Name: 전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법 Drosophila 광 수용체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 Drosophila 광수용체에서 전세포 전압 클램프 기록을 통한 광전도 메커니즘 연구 방법입니다. 이 기술은 막 전압 완전 제어와 높은 신호대잡음비를 제공하여 시각 신호전달 이해에 기여합니다.

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이 연구의 실험적 부분은 미국 이스라엘 바이 사이언스 재단 (BM 및 IL), 이스라엘 과학 재단 (ISF), 독일 - 이스라엘 프로젝트 개발 (DIP) (BM으로), 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC 교부금 번호 : BB / M007006 / 1 및 BB / D007585 / 1)에서 RCH

<ol><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/245/1314/203">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calphotin%3A+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+and+Ca2%2B+buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15694324">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li>
<li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Lond%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li>
<li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li>
<li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li>
<li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li>
<li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/252/1335/223">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li>
<li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li>
<li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10747191">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li>
<li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li>
<li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://elsc.huji.ac.il/minke/publications/excess-g%16betae%13-over-g%16qalphae%13-%10-vivo%11-prevents-dark-spontaneous-activity-%10droso">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li>
<li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein%2C+phospholipase+C%2C+and+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li>
<li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels%2C+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234592">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li>
<li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18786361">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li>
<li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23066080">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00709805">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9003779">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li>
<li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li>
<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+transform+glucose+to+alanine%2C+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
<li>Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+block+by+Ca2%2B+underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li>
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D. melanogaster 광 수용체에 대한 전체 세포 기록의 응용은 TRP 채널 27 , 28 , 29 및 INAD 30 , 31 , 32 스캐 폴드 단백질과 같은 새로운 신호 전달 단백질의 발견 및 기능적 해명을 가능하게했다. 이 기법을 처음 도입 한 이래로 이온 반응 메커니즘에 대한 장기적인 기본 문제를 해결할 수있었습니다. 이것은 멤브레인 전압과 세포 및 세포 내 이온 조성물 19 , 28 을 정확하게 제어 할 수있는 능력이 부여 되었기 때문에 발생했습니다. D. melanogaster 에서의 패치 클램핑 기술의 주요 장애는 격리 된 개 구균 제거제의 취약성이다정액. 상세한 연구에 따르면 광전도 기계 장치의 무결성은 ATP의 지속적인 공급, 특히 빛에 노출되는 동안 ATP의 대량 소모로 이어지는 것이 중요합니다. 불행히도 패치 피펫으로 광 수용체 막에 도달하는 데 필요한 안료 ( 즉, glia) 세포의 기계적 스트라이핑은 ATP 생산에 필요한 주요 대사 물질을 제거합니다 33 . 기록 피펫으로의 외인성 ATP의 적용은 다량의 ATP에 대한 요건을 부분적으로 충족시킨다. ATP의 공급 부족은 TRP 채널의 자발적인 활성화와 빛 활성화 된 채널에서 광 전달 메커니즘의 해리로 연결되어 세포질 Ca 2+의 증가와 빛에 대한 정상적인 반응의 폐지를 초래한다. 이러한 일련의 사건은해부 절차에 의해 광 수용체가 아니라 오히려 ATP의 세포 고갈. 이러한 일련의 사건이 발생하지 않도록하고 정상적인 빛 반응을 유지하려면 광 수용체를 강렬한 빛에 노출 시켜서는 안되며 많은 양의 ATP를 섭취해야합니다. 또한, NAD는 기록 피펫에 포함되어야하며 아마도 미토콘드리아에서 ATP 생산을 촉진해야한다. 자발적 및 양자 범프의 측정을 위해서는 희미한 조명 만 사용되기 때문에 위의 어려움은 최소화됩니다. 실제적으로 안정된 전체 세포 기록은 ~ 20 ~ 25 분 동안 유지 될 수 있지만, 반응 속도론이이 기간 동안 느려지는 경향이있다. 해리 된 각화 증의 단일 제제는 최대 2 시간 동안 생존 할 수있다. 고립 된 개조 제제의 또 다른 단점은 TRP의 접근 불가능 성으로 해석되는 미생물의 접근 불가능 성이며,TRPL 채널을 녹음 피펫에 연결하여 단일 채널 녹음을 방지합니다. 그들이 개발 한 방법을 사용하여, Bacigalupo와 동료들은 횡문 면도 37 에서 단일 채널 활동을 직접 기록하는 데 성공했다. 그러나,이 채널 활성은 조직 배양 세포에서 이종적으로 발현 된 TRPL 채널의 것과는 다르며, 고립 된 개 구균 34 에서 얻은 샷 잡음 분석에서 파생 된 TRP 채널 활성과는 다릅니다. 아마도,이 방법을 사용할 때 해부 절차는 광 수용체 세포를 크게 손상 시켰습니다.

