전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법

이 실험 절차의 전반적인 목적은 단일 광수용기 세포에서 전세포 전압 클램프 기록을 얻어, 단일 광자 흡수로 인해 발생하는 광유도 전류와 강한 빛에 대한 반복적인 반응을 측정하는 것입니다. 이 방법은 광전환의 기초가 되는 물리적 및 이온적 기전과 TRP 채널의 특성과 같은 감각 전달 분야의 핵심 주제들을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용함으로써 얻을 수 있는 이점으로는 막 전압의 완전한 제어, 매우 높은 신호 대 잡음비, 그리고 광학적 측정을 위한 특정 지표를 도입할 수 있는 능력이 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 표본의 매우 작은 크기와 대사적 취약성으로 인해 빠르게 해부를 진행해야 한다는 점에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 위해 초파리를 바이알당 약 20마리의 밀도로 사육하십시오. 실험 시점에는 번개가 막 닫히려는 상태의 번개가 들어 있는 바이알 몇 개를 준비하고, 최소 24시간 동안 지속적인 암조건 하에 두십시오.

성충을 수집하기 2시간 전에 이미 우화한 성충을 모두 제거하십시오. 암순응된 파리는 항상 적색광 조명 아래에서 다루십시오. 갓 우화한 파리를 기다리는 동안 기록 챔버를 준비하십시오.

녹인 파라핀 또는 고진공 실리콘 그리스를 사용하여 커버슬립을 챔버 바닥에 고정해 배스(bath)를 완성합니다. 그다음 배스를 도립현미경의 스테이지에 장착합니다. 배스 안에 관류 시스템 튜브, 흡입 시스템 튜브, 그리고 전기생리학 설정을 위한 접지선을 배치합니다.

해부를 시작하기 전, 60 mm 페트리 접시 뒷면에 몇 가지 용액을 준비합니다. 칼슘이 제거된 ES 용액 네 방울과 TS 용액 한 방울을 각각 떨어뜨립니다. 이제 거친 핀셋을 사용하여 최근에 우화한 초파리의 날개나 몸통을 잡습니다. 그런 다음 정밀 핀셋을 사용하여 머리를 분리하고, 분리된 머리를 칼슘이 제거된 ES 용액의 첫 번째 방울로 빠르게 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 두 번째 정밀 핀셋을 사용하여 머리를 시상면을 따라 이등분으로 해부합니다.

양쪽 눈이 모두 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 머리의 1/2을 두 번째 칼슘 제거 ES 방울로 옮기고, 나머지 절반의 머리를 세 번째 칼슘 제거 ES 방울로 옮깁니다. 그런 다음 두 눈 중 하나를 박리하십시오.

미세 핀셋을 사용하여 망막에 손상이 가지 않도록 안구 주변 조직을 최대한 제거합니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 각막 가장자리를 단단히 잡고 망막을 긁어냅니다. 그 결과, 손상되지 않은 망막으로부터 분리된 빈 상태의 온전한 각막을 얻어야 합니다.

피펫은 에탄올에 보관되어 있으므로, 새로운 trituration pipette을 사용할 때는 항상 먼저 물로 헹구십시오. 그다음 헹군 피펫에 네 번째 방울부터 calcium-free ES를 소량 채웁니다. 그런 다음 입으로 부드럽게 흡입하여 분리된 망막을 피펫 안으로 끌어당깁니다.

공기 방울이 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 그런 다음 망막을 TS 방울 속으로 옮깁니다. 다음으로, 두 눈 모두 TS 방울 안에 있도록 반대편 눈에서도 망막 분리를 반복합니다. 그 후 페트리 접시에서 칼슘이 제거된 ES만을 조심스럽게 닦아내고, 접시 표면에 TS를 6방울 더 추가합니다.

두 망막을 새로운 TS 방울로 옮깁니다. 그 다음, trituration pipette을 개구부가 작은 것으로 교체합니다. pipette을 헹군 후, TS 한 방울을 채웁니다. 이 pipette을 사용하여 두 망막을 빠르게 반복적으로 흡입 및 배출하여 낱눈(ommatidia)을 색소 세포로부터 분리합니다. 이 과정에서 TS가 탁해집니다.

다음으로, 두 망막의 잔여물을 TS 용액의 다른 한 방울로 옮깁니다. 그런 다음, 분리된 낱눈(ommatidia)이 포함된 혼탁한 TS 용액 방울을 피펫으로 흡입합니다. 이 용액을 배스 챔버(bath chamber)로 배출합니다. 망막이 완전히 용해될 때까지 직경이 더 작은 trituration 피펫으로 이 과정을 반복합니다.

이제 1분 동안 기다립니다. 이 대기 시간 동안 분리된 개안(ommatidia)이 챔버 바닥에 부착됩니다. 1분 후, 퍼퓨전 시스템을 사용하여 1.5 millimolar 칼슘이 포함된 ES를 흘려보내기 시작합니다.

챔버를 채울 때 접지선과 흡입 튜브가 잠겼는지 확인하십시오. 다음 단계로 넘어가기 전, 용액을 60~90초 동안 흐르게 합니다. 시작하려면 40x 대물렌즈를 사용하여 배스 내의 겹눈(ommatidia)을 주의 깊게 관찰하십시오.

