필터를 현미경 기록 데이터의 평균 형광 강도 투영에 중첩시켰다( 그림 5) . 흰 점선은 레이어 2/3과 5 셀을 구분합니다. 각각의 층에서 5 개의 세포로부터의 상응하는 칼슘 2+ 흔적은 두 가지 상이한 행동 문맥 - 개체 익숙 함 및 새로운 대상 노출에서 세포의 발화 패턴을 나타낸다. 레이어 2/3 세포는 마우스가 새로운 대상에 노출 된 날의 레이어 5 세포에 비해 더 활동적이었습니다. 이것은 1, 4 및 5 일에 모든 이미징 된 셀의 threshold 된 발화 활동을 보여주는 래스터 플롯에서도 분명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> 그림 1 : 자유롭게 움직이는 쥐에서 여러 피질 층을 가로 지르는 생체 내 칼슘 2+ 영상. ( A ) 프리즘 프로브 사양 및 이미지 평면 묘사. 빗변 안쪽의 반사 코팅은 프리즘 프로브 삽입면에서 90 °의 이미징을 허용합니다. 렌즈 cuff는 렌즈 홀더와 통합되어 임플란트 시술을 간소화하고 임플란트시 주위 조직 형광을 잠재적으로 볼 수 있습니다 ( B ) (i). (ii) 나이프 절개 및 바이러스 주사 부위에 대한 프리즘 프로브 편평한면의 위치를 ​​보여주는 그림. ( C ) 마우스 피질에 이식 된 프리즘 프로브를 통해 전체 시야 내의 작은 영역에 대한 빛 경로를 보여주는 생체 내 Ca 2+ 영상 장치 설정의 예. ( D ) 프리즘 프로브 설치 중 시야의 예. 미니어처 현미경은 프리즘 프로브를 고정하는 렌즈 홀더에 부착되어 프리즘 프로브 설치 중에 바이러스 발현을 검사 할 수 있습니다. ( E ) GCaMP6f 표지 S1 세포의 다층 피질 이미징을위한 프리즘 프로브와 현미경의 통합. F보기 필드베이스 플레이트 설치 중. 생체 이미지에 일부 셀이있는베이스 플레이트 설치시 명확한 혈관 패턴이 표시됩니다. 획득 소프트웨어 창에서 DF / F가 켜지면 셀이 더 잘 보입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> 그림 2 : 프리즘 프로브 이식 및 현미경 설치를위한 워크 플로 이벤트의 타임 라인을 보여주는 도식. 주 수는 Y 축을 따라 프로 시저의 X 축 및 워크 플로우 단계에 표시됩니다. ( A ) 마우스 somatosensory 피질의 여러 레이어를 레이블에 동일한 dorso - ventral 축을 따라 바이러스 주입 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)을 보여주는 그래픽. ( B ) 바이러스 주입 2 주 후, 프리즘 probe는 바이러스 주입 사이트에 평행 한 축에 이식된다. ( C ) 프리즘 프로브 주입 후 약 1 주일 동안, 동물의 현미경으로 발현 여부를 확인하고, 세포 집단이 보이면 머리판에베이스 플레이트를 올려 놓는다. ( D ) 그 동물은 관련 행동 과제 동안 만성 이미징을 준비합니다 (마우스 클립 아트는 UW-Madison Biochemistry MediaLab의 허락을 받아 수정되었습니다). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> 그림 3 : 프리즘 프로브 위치와 GCaMP 표현의 사후 검증. ( A ) 프리즘 프로브 영역과 그 영상화면이 마주 보는 대표적인 마우스 두뇌의 코로나 단면GCaMP6f 발현 세포 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f는 2/3 및 5 층의 뉴런에서 발현 됨). ( B ) DAPI에 대한 염색 후 동일한 코로나 뇌 절편. Scale bar = 250 μm ( C ) somatosensory cortex에서 GCaMP6f 발현 세포의 확대도. 스케일 바 = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> 그림 4 : 습관, 익숙 함 및 소설 대상의 마우스 활동 비디오 소프트웨어를 사용하여 비디오를 추적합니다. ( A ) 1 일째에, 동물은 어떤 대상도없는 행동 경기장에 놓이게되었다 (열린 필드). ( B ) 2 일에서 4 일 사이에 동일한 두 개의 질감이 다른 대상 (젤 패드와 나무 블록)이 경기장에 배치되었습니다 (Object Fami거짓말). ( C ) 5 일째, 대상 중 하나가 새로운 대상 (모래 종이가있는 나무 블록)으로 대체되었습니다 (소설 대상 노출). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> 그림 5 : 현미경으로 촬영 한 대표 마우스의 체 감각 피질의 표면 및 심층에서의 칼슘 역학 ( A ) 프리즘 프로브 시야를 통해 현미경 기록의 신경 공간 필터 (녹색 얼룩)와 평균 형광 강도 투영의 병합 된 이미지. 흰 점선으로 표시된 과립과 과립 사이의 경계. 스케일 바 = 100 μm. ( B ) 칼슘은 5 개의 표면 및 깊은 층 셀 (파란색과 빨간색으로 채워진 c패널 A의 ells). 주성분 분석과 독립 성분 분석에 이어 형광의 표준 편차를 나타내는 단위. 수평 눈금 막대 50 초 및 수직 눈금 막대 10 SD ( C ) 공개 필드, 개체 숙지 및 소설 개체 탐색에 표시된 표면 (레이어 2/3) 및 심층 (레이어 5)의 셀 래스터 그림. 눈금 막대 = 100 초. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 칼슘 지표를 사용하여 자유롭게 행동하는 생쥐의 피질 뉴런 여러 층에 걸친 뉴런 활동을 동시에 시각화하고, 소형 헤드 마운트형 형광 현미경을 이용해 신경 회로의 기능을 이해하는 것입니다. 이 방법은 정보가 피질의 여러 층을 통해 어떻게 전파되는지와 같은 시스템 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 인코딩된 대규모 뉴런 집단을 자유롭게 행동하는 동물의 여러 피질 층에 걸쳐 시간에 따라 안정적으로 시각화할 수 있다는 점입니다.자유롭게 행동하는 동물에서 여러 피질 층의 유전적으로 인코딩된 뉴런을 시각화하기 위해 다음의 절차를 수행해야 하며, 본 프로토콜에서는 자유롭게 행동하는 마우스에서의 프리즘 프로브 이식, 베이스플레이트 설치 및 생체 내 영상 촬영(in vivo imaging)을 중점적으로 다룹니다. 이 절차를 시작하려면, 바이러스 주입 1~2주 후에 동물을 정위 고정 장치에 배치하고, 70% ethanol로 소독하고 렌즈 페이퍼로 닦아 프리즘 프로브 이식 수술을 준비합니다. 다음으로, 0.5 millimeter 버(burr)가 장착된 마이크로 드릴을 사용하여 원형의 두개골 절개술을 시행합니다.두개골 절개창의 직경이 프리즘 직경보다 약간 더 크게 되도록 하십시오. 그다음, 프리즘을 피질에 삽입했을 때 평평한 면이 바이러스 주입 지점을 향하며 150~200 µm 반경 내에 위치하도록 절개창의 위치를 잡으십시오. 그 후, 미세 핀셋을 사용하여 경막을 제거하십시오.뇌 조직이 노출되면 항상 멸균 식염수로 조직을 촉촉하게 유지하십시오. 이렇게 하면 조직에 압력이 계속 가해집니다. 프리즘 프로브 삽입 시 뇌 조직의 압력을 완화하기 위해, 정위 고정 장치의 전극 홀더 암에 직선형 절개 칼을 부착하여 삽입 경로를 만드십시오.나이프 플레이트가 두개골의 곡면과 수직을 이루고 바이러스 주입 컬럼과 평행한 평면에 위치하도록 각도를 조절하여 장착하십시오. 나이프를 개두술 부위 위, 내측 가장자리를 따라 바이러스 주입 지점에서 외측으로 약 200 microns 떨어진 곳에 배치하고 절삭날이 후방을 향하게 하십시오. 나이프 팁이 연질막(pia)에 닿았을 때 Z축을 영점 조절하십시오.그 다음, 프리즘 프로브가 삽입될 깊이까지 서서히 내립니다. 이어서, 프리즘의 앞쪽 가장자리가 들어갈 경로를 만들기 위해 칼을 후방으로 1 mm 이동시킵니다. 정위 고정 장치 암 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 초당 10 µm씩 천천히 칼을 후퇴시키고, 절개 부위에 멸균 식염수에 적신 겔 폼 스펀지를 얹습니다.그 다음, 렌즈 홀더를 이전 단계의 나이프와 동일한 각도로 뇌정위 조작기 암에 부착합니다. 