Name: 곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 High Five 곤충 세포에서 바클로바이러스 감염을 이용한 재조합 mCD1d 단백질 생산 방법을. 이 기술은 NKT 세포 인식 연구에 필수적인 테트라머 제작에 활용됩니다.

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마찬가지 세포를 해동 TN5 세포의 냉동 약병을 가지고, 37 ° C의 물을 욕조에 녹여. 25cm 2 TC 플라스크에 곤충 익스프레스 매체 5ml (Invitrogen, 카탈로그 번호 - 10486)를 추가합니다. 익스프레스 주민 글루타민없이 오는 것을 참고, 100X 글루타민 펜 strep 또는 1 다 미디어에 혼자 글루타민의 10ml를 추가해야합니다. 그것에 TN5 세포를 추가하고 27 ° C 배양기에서 30 분 알을 품다. 그런 다음, 플라스크의 바닥에 부착된 세포를 방해하지 않고 부드럽게 DMSO와 매체를 대기음. 신선한 매체의 5ml를 추가합니다. II. 성장과 세포 확장 매일 세포를 모니터링합니다. 플라스크 거의 70% 합류하면, 양쪽에있는 술병을 닌가하여 정지 전지를 가져와 및 곤충 표현 매체 및 세포 배양의 5ml 21 ML 추가하여 175cm 2 플라스크에 세포를 전송합니다. 각 T175 플라스크은 최종 볼륨으로 25 - 30ml 중간 주변 있어야합니다. 합류 플라스크 (약 1,000,000 / ML CONC.) 필요에 따라 4분의 1 또는 5분의 1. 스플릿 세포의 자라다을하게하지 마십시오. 당신이 세포를 분리한다는 구절의 개수를 계산합니다. 그것이 세포 용해를 발생 세포의 노화가 발생할 수 있기 때문에 통로 번호 30여 성장하지 마십시오. 당신은 1,000,000 / ML의 농도에서 원하는 볼륨에 도달하면, 세포를 감염. 나는 일반적으로 보통 일흔 175cm 2 flasks 약에 금액 2-2.5 리터까지 성장. 25 / 30ml 플라스크, 5 1리터의 Erlenmeyer flasks의 약 수 있습니다. 각 플라스크에 400ml 500 ML 참고 : 하나 T - 175 플러그 인감 플라스크 또는 코닝 Erlenmeyer 플라스크에 세포를 성장하실 수 있습니다. Erlenmeyer Flasks의 성장 세포가 빠르고 쉽습니다. III. 엔드 포인트 희석 방법으로 바이러스를 Titering <ol><li> 익스프레스 오 SFM 매체의 200ul에 플랫 바텀 96 잘 판에 잘 따라 플레이트 3000-5000 세포. 세포가 27 ° C 이상에서 30 분 정착하자. </li><li> baculovirus 주식 일련 희석하십시오. 하나는 잘 당 250ul를 사용하여, 96 음 U 바닥 접시의 한 줄에 10분의 1 희석을해야합니다. Dilutions은 익스프레스 다섯 SFM 매체에 만들어집니다. </li><li> 멀티채널 피펫을 사용하여 세포를 다른 dilutions의 고정 금액 (보통 20 UL)을 전송합니다. </li><li> 27 7 일 동안 ° C에서 문화. 가장자리 행을의 증발을 방지하려면, parafilm와 접시의 가장자리를 바꿈. </li><li> 칠일 후에 접시를 확인하고 바이러스의 어떤 희석은 50 % 감염을 제공 결정 -이 바이러스 농도에서 절반 우물이 감염됩니다.) 다음 pfu / ML (pfu - 플라크 형성 단위)로 표시됩니다 titer를 계산하는 수식을 사용합니다. 수식이 가장 baculovirus 설명서에서 찾을 수 있습니다. </li></ol> IV. 세포를 감염 그것은 바이러스의 정확한 titer를 알고 매우 중요합니다. 바이러스 요구하는 금액을 추가합니다. 바이러스성 재고 준비 전지가 아니라 더 높은 뫄 바이러스는 변이의 생산 리드 (1pfu은 다섯 셀 1High)를 1보다 감염의 다중성 (뫄)에 감염되어야합니다. 단백질 생산, 일반적인 금액은 MO1 50-10 있습니다. 예 : mCD1d baculovirus의 titer = 1X108 pfu / ML 추가 뫄 = 1 (바이러스를 증폭하기 위해) = 20X10 ^ 6 세포 / 술병 / 1X10 ^ 8 pfu / ML = 200 UL / 술병 뫄 = 5-10 (단백질 생산을위한) 20x10 들어 = 1ml에 2ml ^ 6 세포 / 술병 감염 후 4 일, 감염된 세포보세요. 그들은, 부동, 부어 성형 소세지를 분리해야합니다. V. 복구 Supernatants 감염된 flasks에서 매체를 가지고, 250ml 파란 모자 팰컨 스피닝 병을로 전송할 수 있습니다. 그들은 autoclaved하고 활용할 수 있습니다. 200rpm 20 분, 4 ° C.에 골고루 병을 기입하고 Sorvall GSA 로터의 세포를 원심 분리기 뜨는를 수집하고 더 정화를위한 진행합니다. VI. 재조합 mCD1d의 정화 <ol><li> 150mM 인산 나트륨 버퍼에 투석과 농도 (산도 7.4) </li><li> 니켈 - NTA 아가로 오스 크로마 토그래피함으로써, 150mM 인산 나트륨 200 MM Immidazole와 단백질 mCD1d + b2m을 elute </li><li> Immidazole 없애 20mM 트리스 HCL pH8 버퍼를 사용하여 탈염 컬럼을 실행 </li><li> 나머지 오염 물질을 제거 MonoQ 칼럼을 사용하여 음이온 교환 크로마 토그래피를 실행합니다. </li><li> YM 30 농축기 (Millipore)를 사용 1mg/ml에 집중 </li><li> 의 비라 효소 biotynlation는 제조 업체의 프로토콜 (욕망)에 따라 mCD1d </li><li> 무료 비오틴은 식염수 (PBS), pH7.4를 버퍼 인산염을 사용 S200 열 (사이즈 제외 Chromatograpy)에 의해 제거됩니다. biotynlated 단백질 2 ~ 3 MGS의 평균 뜨는의 2리터에서 구할 수 </li><li> - Galcer CD1d tetramer 생산. </li></ol> A - Galcer과 가용성 biotynlated CD1d - B2를 CD1d 분자를로드하기 위해서는m은 PBS에 0.​​5 % 트윈 -20, O.9 %의 나트륨 염화물에 녹아있는 한 Galcer 세 배 이상 초과 어금니와 실온에서 하룻밤 incubated입니다. 복합 streptavidin과 실온에서 4 시간 동안 잠복기 - Tetramers는 PE의 4 배 초과 어금니와 - Galcer 로드된 CD1d 단량체의 혼합에 의해 생성됩니다. 48시 스토어 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