약 100 년 전에 시작된 초파리 Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) 에 대한 광범위한 유전 연구는 D. melanogaster fly를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 실험 모델로 확립했다. 아래에서 설명하는 방법은 D. melanogaster 분자 유전학의 누적 된 출력과 전체 셀 패치 클램프 녹음의 높은 신호 대 잡음 비율을 결합합니다. 이 조합은 네이티브 환경과 단일 분자의 최고 해상도 모두에서 이노시톨 - 지질 시그널링 및 TRP 채널 조절 및 활성화의 모델로서 D. melanogaster 광 변환의 연구를 허용한다. D. melanogaster photoreceptors에 대한 전체 세포 기록 방법의 적용은 무척추 동물의 phototransduction에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이 방법은 Hardie 1 과 indep가 개발했습니다.Ranganathan과 동료들에 의해 2 ~ 26 년 전에 끝내었고 , D. melanogaster 의 광범위한 유전자 조작 도구를 이용하고 phototransduction과 inositol-lipid signaling의 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었다. 처음에는이 기술은 해부학 과정에서 빛 민감도가 급격히 감소하고 개복 수확량이 낮아 세부적인 정량 연구가 어려웠습니다. 나중에 패치 피펫에 ATP와 NAD를 첨가하면 장기간의 정량적 레코딩을위한 준비의 적합성이 크게 증가했습니다. 그 후, 분자 수준에서 신호 전달 메커니즘의 광범위한 특성이 실현되었다. 현재, D. melanogaster 광전 변환은 phosphoinositide 신호 및 TRP 채널이 단일 분자 분해능으로 생체 외에서 연구 될 수있는 몇 안되는 시스템 중 하나입니다. D. melanogaster 광전 변환과 저를 만듭니다 .thodology는이 메커니즘을 매우 민감한 모델 시스템으로 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 망막을 해부하고 주위 안료 (glia) 세포에서 분리 된 ommatidia를 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 이것은 photoreceptor 세포 몸에 기가 씰과 전체 세포 패치 클램프의 형성을 가능하게합니다. 다행히 대부분의 신호 전달 단백질은 횡문근 막에만 국한되며 확산되지 않습니다. 또한 신호 구획과 세포 사이에는 칼포틴 (calciumphotin)이라고 불리는 움직일 수없는 칼슘 2+ 완충액이 있으며, 미포 질에서 Na + / Ca 2+ 교환기 (CalX)의 발현 수준이 높습니다. 함께 rhabdomere, calphotin 완충액 및 CalX의 높은 발현에 단백질 감금은 필수 구성 요소의 손실없이 상대적으로 연장 된 ( 즉 ~ 20 분까지) 전체 세포 녹음을 허용합니다빛에 대한 높은 감도를 유지하면서 광전도 공정의 다음 프로토콜은 고립 된 눈꺼풀 아래를 얻는 방법과 광 변환 캐스케이드의 고유 특성을 보존하는 것처럼 보이는 전체 세포 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 된 바퀴벌레 ( Periplaneta americana ) 6 및 크리켓 ( Gryllus bimaculatus ) 7 외피에 대한 전체 세포 패치 클램프 실험은 D. melanogaster 에 대해 기술 된 것과 유사하게 수행 되었다. 또한 파일 클램프 ( 리마 scabra )와 가리비 ( Pecten의 irradians )의 dissociated photoreceptors에 대한 패치 클램프 실험은 전체 셀 8 및 단일 채널 측정을 허용 디 melanogaster 에 실시와 약간 다른 방식으로 수행되었다 9 . 여기,이 기술을 사용하여 디 melanogaster 에서 얻은 주요 업적이 설명되어 있습니다. 토론 나는이 기법의 몇 가지 함정과 한계에 대한 설명은 없습니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기 (길쭉한 팁</td><td></td><td></td><td></td>포함</tr>) <tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &micro; m PVDF 필터&nbsp;</td></tr><tr><td>모세 혈관 (오마티디아 분리용)</td><td></td><td></td><td>유리, 1.2 x 0.68 mm (각 ~7.5 cm)</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&nbsp; </td><td>50 mL 이하</td>의 작은 비커 <td></td><td></td> 2</tr>장 <tr><td>파라핀 필름 시트 2</td>장 <td>파라필름 M</td><td></td><td>~5 x 5 cm</td></tr><tr><td>목욕실</td><td>홈메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm No. 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>시그마</td><td>파라핀 &ndash; 폴리이소부틸렌 혼합물</td><td>커버슬립을 목욕탕 바닥에 접착시키기 위해</td></tr><tr><td>바닥</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>64-1288</td><td>하이브리드 어셈블리 Ag-AgCl 와이어 어셈블리</td></tr><tr><td>헤드리스 마이크로 해부 바늘</td><td></td><td></td><td>곤충학, 12 mm</td></tr><tr><td>마이크로 해부 바늘 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2개의 세밀한 핀셋 + 1개의 거친 핀셋</td><td></td><td>Dumont #5, 생물학&nbsp;</td><td>0.05 x 0.02mm, 길이 110mm, Inox</td></tr><tr><td>입체 줌 현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>냉광원</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>필터(컬러) 냉광원</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 와이퍼</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q 시리즈 축삭 증폭기와 호환되는 홀더, 스트레이트 바디 