Name: 뇌막 분획 화 : Ex Vivo Subsynaptic Protein Localization 평가 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 생쥐 뇌 시냅스 구획 단백질 분리를 위한 막 분획화 방법입니다. 이 기법은 정상 및 병리 상태에서 시냅스 기능 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 ICELA Academia-2010 (ICREA Academia-2010)의 Catalina de Recerca / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 및 PIE14 / 00034) ), FC에 대한 Wenenschap en Technologie (SBO-140028)의 이그 제 큐 티브 (AGENTCHAP VOR Innovatie) 기술 연구소 (SBM-140028) 또한 X, M, VF-D. 및 FC는 &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; . 이 작품은 CAPES (브라질)에서 FC까지 &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot;

모든 동물 실험 절차는 Laboratory Animals 11 의 관리 및 사용 안내서에 설명되어있는 유럽 공동체 (European Community ) 에 따라 동물 실험 및 동물 관리위원회 (CEEA)에서 승인 한 바 있습니다.이 지침은 86 / 609 / CCE, FELASA 및 ARRIVE 지침. 따라서 마우스는 음식과 물을 자유롭게 접할 수있는 표준 케이지에 보관하고 표준 표준 조건 (오전 7시 30 분, 온도 22 ° C, 습도 66 %에서 시작하여 12 시간 어둡거나 밝은 주기로 유지)하에 보관합니다. 1. 불연속 Sucrose Gradient를 사용하여 마우스 뇌 시냅 토좀을 얻는 방법 참고 :이 방법은 이전에보고되었습니다 10 . <ol><li> 신선한 격리 완충액 (IB), pH 7.4를 준비하십시오. 2 M 수 크로스; 1 M 수 크로스 /0.1 mM CaCl2; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. </li><li> 사자궁 경부 탈구로 5 마리 생쥐를 구부린다. 각 동물의 뇌를 잘리고 빠르게 제거하십시오. 관심의 뇌 영역 (즉, 해마, 0.25-0.35 g의 신선한 조직)을 해독하고 1 ML의 IB와 함께 얼음에 5 ML 포터 - Elvehjem 유리 튜브에 넣으십시오. </li><li> 샘플 온난을 막기 위해 얼음 조에서 우선적으로 균질화 교반기 (분당 700-900 회전 10 스트로크)를 사용하여 조직을 균질화합니다. </li><li> 4 2 ML 자당과 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML의 6 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 균질 조직 (1 ML)를 놓습니다 ° C. 튜브를 뒤집어서 천천히 혼합하십시오. 주 : 칼슘의 첨가는 세포 소기관 간의 접착 상호 작용을 유지하고 다른 &quot;밀도&quot;의 구조를 보존하는 데 필수적입니다. </li><li> 12 ML 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓고 천천히 sucrose 그라디언트를 형성하는 각 튜브의 상단에 1 M 자당 / 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML을 추가합니다. 참고 : 위치에 레이블을 붙이십시오.영구 마커를 사용하여 원심 분리 관의 기울기 인터페이스. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량 및 평형을 취합니다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 100,000 x g 및 4 ° C에서 3 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 모든 강철 지지대로 로터를 완전히 채 웁니다 (필요한 경우 비어 있음). </li><li> myelin이 포함 된 상단 레이어를 삭제합니다. 파스퇴르 피펫으로 synaptosome 분수에 해당하는 1.25-M과 1-M sucrose interphase 사이의 흰 고리를 수집하십시오. </li><li> 원심 분리 관에서 IB를 사용하여 9 배로 시냅 토좀을 희석하십시오. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량하고 평형을 유지하십시오. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 15,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액을 버리고 resuspend th펠릿에 1.1 mL의 IB 용액을 첨가 하였다. 