이 절차에서는, 그것은, 시작 성장, 곤충 세포를 감염하고 이러한 세포를 사용하여 baculovirus를 titer하는 방법을하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 세포의 유지 보수하고 baculovirus의 정확한 titer를 알고. 일단 CD1 tetramers를 생성, 그들은 glycolipid 반응 T 세포 분석을위한 강력한 도구로 사용할 수 있습니다. Baculovirus 시스템은 또한 MHC 클래스 II의 tetramers 때문에이 절차는 훨씬 광범위한 응용을 포함하는 재조합 단백질을 생산하기 위해 널리 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>무혈청 배지</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>곤충 세포</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>항생제</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC Flask</td><td>플라스틱</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC Flask</td><td>플러그 밀폐 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask</td><td>세포 배양 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Concenterator</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 장비</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA 효소 및 완충액</td><td>비오틴화 키트</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose 컬럼</td><td>His 태그 단백질 정제 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈염 컬럼</td><td>단백질로부터 염 제거용</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ 컬럼</td><td>음이온 교환 크로마토그래피</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 컬럼</td><td>크기 배제 크로마토그래피</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>당지질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE- Streptavidin</td><td>단백질 접합용</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mcd1d하는 방법.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 단백질은 항원 제시 분자의 세 번째 클래스를 구성합니다. 그들은 noncovalently beta2 - microglobulin과 관련된 약 50 KDA glycosylated 무거운 사슬로 표현 세포 표면 glycoproteins입니다. 그들은 lipids보다는 펩티드를 바인딩합니다. 그들의 구조가 MHC 클래스 I 및 클래스 II의 항원 제시 분자로 CD1 단백질의 유사성을 확인했지만, mCD1d 홈은 비교적 좁은 깊이, 그리고 높은 소수성이며, 그것은 고전에 대한 설명 여러 얕은 주머니 대신에 두개의 바인딩 주머니를 가지고 MHC - 항원 제시 분자를 인코딩. 자신의 아미노산 시퀀스에 따라, 그러한 hydrobphobic 홈은 지질 항원의 바인딩을위한 이상적인 환경을 제공합니다. 자연 킬러 T (NKT) 세포는 바운드 또는 CD1d에 의해 제시 glycolipids을 인식하기 위해 TCR을 사용합니다. CD1 제시한 lipids에 반응 T 세포는 면역과 전염병에 대한 보호 및 종양 제거에 참여하고 있습니다. 따라서, 식별 정화하고, CD1 - 반응 NKT 세포의 반응을 추적하는 능력은 매우 중요합니다. CD1d와 알파 Galactosyl ceramide (A - Galcer)의 tetramers의 세대는 NKT 세포의 생물학에 상당한 통찰력을하고 있습니다. 다른 CD1 분자로부터 만들어진 Tetramers도 생성되었으며 이러한 새로운 시약이 크게 지질 기반 백신에 대한 반응을 모니터링 잠재적인 사용과 면역 질병 및 기타의 진단에 지질 반응 T 세포의 기능의 지식을 확대 트리 트먼트.