스타일</td></tr><tr><td>실버 와이어</td><td>워너 인스트루먼트</td><td></td><td>0.25mm 직경, 염소화 필요</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>Huxley-Wall Style Micromanipulator</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>홈 메이드</td><td></td><td>전자기 노이즈 차폐 및 블랙 프론트 커튼</td></tr><tr><td>진동 방지 테이블</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Osilloscope</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>관류 시스템</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>VC-8P</td><td>핀치 밸브 제어 시스템</td></tr><tr><td>관류 밸브 컨트롤러</td><td>과학 기기</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>흡입 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>분자 장치</td><td>CV - 4</td><td>이득 : x 1/100</td></tr><tr><td>A / D 변환기</td><td>분자 장치</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>분자 장치</td><td>10</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>분자 장치</td><td>10</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>광원 (크세논 아크 램프)</td><td>셔터 기기</td><td>람다 LS</td><td></td></tr><tr><td>광 검출기</td><td>가정용</td><td></td><td>광 트랜지스터</td></tr><tr><td>필터 휠 및 셔터 컨트롤러</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 with a Uniblitz 셔터</td><td></td></tr><tr><td>필터 (자연 밀도 필터)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>필터 (컬러)</td><td>Schott</td><td>OG590, 엣지 필터</td><td></td></tr><tr><td>제논 플래시 램프 시스템</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Light guide</td><td></td><td></td><td>Quartz&nbsp;</td></tr><tr><td>펄스 발생기</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71, 반전</td><td></td></tr><tr><td>적색 조명 필터 (현미경)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &oslash; 45mm</td></tr><tr><td>현미경 목표</td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air 또는 X60/1.25 UplanFI 오일</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS 요소&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Ca+2 지시자</td><td>Invitrogen</td><td>Calcium green 5N</td><td></td></tr><tr><td>Excitation & emission filters and dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Longpass SET</td><td></td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>모델 PP83</td><td>원하는 대로 수직 또는 수평 풀러를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>수평 피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>모델 P-1000 화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트</td><td>셔터 기기</td><td></td><td>3mm 트로프 또는 사각형 상자</td></tr><tr><td>모세</td>관 <td>Harvard Apparatus</td><td>붕규산 유리 모세관</td><td>1 x 0.58mm</td></tr></tbody></table>

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; drosophila</em&gt; 광 수용체

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Drosophila melanogaster 광 수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록은 단일 분자 수준에서 이노시톨 - 지질 신호 및 과도 수용 수용체 (Transient Receptor Potential, TRP) 채널을 연구하기 위해 D. melanogaster 분자 유전학의 사용을 가능하게하는 무척추 동물 영상 전달 분야를 혁신했습니다. 소수의 연구실에서는이 강력한 기법을 익혔으며 고도로 제어 된 조건에서 빛에 대한 생리적 반응을 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 및 세포 외 매체를 제어 할 수 있습니다. 막 전압; 및 다양한 이온 성 또는 pH 지시약과 같은 약리학 적 화합물의 세포 내 및 세포 외 매체로의 신속한 적용을 포함한다. 예외적으로 높은 신호 대 잡음비로,이 방법은 어두운 자발적 및 광 유도 단일 전류 (자발적 및 양자 범프)와 거시적 인 빛 유도 전류 (LIC)를 죄로부터 측정 할 수 있습니다gle D. melanogaster 광 수용체. 이 프로토콜은 전기 생리 학적 및 광학적 기록을 모두 포함하는이 기술을 수행하는 데 필요한 모든 주요 단계를 아주 자세하게 설명합니다. 목욕실에서 손상되지 않고 생존 가능한 생체 외 고립성 구강 내막염 제거를위한 파리 망막 해부 절제술이 기술되었다. 전체 셀 및 형광 이미징 측정을 수행하는 데 필요한 장비도 자세히 설명합니다. 마지막으로, 확장 된 실험 동안이 섬세한 준비를 사용함에있어서 함정이 설명됩니다.