이 시냅 토좀 용액 100 μL를 모으고 11,000 x g 및 4 º C에서 5 분간 원심 분리하십시오. </li><li> synaptosomal 펠렛을 5 % sodium dodecyl sulfate (SDS)에 재현 탁하고이 샘플을 -20 ° C에 보관하십시오. 참고 :이 샘플은 추가 Western-blot 분석을위한 총 synaptosome 분율에 해당합니다. 남아있는 시냅 토좀 분획 (~ 1 mL)은 사용 전까지 -20 ℃에서 동결되거나 후속 시냅스 분획을 위해 처리 될 수 있습니다. synaptosomes 또는 정제 된 시냅스는 총 해마 부피의 1 ~ 2 %를 나타낸다. </li></ol> 2. 전 -, 사후 - 및 외 연접 - 격리 <ol><li> 신선한 용해 버퍼 (pH 6.0) 2x를 준비하십시오. 1x 가용화 완충액, pH 6.0; 가용화 완충액, pH 8.0; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. 참고 :이 용액의 pH는 반드시 정확해야합니다좋은 subsines 분별을 달성하기 위해 조정. </li><li> 천천히 1 ML 재 합성 synaptosomal 분수 (단계 1.12 참조) 0.1 MM CaCl 2 5 ML로 천 희석하십시오. </li><li> ice-cold 2x 가용화 완충액 (pH 6.0)과 동일한 부피 (5 mL)를 넣고 빙상의 비이커에서 높은 교반하에 얼음 위에서 50 분 동안 배양한다. 참고 : pH 6.0의 Triton X-100의 1 %가 모든 세포막 단백질을 용해 시키지만 시냅스 접촉 또는 접합부 ( 예 : 전 및 시냅스 후 구조)에서 단백질을 보존합니다 4 . </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 0.1 mM CaCl2와 2 배 가용화 완충 용액 (pH 6.0)을 동등한 부피의 스틸 지지체와 닫힌 뚜껑과 함께 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 생성 된 상등액은 세포 외 분획을 나타내며,펠릿은 시냅스 접합부 ( 즉, 시냅스 후 분획)에 상응한다. </li><li> 4,000 x 4 및 4 ºC에서 원심 분리 된 15 mL 10K 필터 튜브를 사용하여 비회원 분획이 들어있는 상등액을 최종 200 μL 부피로 농축합니다. </li><li> -20 ℃에서 미리 냉각 (-20 ℃) ​​한 아세톤 5 방울 (1 mL)을 사용하여 결과로 농축 된 엑시 신 시냅스 분획 (200 μL)을 침전시킨다. </li><li> 다음 날, 18,000 x g 과 -15 ° C에서 30 분간 외 발성 분열물을 원심 분리한다. 원심 분리 후, 아세톤 상등액을 버리고 펠렛을 건조시켜 아세톤 흔적을 제거한다. </li><li> 마지막으로 5 % SDS의 200 μL와 extrasynaptic 단백질을 포함하는 펠렛을 resuspend. 필요한 경우 펠릿을 초음파 처리하십시오. </li><li> 그것을 방해하지 않고 조심스럽게 사전 및 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 1x 용해 버퍼, 산도 6.0 2 ML로 씻으십시오. 버퍼를 폐기하십시오. </li><li> Resuspend유리 파스퇴르 (Pasteur) 피펫을 사용하여 1x 가용화 완충액 (pH 8.0) 10 mL로 펠렛 화 하였다. 참고 : pH 8.0의 Triton X-100의 1 %가 시냅스 전문화를 용해하지만 불용성 시냅스 후 밀도 4를 유지 합니다. </li><li> 얼음에 비커에서 높은 교반하에 얼음에 50 분 동안 현탁액을 품어. </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 해당 튜브 지지대와 닫힌 뚜껑 안에 1x 가용화 완충 용액 (pH 8.0)으로 튜브의 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 결과 상층 액은 시냅스 전 분획에 상응하고 펠렛은 시냅스 후 분획에 상응한다. </li><li> 단계 2.6-2.9에서 설명한대로 presynaptic 분수를 포함하는 뜨는을 처리합니다. </li><li> 5 % SDS의 200 μL와 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 펠렛을 초음파 처리하세요.f가 필요합니다. </li></ol> 3. 멤브레인 분별을 검증하기 위해 immunoblot으로 시료를 분석하십시오 <ol><li> bicinchoninic 산성 단백질 분석을 사용하여 각 분획 ( 즉, 총, 여분, 사전 및 시냅스 후 분수)에서 단백질의 양을 결정합니다. </li><li> 각 분획에서 20 μg의 단백질을 취해 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 시료 완충액 중 50 μL의 최종 부피로 희석한다. 100 ℃에서 5 분간 끓입니다. </li><li> 환원 조건에서 4 % 농축 젤로 SDS-PAGE 전기 영동 10 %로 단백질을 분리하십시오. 