곤충 세포를 준비하고 mCD1d tetramers를 생성하는 재조합 mCD1d의 proteinand의 생산의 목적으로 baculovirus으로 그들을 감염하는 방법.

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

CD1 단백질은 항원 제시 분자의 세 번째 부류를 구성합니다. 이들은 세포 표면 당단백질로, 약 50-kDa의 당화된...

안녕하세요, La Jolla Institute for Allergy and Immunology의 발달 면역학부 Mitch Kronenberg 박사님 연구실의 Ashra Corona입니다. 오늘은 MA CD 1D tetramer를 생성하기 위해 high five 곤충 세포를 준비하고 이를 VIR로 감염시키는 방법을 보여드리겠습니다. CD 1D tetramer는 저희 연구실과 다른 연구진들이 NKT 세포를 인식하는 데 사용하고 있습니다.VIR 시스템은 MS C 클래스 2 TE 진동을 포함한 재조합 단백질을 생산하는 데 널리 사용됩니다. 따라서 앞으로 보여드릴 절차는 훨씬 더 넓은 적용 가능성을 가지고 있습니다. 이 절차에는 High Five 곤충 세포의 개시 및 배양, CD 1D cDNA를 운반하는 레오바이러스의 세포 감염, 감염 4일 후 원심분리를 통한 상층액 수확, pH 7.4의 150 mM 인산나트륨 버퍼에서 단백질 농도의 용해, 니켈 및 T agros와 이온 교환 크로마토그래피 방법을 이용한 마우스 CD 1D 단백질의 정제, YM 30 농축기를 사용하여 M CD one G 단백질을 1 mg/mL로 농축, AVID D 프로토콜에 의한 마우스 CD 1D의 효소적 검증, S 200 컬럼을 통한 유리 BioTeam의 제거 과정이 포함됩니다.마지막으로, alpha gel CD 1D Tet의 생산입니다. 전체 과정은 이 모든 단계들을 포함하지만, 오늘은 더 많은 CD 1D tremors를 생성하기 위한 목적으로 이러한 세포들을 처리하고 바이러스를 감염시키는 방법만을 보여드리겠습니다. 시작하겠습니다.먼저, TN five 곤충 세포의 사용법을 보여드리고자 합니다. high five 세포주는 배추좀나방의 난소 세포에서 유래되었습니다. 이 세포들은 무혈청 배지에서 성장하며, 부유 배양에 적합하고, 25 cm² 조직 배양 T-플라스크 내의 5 mL insect express 배지에서 높은 수준의 재조합 단백질을 생성하기 때문에 본 프로토콜에서 사용됩니다. 참고로, express five 배지에는 glutamine이 포함되어 있지 않습니다.따라서 1L의 배지에 100x glutamine pen strip 또는 glutamine 단독 제제 10 ml를 첨가해야 합니다. 이제 냉동 보관된 high five 곤충 세포 바이알을 꺼내 37 °C 항온수조에서 해동한 후, 즉시 high five 곤충 세포를 플라스크에 넣고 27 °C 인큐

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Research

연구

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Biology

생물학

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Kindlins는 인테그린을 ​​통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.

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이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

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여기, 우리 제시 집 플라이 carboxylesterase 단백질에서 생체 외에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템으로 생산 하 고 나중 기능 metabolizing permethrin에 그들의 역할을, 특성화를 프로토콜 pyrethroid 부여 셀 기반 MTT 분석 결과 및 체 외에서 대사 연구를 실시 하 여 저항.

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

배우세요 High Five 곤충 세포에서 바클로바이러스 감염을 이용한 재조합 mCD1d 단백질 생산 방법을. 이 기술은 NKT 세포 인식 연구에 필수적인 테트라머 제작에 활용됩니다.

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

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