기술 된 방법은 정의 된 조건 하에서 빛에 대한 거시적 인 응답을 생성하기 위해 합계하는 자발적이고 광 유발 된 양자 범프를 생성하는 기본 단위 전류의 정확한 기록을 가능하게했다. 그것은 또한 중요한 신호 분자 ( 그림 3 과 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 결함이있는 야생형과 돌연변이 파리 사이의 비교를 허용했습니다. 또한, bi-ionic 조건 하에서 reversal potential을 측정하는 능력은 TRP와 TRP-like (TRPL) 채널의 기본적인 생물 물리적 특성을 밝혀냈다. 그것은 또한 Ca 2+ 를 변형시킨 TRP의 세공 영역에서 아미노산 치환 효과를 측정 할 수있게 해 주었다투자율 20 . 패치 클램프 전체 셀 기록에 의해 얻어진 빛 응답은 적어도 4 차수의 광 강도에 선형 적으로 의존합니다. 이것은 ERG 및 세포 내 기록 방법을 사용하여 해결할 수 없습니다. 따라서, 증가하는 강도의 간단한 섬광에 대한 일련의 반응 및 강도 반응 함수의 플롯은 광 세기가 증가함에 따라 플래시 응답의 엄격한 선형성을 나타내었다. 엄격한 선형성은 적어도 수백 pA까지 유지되지만, 이후에는 선형성 또는 고장을 일으키는 클램프 제어인지 여부는 논쟁의 여지가 있습니다 ( 그림 6 ). 이러한 결과는 빛에 대한 거시적 인 반응이 빛에 대한 단일 응답 ( 즉, 양자 범프)의 선형 합계임을 시사한다. 그것은 빛 자극 ind를 어둡게하는 전압 기록을 사용하여 잘 확립되어왔다.대부분의 무척추 동물에서 개별적인 전압 변동 ( 즉, 양자 범프)이 발생합니다. D. melanogaster 양자 범프는 범프 18 의 피크에서 ~ 15 TRP 채널과 ~ 2 TRPL 채널의 공동 개통으로 인해 발생합니다. 각각의 범프는 단일 광자의 흡수에 의해 생성되는 반면,보다 강렬한 빛에 대한 거시적 인 반응은 이들 기본 응답의 합계 14 , 21 이다. 범프는 자극 조건이 동일한 경우에도 대기 시간, 시간 경과 및 진폭이 크게 다릅니다. 범프 발생은 포아송 (Poisson) 통계에 의해 기술 된 확률 과정 ​​(stochastic process)으로, 효과적으로 흡수 된 각각의 광자는 단지 하나의 범프만을 유도한다. 단일 - 광자 - 단일 범프 관계는 캐스케이드의 각 단계가 효율적인 &quot;턴온&quot;메커니즘뿐만 아니라 똑같이 효과적인 &quot;턴 오프&quot;메커니즘을 포함 할 것을 요구합니다. 기능적 이점은매우 민감한 광자 카운터는 시각적 시스템에 필요한 감도와 시간 해상도에 매우 적합한 빠른 과도 응답을 제공합니다. 능동적 인 photopigment ( 즉, metarhodopsin, M) 또는 그것의 타겟 인 G q α가 불 활성화되지 않고 빛이 꺼진 후에도 계속적으로 범프가 생성 될 때 효율적인 턴 오프 메커니즘에 대한 요구 사항이 드러난다. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . 범프는 미세 융모에서 TRP / TRPL 채널의 협력 활동을 나타냅니다. 이와 같이, 채널 활성화의 임의의 가설은 협력 채널 활성화를 또한 설명해야한다. 최근 하디 (Hardie)와 동료들은 빛이 광 수용체의 빠른 수축을 불러 일으킨다는 것을 보여 주었는데, 이는 감광제e 채널 (TRP / TRPL)은 기계적으로 게이팅 될 수 있습니다 25 . 이 기계적 활성화는 PLC 매개 PIP 2 가수 분해에 의해 방출 된 관찰 된 양성자와 함께 TRP / TRPL 채널의 개방을 촉진하고 범프 생산의 협동 특성을 설명한다. 현재 D. melanogaster 광 수용체는 phosphoinositide 신호 전달 및 TRP 채널 을 생체 내 에서 연구 할 수있는 몇 가지 시스템 중 하나이므로 D. melanogaster 광전 변환을 만들고이 메커니즘을 연구하는 방법이 개발되어 매우 유용한 모델 시스템입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> 그림 3 : inaC P209 와 inaD P215 돌연변이 체는 빛과 단일 양자 범프에 대한 거시적 반응의 느린 응답 종료를 나타냅니다. ( A ) 고립 된 개 모세 혈관 예비형광 루시퍼 옐로우 CH 염료 (여기 : 430 nm, 방출 : 540 nm)로 채워진 패치 피펫으로 배양 한 후 전체 세포를 녹음 하였다. 형광 염료는 하나의 광 수용체 세포 몸체를 확산 및 표지하고 광 수용체 세포 몸체는 길쭉한 축색 돌기에서 분리되지만 생존력을 유지한다는 점에 유의하십시오. 