염료가 낮은 젤에 들어갈 때까지 80V의 정전압으로 전기 영동 한 다음 전압을 120V로 증가시킵니다. </li><li> 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 IB 블로킹 용액으로 45 분간 실온에서 연속적으로 흔들어 블로킹합니다. </li><li> 표시된 기본 항체 ( 즉, 안티 SNAP - 25,항 -PSD-95, 항 - 시냅토 피신 또는 항 -GPR37)를 연속적으로 흔들어 주면서 IB 차단 용액으로 희석시켰다. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 1 차 항체를 제거합니다. </li><li> 표시된 2 차 항체와 함께 상온에서 어두운 조건에서 90 분 동안 지속적으로 흔들어주세요. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 2 차 항체를 제거합니다. </li><li> 멤브레인을 화학 발광 기질과 함께 배양하십시오 (어두운 조건에서 혼합액을 준비하고 제조사가 제공 한 용액 A와 B의 1 : 1 비율을 따르십시오). </li><li> 화학 발광 검출 장치에서 막을 분석하십시오. </li></ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 뇌 영역 내의 특정 단백질의 부갑상선 분포 연구에 대한 강력한 생화학 도구를 구성합니다. 그러나 여기서 강조해야 할 기술에 내재 된 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 주요 제한 사항 중 하나는 모든 subsynaptic 분수의 immunoblot 분석을 수행하기 위해 합리적인 금액의 단백질을 정화하는 데 필요한 조직의 상대적으로 큰 금액입니다. 이 문제는 시냅스 ( 즉, 시냅 토좀)가 총 해마 부피의 1-2 %만을 차지한다는 사실과 관련이 있습니다. 실제로, 분열을 성공적으로 수행하려면 1 ~ 1.5 g의 신선한 조직 ( 즉, 해마)이 필요합니다. 그렇지 않으면 수확량이 너무 낮아서 연구중인 단백질의 정체뿐만 아니라 위치를 평가할 수 없다. 반대로, 과량의 뇌 조직이 사용되면, 분리 절차 w최적이 아닐세. 최적의 반구 분화를 보장하기 위해 용액의 pH를 조심스럽게 조절하는 것도 중요합니다. 결과적으로, 뇌막 분획이...

시냅스 전달은 시냅스의 물리적 무결성에 달려 있는데, 이것은 포스터 (Foster)와 셔링턴 (Sherrington)에 의해 1897 년에 상상 된 개념이다. 따라서 정상 신경계와 병리학 적 상태 모두에서 중요한 신경 전달 요소 ( 예 : 이온 채널, 수용체 등 )의 분포를 이해하는 것이 시냅스 기능을 해명하는 데 필수적입니다. 전자 현미경 (EM)은 프로토 타입 중추 신경계 (CNS) 시냅스의 현재의 미세 구조 개념에 엄청난 공헌을했습니다. 이러한 방식으로 EM은 사전 및 후기 시냅스 밀도의 차이를 정교하게 정의했으며, 이는 일정한 거리 (~ 25 nm)의 틈으로 구분됩니다. 흥미롭게도, postsynaptic 장치는 소위 postsynaptic 밀도, 또는 PSD 2 라는 자사의 원형 막 아래 상대적으로 지속적인, 전자 밀도 농축을 보여줍니다. 반대로, presynaptic 장치에서, noticeabl불연속 cytomatrix 네트워크는 원형 막 바로 아래에 배치되어 있으며, 이것은 시냅스 소포를 원형 막 멤브레인 활성 영역 3에 정렬 및 도킹하는 데 필수적입니다. 따라서 EM은 구조적으로 보존 된 CNS 시냅스 내에서 단백질 분포를 조사하기위한 황금 실험 접근법을 구성합니다. 그러나 전자 현미경 사진에서 제공하는 정보는 정적입니다. 사실, 축적 된 증거는 생체 내 시냅스가 극도로 역동적이어서 지속적인 시냅스 전달에서 극적인 구조 변화를 경험한다는 것을 보여줍니다. 또한, 시냅스의 형태와 구성은 다양한 CNS 지역에서 발달, 성숙, 노화 및 신경 병리학 적 상태의 발달에 따라 변할 수있다. 전반적으로 생리 조건에서 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 데 초점을 맞춘 프로토콜은 시냅스 기능에 대한보다 포괄적 인 연구를위한 유용한 도구입니다. 등에 의해 처음으로 기술 된이 막 분획 화 방법은, (2001) 4 는 사전 및 사후의 시냅스 장치 내에서 발생하는 접착 상호 작용을 약화시키는 pH 변화에 기초한다. 첫째, pH 6.0에서 약한 세제를 사용하여 사전 및 사후 시냅스 장치를 보유하고 가용화되어 시냅스 접촉에서 추출 할 수있는 비회원 막 영역에서 유지되는 접착 접합을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 중성 세제의 존재하에 pH를 6.0에서 8.0으로 올리는 것은 접합체 접합부의 강도를 약화시켜 접합 전 활성 영역이 접합 후 밀도에 단단히 결합되도록합니다. 