프리즘의 평평한 면이 절개 부위 위에 오고 바이러스 주입 컬럼과 평행하도록 프리즘을 정렬합니다. 프리즘이 올바른 각도에 위치하면, 이 프로브의 경우 뇌 표면으로부터 최종 Z 레벨 1.1 millimeter까지 10 micron씩 점진적으로 뇌 속으로 내립니다.25 gauge 바늘을 사용하여 두개골 절제술 부위의 프리즘 주변에 노출된 조직을 매우 얇은 엘라스토머 접착제 보호층으로 덮습니다. 렌즈가 두개골 절제 부위 내부에서 움직이는 것을 방지하기 위해, 엘라스토머 접착제가 경화된 후 25 gauge 바늘을 사용하여 시아노아크릴레이트 접착제를 도포함으로써 프리즘 렌즈의 유리를 엘라스토머 접착제 층 위의 인접한 두개골에 부착합니다. 시아노아크릴레이트 접착제가 경화되면, 렌즈 홀더의 나사를 풀고 조심스럽게 현미경을 제거합니다.그 다음, 프리즘 프로브가 안정적으로 식립된 상태가 되도록 정위 고정 조작기 암을 천천히 후퇴시킵니다. 주변의 견인된 근육 조직에 닿지 않게 주의하며, 노출된 두개골 표면을 덮도록 임플란트 주변에 치과용 아크릴 또는 시아노아크릴레이트 접착제를 도포합니다. 이렇게 두개골의 넓은 영역을 두개 캡으로 덮어주면, 나중에 베이스 플레이트를 부착하는 데 도움이 됩니다.그 후, 실리콘 접착제 시린지에서 촉매와 베이스를 혼합한 다음, 엘라스토머 한 방울을 프리즘 프로브 커프 내부에 넣어 프로브 렌즈 상단을 덮어 손상과 먼지 유입을 방지합니다. 프리즘 프로브를 이식하고 1주일에서 10일 후에, 이식된 프리즘 프로브를 통해 조직 내의 바이러스 발현 여부를 확인합니다. 이를 위해 이식된 프리즘 프로브 렌즈 표면의 실리콘 접착제 캡을 제거합니다.프로브 렌즈 표면을 검사하고, 이미지 획득 표면이 깨끗한지 확인하기 위해 렌즈 페이퍼와 70% ethanol을 사용하여 이물질을 조심스럽게 닦아냅니다. 다음으로, 현미경에 베이스플레이트를 부착하고 베이스플레이트 고정 나사를 조여 위치를 고정합니다. 그런 다음, 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암의 현미경 그리퍼에 현미경을 단단히 고정합니다.그리퍼를 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암에 장착할 수 있는 막대에 부착하십시오. 그 다음, 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터 암을 사용하여 현미경을 프리즘 프로브 렌즈 위에 배치하십시오. 동물 스테이지의 측면과 후면에서 프리즘 렌즈를 관찰하여 방향을 시각적으로 확인하십시오.현미경 대물렌즈와 프리즘 프로브의 광축을 정렬해야 합니다. 그 다음, 획득 소프트웨어를 실행하고 프로젝트를 선택한 후, 소프트웨어를 통해 현미경 LED를 켭니다. 정위 고정 장치의 조작 암을 이동시켜 획득 소프트웨어 상에서 삽입된 프리즘 프로브 렌즈의 상단 위상을 포커싱함으로써 현미경 정렬 상태의 품질을 평가하십시오.정렬이 제대로 되면 프리즘 프로브 렌즈의 가장자리가 선명하게 보여야 합니다. 스테레오택식 조작 암을 사용하여 이식된 프리즘 프로브 상단의 현미경 물리적 거리를 조정함으로써 조직 내부의 원하는 초점 평면을 확보하십시오. 그런 다음, 치과용 아크릴 또는 시아노아크릴을 사용하여 베이스 플레이트를 아크릴 캡에 영구적으로 부착하여 틈새를 메우십시오.베이스 플레이트를 동물의 머리에 접착할 때, 현미경 본체의 어느 부분이나 고정 나사에 접착제가 묻지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이제 그리퍼에서 현미경을 분리하고, 현미경으로부터 그리퍼를 후퇴시킵니다. 시아노아크릴레이트 또는 다른 투명 접착제를 사용한 경우, 주변 광선이 헤드 캡 내부로 누설되어 향후 실험 중에 획득하는 이미지에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 검은색 매니큐어 또는 검은색 치과용 시멘트로 덮어줍니다.그런 다음, 베이스 플레이트 커버로 삽입된 프리즘 프로브를 보호합니다. 