이 준비는 전체 세포 녹음 및 영상 실험을 동시에 수행하는 데 적합합니다. ( BD ) 상단 패널 : WT, inaC P209 및 inaD P215 돌연변이 플라이에서 연속 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 범프의 느린 종결은 WT 파리에 비해 inaC P209 및 inaD P215 돌연변이에서 관찰됩니다. 아래의 삽 입은 단일 범프의 확대 된 모양을 표시합니다. 하단 패널 : 정규화 된 전체 세포는 위의 야생형의 500ms 광 펄스 (1.5 x 10 5 광자 / 초)에 대한 거시적 인 응답을 기록했습니다.<html> 돌연변이 파리. (EG) 상단 패널 : 야생형, arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 단일 광자 반응을 유발하는 짧은 (1 ms) 희미한 빛에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 단일 광자 흡수에 대한 반응으로 arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 관찰 된 범프 트레인에 주목하십시오. 하단 패널 : 전체 셀 전압은 대응하는 돌연변이 체에서 500 ms 광 펄스 (1.5 x 10 4 광자 / s)에 대한 정규화 된 응답을 고정했습니다. arr2 3 에서 관찰 된 거시적 반응의 느린 종결에 주목하십시오 및 ninaC P235 돌연변이 체는 WT에 비하여 파리. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> d / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 신호 유도 된 칼슘 2+ 주입 후 세포질 칼슘 2+ 역학은 칼 포틴에 의해 영향을받습니다. 야생형과 Cpn 1 % 의 광 수용체 이미지의 시계열은 빛 자극 동안 Ca 2+ 지시약의 형광을 나타냅니다. 원시 강도 영상은 잘못된 색상 코딩 (막대 = 10 μm, 화살촉은 피펫을 나타냄)을 사용하여 플롯됩니다. Weiss 외의 허가를 받아 증쇄 된 그림 . 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> 그림 5 : WT, trp 및 trpl 돌연변이 체의 전기 생리 학적 성질. ( A ) 전체 셀 전압 클램프 리코WT, trp 302 및 trp P343 null 돌연변이 플라이의 연속적인 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 응답으로 양자 범프의 돌출부. trp P34 3 범프의 크게 감소 된 진폭이 관찰됩니다. 삽입 : wildtype과 trp P343 null 돌연변이 플라이의 확대 된 단일 양자 범프가 표시됩니다. ( B ) 야생형의 3 초 광 펄스 및 해당 돌연변이 체에 대한 반응으로 전체 세포 전압 클램프 기록. trp P343 돌연변이 체의 일시적인 정상 상태 응답이 관찰됩니다. 삽입 : WT 및 trp P343 돌연변이 체의 확대 된 빛 반응이 표시됩니다. ( C ) 역전 전위 (E rev )를 중심으로 측정 한 3 mV의 전압 단계에서 20 ms 광 펄스에 반응하여 유도 된 상기 플라이 변형의 중첩 된 광 유도 전류 군. ( D ) wildtype의 평균 E rev 와 다양한 mutan을 플로팅하는 히스토그램ts. 오류 막대는 SEM입니다. WT의 역전 전위 (E rev )는 TRP 만 나타내는 trpl 302 의 양의 전자 레인지와 TRPL 만 나타내는 trp P343 null 돌연변이의 전자 레인지 사이에 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> 그림 6 : 플래시 응답은 빛의 강도가 증가함에 따라 엄밀히 선형입니다. 빛의 강도가 증가하는 간단한 섬광에 대한 현재의 일련의 반응과 짧은 빛의 섬광의 증가하는 강도에 대한 빛의 반응의 피크 진폭의 의존성에 대한 플롯. 이 관계는 플래시 응답과 증가하는 광 강도 간의 엄격한 선형성을 나타냅니다. 이 엄격한 선형성빛의 강도가 4 차수 이상에 걸쳐서 적어도 수백 pA를 유지하는 반면 선형성이든 아니면 이후에 고장 나게되는 클램프 제어인지는 논쟁의 여지가있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (NaOH로 조절) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 프롤린 </td><td> 25 세 </td></tr><tr><td> 알라닌 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 참고 :이 솔루션은 명목상 Ca 2+ 가 없지만 Ca 2+ 완충액이 첨가되지 않았으므로 약 5 - 10μM의 Ca 2+가 추가 됩니다. Extracellular solution (ES) = ES-0Ca 2+ 에 1.5 또는 1 M 재고 용액에서 CaCl 2 를 첨가하여 만든 1.5 mM CaCl 2의 ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> 표 1 : Ca +2 없는 세포 외 용액 (ES). 