개안(ommatidium)을 형성하는 길쭉한 광수용기 세포체가 축삭으로부터 분리되어 있으나 여전히 생존해 있음에 유의하십시오. 이제 실험에 적합한 개안을 선택하십시오. 다음 기준을 충족하는 경우를 선택하십시오.

외막은 매끄럽고 온전해야 합니다. 장축은 전극이 원위측에서 접근하는 방향과 거의 직각을 이루어야 합니다. 또한, 겹눈의 개별 단위인 ommatidium 주변에 과도한 조직이 없어야 합니다.

선택이 완료되면, 낱눈(ommatidium)을 시야 중심에 맞춥니다. 그런 다음 실험에 적합한 세포 내 용액을 피펫에 채웁니다. 그리고 피펫을 전극 홀더에 고정합니다.

그 다음, 피펫 튜브에 바람을 불어넣어 양압을 형성하고, 튜브 밸브를 닫아 압력을 유지합니다. 이어서 피펫을 욕조 챔버(bath chamber)에 삽입하고 낱눈(ommatidium)의 말단 부위 근처로 안내하며, 패치된 피펫의 양압으로 인해 막에 작은 함몰(dimple)이 관찰될 때까지 이동시킵니다. 이제 기록 소프트웨어에서 막 테스트 모듈을 열어 2 mV의 연속적인 사각 전압 펄스를 100 Hz의 빈도로 가합니다.

다음으로, 패치 클램프 앰플리파이어 컨트롤을 사용하여 접합 전위를 0으로 설정함으로써 사각 펄스의 기저선을 0 전류로 맞춥니다. 그런 다음 밸브를 열어 피펫 내의 압력을 해제하고, 천천히 흡입하여 음압을 형성합니다. 그러면 피펫이 세포막에 부착됩니다.

이 현상이 발생하면 밸브를 닫아 압력을 유지하십시오. 이제 전극 저항을 확인합니다. 저항값은 100에서 150 megaohms 사이로 높아져야 합니다.

그런 다음 밸브를 다시 열어 피펫의 음압을 해제합니다. 이때 저항이 1~2GΩ 사이로 급격히 상승하며, 이는 피펫과 세포 사이에 기가옴 씰(Giga-seal)이 형성되었음을 나타냅니다. 다음으로, 패치 클램프 증폭기를 사용하여 피펫의 정전 용량성 전류를 오프셋합니다.

전세포(whole-cell) 구성을 만들기 위해 입 흡입(mouth aspiration)을 사용하여 세포막을 파쇄합니다. 전극 내에 짧고 강력한 음압을 빠르게 가합니다. 전세포 구성이 완료되면 커패시턴스(capacitance)가 갑자기 증가하게 됩니다.

그 다음 패치 클램프 증폭기를 사용하여 유지 전위를 필요한 전압으로 설정하고, 직렬 저항에서 정전 용량 전류를 상쇄합니다. 이제 파라데이 케이지의 검은색 프렌치 커튼을 닫고 실험을 시작합니다. 형광 염료인 Lucifer yellow가 들어 있는 패치 피펫으로 전체 세포 구성(whole-cell configuration)을 확보하면, 겹눈(ommatidium)을 형성하는 광수용체 중 단 하나에만 염료가 주입되었음을 확인할 수 있습니다.

이 광수용체는 낱눈 내의 인접한 광수용체들로부터 전기적으로 격리될 것입니다. 야생형 초파리와 InaC 또는 InaD 유전자에 돌연변이가 있는 초파리의 낱눈에서 전세포 전압 고정(whole-cell voltage clamped)을 통해 관찰한 결과, 지속적인 약한 빛에 반응하여 양자 험프(quantum bumps)가 나타났습니다. 두 돌연변이 모두 야생형 초파리에 비해 험프의 소멸 속도가 느린 것이 관찰되었습니다.

초당 150,000개 광자로 조사된 500밀리초 광펄스에 대한 정규화된 반응을 통해 변화된 생리학적 특성이 명확하게 나타납니다. 이 표본 준비법을 이용하면 1밀리초의 짧은 약한 빛에 대한 전세포 전압 고정 양자 범프(quantum bump) 반응까지 측정할 수 있었습니다. 이러한 단일 광자 반응을 야생형, 어레스틴(arrestin) 돌연변이 및 ninaC 돌연변이 초파리에서 비교하였습니다.

두 돌연변이체 모두 일련의 돌출부(bumps) 형태로 반응했습니다. 초당 15,000개 광자를 조사한 500 밀리초 광펄스에 대한 정규화된 반응입니다. 따라서 arrestin-2 및 ninaC 돌연변이체에서 거시적 반응의 느린 종결이 관찰됩니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 초파리 광수용기 세포에서 전세포 기록(whole-cell recording)을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련된다면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 TRP 채널과 이노시톨 지질 신호 전달뿐만 아니라, 비-영상 형성 광의존적 활동에 관여하는 포유류의 내재적 광민감성 망막 신경절 세포의 역할을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열어주었습니다.