이 과정에서 현미경을 컴퓨터에 연결된 데이터 획득 박스에 연결하고 획득 소프트웨어를 실행합니다. 그 후, 베이스 플레이트 고정 나사를 반시계 방향으로 돌려 베이스 플레이트 커버를 들어 올려 제거합니다.베이스 플레이트의 현미경을 동물 위에 거치하십시오. 현미경은 베이스 플레이트의 자석의 도움을 받아 제자리에 딸깍 소리를 내며 고정되어야 합니다. 그런 다음, 약간의 저항이 느껴질 때까지 베이스 플레이트 고정 나사를 조이십시오.그 후, 데이터 수집에 사용할 획득 설정을 선택하며, 여기에는 데이터 캡처를 위한 프레임 속도가 포함됩니다. 설정을 선택할 때 이미지 히스토그램을 확인하여 신호 대 잡음비가 양호한지 확인하십시오. 그런 다음, 데이터 획득을 시작합니다.녹화가 완료되면, 베이스 플레이트 고정 나사를 풀어 현미경을 조심스럽게 위로 당겨 베이스 플레이트에서 분리하십시오. 그 다음, 베이스 플레이트 커버를 다시 덮고 고정 나사를 가볍게 조입니다. 다음은 현미경이 장착된 동물이 행동 아레나 내의 물체들과 자유롭게 상호작용하는 모습입니다.해당 시스템을 이용한 각성 상태의 행동 영상 촬영 동안, 마우스가 세 가지 서로 다른 환경에 노출되었을 때 체성감각 피질 뉴런의 활성을 기록하였습니다. 1일 차에는 오픈 필드, 2~4일 차에는 물체 익숙해지기, 그리고 5일 차에는 새로운 물체 노출 환경이었습니다. 칼슘 영상 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 세포를 추출한 후, 세포 위치에 해당하는 공간 필터를 현미경 기록 데이터의 평균 형광 강도 투영 이미지 위에 중첩시켰습니다.흰색 점선은 2층, 3층 및 5층 세포를 구분합니다. 각 층의 세포 5개에서 얻은 해당 칼슘 추적 결과는 두 가지 서로 다른 행동 상황, 즉 대상 익숙해지기와 새로운 대상 노출 상황에서의 세포 발화 패턴을 보여줍니다. 마우스가 새로운 대상에 노출된 날에는 2층 및 3층 세포가 5층 세포에 비해 더 활성화되었습니다.동물이 오픈 필드, 객체 익숙해지기 및 새로운 객체 탐색 단계에 있을 때, 표면 엔티티 플레이어들의 세포 활성을 나타낸 나머지 도표들입니다. 숙달되면, 각 기술은 적절히 수행될 경우 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 시스템 신경과학 연구자들은 드로닝 및 기타 질병 신경생리학 모델에서 다양한 행동 패러다임을 활용하여 서로 다른 뇌 영역의 특정 세포 유형을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.본 프로토콜을 통해 체성감각 피질의 여러 층을 라벨링하고, 프리즘 프로브를 삽입하며, 머리 장착형 초소형 현미경을 부착하는 방법에 대해 충분히 이해할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

출처: Thapa, R., et. al., 심부 뇌를 위한 입체성 바이러스 주입 및 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 생체 내 칼슘 이미징.  J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형질주입된 쥐의 미니스코프를 사용하여 뉴런 활동과 행동을 연관시키는 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다.

Miniscope를 사용한 쥐 내측 전전두엽 피질의 실시간 칼슘 이미징

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

학습하세요 자유롭게 움직이는 마우스에서 다층 피질 칼슘 이미징 방법을 소형 형광 현미경과 프리즘 프로브를 활용하여 신경 회로 기능을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 시스템 신경과학 연구에 활용됩니다.

다층 피질 칼슘

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