화학적 설명 및 Ca +2가 없는 ES의 생산에 필요한 특정 양. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 mL </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 1.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5 mL 바이알에 150 μL 분량으로 나누어 -20 °에 보관하십시오 76, C. </td></tr><tr><td> 연화 액 (TS) </td><td> 해부 동안 사용 된 용액과 일치하도록 원액 150 mL의 1 바이알에 1,350 mL의 ES 또는 ES-0Ca 2+ 를 채 웁니다. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 용액. 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 솔루션의 생산에 필요한 화학적 설명 및 특정 양. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (KOH로 조정) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> 글루 콘산 칼륨 (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP 마그네슘 염 (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP 나트륨 염 (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr></tbody></table> 표 3 : 세포 내 용액 (IS1). 화학적 설명과 IS1 생산에 필요한 특정 양은 주로 강도 응답 및 양자 범프 측정에 사용됩니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (CsOH로 조정) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP 마그네슘 염 (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP 나트륨 염 (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 테트라 에틸 - 염화 암모늄 (TAE) </td><td> 15 명 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr></tbody></table> 표 4 : 세포 내 용액 (IS2). 광학적 유도 전류의 역전 전위 측정에 주로 사용되는 세포 내 용액 IS2를 생성하는 데 필요한 화학적 설명 및 특정 양.

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 단일 광수용기 세포에서 전세포 전압 클램프 기록을 얻어, 단일 광자 흡수로 인해 발생하는 광유도 전류와 강한 빛에 대한 반복적인 반응을 측정하는 것입니다. 이 방법은 광전환의 기초가 되는 물리적 및 이온적 기전과 TRP 채널의 특성과 같은 감각 전달 분야의 핵심 주제들을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용함으로써 얻을 수 있는 이점으로는 막 전압의 완전한 제어, 매우 높은 신호 대 잡음비, 그리고 광학적 측정을 위한 특정 지표를 도입할 수 있는 능력이 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 표본의 매우 작은 크기와 대사적 취약성으로 인해 빠르게 해부를 진행해야 한다는 점에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 위해 초파리를 바이알당 약 20마리의 밀도로 사육하십시오. 실험 시점에는 번개가 막 닫히려는 상태의 번개가 들어 있는 바이알 몇 개를 준비하고, 최소 24시간 동안 지속적인 암조건 하에 두십시오.성충을 수집하기 2시간 전에 이미 우화한 성충을 모두 제거하십시오. 암순응된 파리는 항상 적색광 조명 아래에서 다루십시오. 갓 우화한 파리를 기다리는 동안 기록 챔버를 준비하십시오.