따라서, presynaptic 구획은 너무윤활유는 후자 농도에서 분리 될 수 있는데, 이는 사용 된 세제의 농도가 그 가용화를 촉진시키지 않기 때문에 대부분 보존된다. 흥미롭게도, 분할 효율은 결국 90 % 이상으로, 다른 subsynaptic 마커에 의해 확인할 수 있습니다 : i ) synaptosomal 관련 단백질 25 (SNAP - 25), presynaptic 활성 영역에서; ii ) synaptophysin, extrasynaptic 분수에서 ( 즉, 활성 영역 외부 및 microsomes 포함); 그리고 ⅲ ) postsynaptic density 단백질 95 (PSD-95). 특히,이 뇌막 분화 방법은 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 알파 - 아미노 -3- 하이드 록시 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 수용체 5 , 아데노신 A1 수용체 (A1R) 6 및 아데노신 A1 수용체와 같은 상이한 수용체의 부갑상선의 국소화를 정확하게 결정할 수 있었다. ,아데노신 A 2A 수용체 (A 2A R) 7 , 아데노신 트리 포스페이트 (ATP) P2 수용체 8 , 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 서브 유닛 9 및 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 . 그러나, 여러 가지 제한 사항은 특정 연결 단백질의 시냅스 분포의 적절한 평가를 방해 할 수 있습니다. 따라서이 과정에서 우리는 전체 프로토콜을 완전하게 기술 할뿐만 아니라, 필요한 많은 양의 조직, 낮은 단백질 수율 및 단백질의 효율을 검증하기위한 필수 요구 사항과 같은 고려해야 할 중요한 포인트를 강조합니다. 명확한 실험을하기 전에 각 분리.

<table><tbody><tr><td>자당</td><td>췌장 Qu&iacute; mica SL, 바르셀로나, 스페인</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; 운모 SL, 바르셀로나, 스페인</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>췌장 Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>췌장 Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; 운모 SL, 바르셀로나, 스페인</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, 바르셀로나, 스페인</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes는 초원심분리로 인한 붕괴를 방지하기 위해 사용할 때 거의 완전히 채워져야 합니다.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, 다름슈타트, 독일</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, 바르셀로나, 스페인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 유리 파스퇴르 피펫 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>컴팩트 밸런스 EK-610</td><td>A& D, 도쿄, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피어스&트레이드; BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal 서쪽 피코 화학발광 기질</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USA GR 200 정밀 저울</td><td>A& D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Francisco Ciruela Laboratory에서 생산 및 검증 된 수제 항체 anti-GPR37.</td><td></td><td>0.250 &mu의 최종 농도에서 사용되는 1차 항체; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>1차 항체 희석 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP 접합 염소 항마우스 IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>2차 항체 희석 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-접합 염소 항토끼 IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>2차 항체 희석 1:30,000</td></tr></tbody></table>