녹인 파라핀 또는 고진공 실리콘 그리스를 사용하여 커버슬립을 챔버 바닥에 고정해 배스(bath)를 완성합니다. 그다음 배스를 도립현미경의 스테이지에 장착합니다. 배스 안에 관류 시스템 튜브, 흡입 시스템 튜브, 그리고 전기생리학 설정을 위한 접지선을 배치합니다.해부를 시작하기 전, 60 mm 페트리 접시 뒷면에 몇 가지 용액을 준비합니다. 칼슘이 제거된 ES 용액 네 방울과 TS 용액 한 방울을 각각 떨어뜨립니다. 이제 거친 핀셋을 사용하여 최근에 우화한 초파리의 날개나 몸통을 잡습니다. 그런 다음 정밀 핀셋을 사용하여 머리를 분리하고, 분리된 머리를 칼슘이 제거된 ES 용액의 첫 번째 방울로 빠르게 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 두 번째 정밀 핀셋을 사용하여 머리를 시상면을 따라 이등분으로 해부합니다.양쪽 눈이 모두 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 머리의 1/2을 두 번째 칼슘 제거 ES 방울로 옮기고, 나머지 절반의 머리를 세 번째 칼슘 제거 ES 방울로 옮깁니다. 그런 다음 두 눈 중 하나를 박리하십시오.미세 핀셋을 사용하여 망막에 손상이 가지 않도록 안구 주변 조직을 최대한 제거합니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 각막 가장자리를 단단히 잡고 망막을 긁어냅니다. 그 결과, 손상되지 않은 망막으로부터 분리된 빈 상태의 온전한 각막을 얻어야 합니다.피펫은 에탄올에 보관되어 있으므로, 새로운 trituration pipette을 사용할 때는 항상 먼저 물로 헹구십시오. 그다음 헹군 피펫에 네 번째 방울부터 calcium-free ES를 소량 채웁니다. 그런 다음 입으로 부드럽게 흡입하여 분리된 망막을 피펫 안으로 끌어당깁니다.공기 방울이 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 그런 다음 망막을 TS 방울 속으로 옮깁니다. 다음으로, 두 눈 모두 TS 방울 안에 있도록 반대편 눈에서도 망막 분리를 반복합니다. 그 후 페트리 접시에서 칼슘이 제거된 ES만을 조심스럽게 닦아내고, 접시 표면에 TS를 6방울 더 추가합니다.두 망막을 새로운 TS 방울로 옮깁니다. 그 다음, trituration pipette을 개구부가 작은 것으로 교체합니다. pipette을 헹군 후, TS 한 방울을 채웁니다. 이 pipette을 사용하여 두 망막을 빠르게 반복적으로 흡입 및 배출하여 낱눈(ommatidia)을 색소 세포로부터 분리합니다. 이 과정에서 TS가 탁해집니다.다음으로, 두 망막의 잔여물을 TS 용액의 다른 한 방울로 옮깁니다. 그런 다음, 분리된 낱눈(ommatidia)이 포함된 혼탁한 TS 용액 방울을 피펫으로 흡입합니다. 이 용액을 배스 챔버(bath chamber)로 배출합니다. 망막이 완전히 용해될 때까지 직경이 더 작은 trituration 피펫으로 이 과정을 반복합니다.이제 1분 동안 기다립니다. 이 대기 시간 동안 분리된 개안(ommatidia)이 챔버 바닥에 부착됩니다. 1분 후, 퍼퓨전 시스템을 사용하여 1.5 millimolar 칼슘이 포함된 ES를 흘려보내기 시작합니다.챔버를 채울 때 접지선과 흡입 튜브가 잠겼는지 확인하십시오. 다음 단계로 넘어가기 전, 용액을 60~90초 동안 흐르게 합니다. 시작하려면 40x 대물렌즈를 사용하여 배스 내의 겹눈(ommatidia)을 주의 깊게 관찰하십시오.개안(ommatidium)을 형성하는 길쭉한 광수용기 세포체가 축삭으로부터 분리되어 있으나 여전히 생존해 있음에 유의하십시오. 이제 실험에 적합한 개안을 선택하십시오. 다음 기준을 충족하는 경우를 선택하십시오.외막은 매끄럽고 온전해야 합니다. 장축은 전극이 원위측에서 접근하는 방향과 거의 직각을 이루어야 합니다. 또한, 겹눈의 개별 단위인 ommatidium 주변에 과도한 조직이 없어야 합니다.선택이 완료되면, 낱눈(ommatidium)을 시야 중심에 맞춥니다. 그런 다음 실험에 적합한 세포 내 용액을 피펫에 채웁니다. 그리고 피펫을 전극 홀더에 고정합니다.그 다음, 피펫 튜브에 바람을 불어넣어 양압을 형성하고, 튜브 밸브를 닫아 압력을 유지합니다. 이어서 피펫을 욕조 챔버(bath chamber)에 삽입하고 낱눈(ommatidium)의 말단 부위 근처로 안내하며, 패치된 피펫의 양압으로 인해 막에 작은 함몰(dimple)이 관찰될 때까지 이동시킵니다. 이제 기록 소프트웨어에서 막 테스트 모듈을 열어 2 mV의 연속적인 사각 전압 펄스를 100 Hz의 빈도로 가합니다.다음으로, 패치 클램프 앰플리파이어 컨트롤을 사용하여 접합 전위를 0으로 설정함으로써 사각 펄스의 기저선을 0 전류로 맞춥니다. 그런 다음 밸브를 열어 피펫 내의 압력을 해제하고, 천천히 흡입하여 음압을 형성합니다. 그러면 피펫이 세포막에 부착됩니다.이 현상이 발생하면 밸브를 닫아 압력을 유지하십시오. 이제 전극 저항을 확인합니다. 저항값은 100에서 150 megaohms 사이로 높아져야 합니다.그런 다음 밸브를 다시 열어 피펫의 음압을 해제합니다. 이때 저항이 1~2GΩ 사이로 급격히 상승하며, 이는 피펫과 세포 사이에 기가옴 씰(Giga-seal)이 형성되었음을 나타냅니다. 다음으로, 패치 클램프 증폭기를 사용하여 피펫의 정전 용량성 전류를 오프셋합니다.전세포(whole-cell) 구성을 만들기 위해 입 흡입(mouth aspiration)을 사용하여 세포막을 파쇄합니다. 전극 내에 짧고 강력한 음압을 빠르게 가합니다. 전세포 구성이 완료되면 커패시턴스(capacitance)가 갑자기 증가하게 됩니다.그 다음 패치 클램프 증폭기를 사용하여 유지 전위를 필요한 전압으로 설정하고, 직렬 저항에서 정전 용량 전류를 상쇄합니다. 이제 파라데이 케이지의 검은색 프렌치 커튼을 닫고 실험을 시작합니다. 형광 염료인 Lucifer yellow가 들어 있는 패치 피펫으로 전체 세포 구성(whole-cell configuration)을 확보하면, 겹눈(ommatidium)을 형성하는 광수용체 중 단 하나에만 염료가 주입되었음을 확인할 수 있습니다.이 광수용체는 낱눈 내의 인접한 광수용체들로부터 전기적으로 격리될 것입니다. 야생형 초파리와 InaC 또는 InaD 유전자에 돌연변이가 있는 초파리의 낱눈에서 전세포 전압 고정(whole-cell voltage clamped)을 통해 관찰한 결과, 지속적인 약한 빛에 반응하여 양자 험프(quantum bumps)가 나타났습니다. 두 돌연변이 모두 야생형 초파리에 비해 험프의 소멸 속도가 느린 것이 관찰되었습니다.초당 150,000개 광자로 조사된 500밀리초 광펄스에 대한 정규화된 반응을 통해 변화된 생리학적 특성이 명확하게 나타납니다. 이 표본 준비법을 이용하면 1밀리초의 짧은 약한 빛에 대한 전세포 전압 고정 양자 범프(quantum bump) 반응까지 측정할 수 있었습니다. 이러한 단일 광자 반응을 야생형, 어레스틴(arrestin) 돌연변이 및 ninaC 돌연변이 초파리에서 비교하였습니다.두 돌연변이체 모두 일련의 돌출부(bumps) 형태로 반응했습니다. 초당 15,000개 광자를 조사한 500 밀리초 광펄스에 대한 정규화된 반응입니다. 따라서 arrestin-2 및 ninaC 돌연변이체에서 거시적 반응의 느린 종결이 관찰됩니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 초파리 광수용기 세포에서 전세포 기록(whole-cell recording)을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련된다면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 TRP 채널과 이노시톨 지질 신호 전달뿐만 아니라, 비-영상 형성 광의존적 활동에 관여하는 포유류의 내재적 광민감성 망막 신경절 세포의 역할을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열어주었습니다.

electrophysiological-method-for-whole-cell-voltage-clamp-recordings

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 표준 전체 세포 기술을 사용하여 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 그것은 녹음하는 동안 많이 GFP 라벨 세포와 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다.

성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

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양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

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전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법

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