뇌막 분획 화 :<em&gt; ex vivo</em&gt; subsynaptic protein localization 평가 방법

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

시냅스 단백질의 구성과 기능을 평가하는 것은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 그러나 동적 인 단백질 - 단백질 상호 작용과 인산화 반응에 의해 조절되기 때문에 시냅스에서 발생하는 신경 전달을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 따라서, 어떤 방법이 시냅스 전달을 연구하는데 사용될 때, 주요 목표는 이러한 일시적인 생리 학적 변형을 보존하는 것이다. 여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 즉, 프로토콜은 presynaptic, postsynaptic, 그리고 extrasynaptic 구획에서 단백질 농축을 수행하는 생화학 방법론을 설명합니다. 첫째, synaptosomes, 또는 시냅스 터미널, 불연속 자당 그라디언트를 통해 모든 시냅스 구획을 포함하는 뉴런에서 얻은 것입니다. 참고로,이 초기 시냅스 막 준비의 품질은 c의복. 결과적으로, 다른 subsynaptic 구획의 분리는 차별적 인 pH 조건에서 순한 세제를 사용하여 가벼운 solubilization과 달성됩니다. 이것은 그래디언트 및 등 원심 원심 분리에 의한 분리를 허용합니다. 마지막으로, 다른 subsynaptic 구획 ( 즉, 사전, 사후 및 extrasynaptic 막 분수)에서 단백질 농축은 잘 특성화 된 시냅스 단백질 마커 ( 즉, SNAP - 25, PSD - 95, 그리고 synaptophysin을 사용하여 immunoblot 분석의 수단으로 유효성 검사, 각각의 신경 세포 단백질의 시냅스 분포를 직접 평가할 수있다.

설명 된 방법론은 일반적으로 신경 단백질의 subsynaptic 분석과 일반적으로 시냅스 수용체 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분리 및 생화학 적 특성 결정에 사용되었습니다. 흥미롭게도, 여기에 표시된 대표 결과는 고아 G 단백질 - 결합 수용체 즉, 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 의 하위 시냅스 hippocampal 분포 분석을위한이 실험 절차의 유용성을 보여줍니다. GPR37은 엔도 텔린이나 관련 펩티드에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌지만 원래 엔도 텔린과 봄베 신 수용체에 대한 동족체 검색을 통해 확인되었다. 그 자리에서...

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스 뇌에서 서로 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 것입니다. 운동성 전달 성분의 분포를 기술하는 것은 정상 상태와 병리적 상태 모두에서 시냅스 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 여러 증거에 따르면 생체 내 시냅스는 매우 역동적이며, 시냅스 전달을 유지하면서 극적인 구조적 변화를 겪을 수 있습니다.시냅스는 전통적으로 전자 현미경을 통해 연구되어 왔습니다. 이 막 분획법은 서로 다른 pH 조건 하에서 온화한 계면활성제를 사용한 레이저 제거와 뒤이은 초단위 원심분리의 조합을 기반으로 합니다. 간단히 설명하면, 마우스의 뇌를 적출하고 쇄빙 위에 놓인 차가운 접시에서 해마를 조심스럽게 분리합니다.해마를 얼음처럼 차가운 분리 완충액이 들어 있는 Potter-Elvehjem 유리 튜브에 수집합니다. 그 후, 수집된 조직을 균질기 교반기를 사용하여 균질화합니다. 다음으로 균질화된 조직을 sucrose calcium 용액과 혼합합니다.그다음 조직 추출물 위에 고농도 자당 칼슘 용액을 층으로 쌓습니다. 이후 샘플을 원심 분리합니다. 시냅토솜을 포함하는 막 분획은 자당 용액의 계면에 떠 있는 조밀한 링 형태로 쉽게 확인할 수 있습니다.그 후, pH 차이 조건에서 약한 계면활성제를 이용한 가벼운 가용화 과정을 결합하여 시냅스 외, 시냅스 전 및 시냅스 후 분획으로 구분되는 서로 다른 하위 시냅스 구획의 분리를 수행합니다. 마지막으로, 각 구획의 단백질 농축 정도를 면역블롯 분석으로 검증합니다. 실험 당일에 신선한 용액을 조제하여 얼음 위에서 냉각하십시오.분쇄된 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 뇌를 두고, 10 milliliters의 차가운 분리 버퍼를 채웁니다. 핀셋을 사용하여 해마를 조심스럽게 절제합니다. 절제한 해마를 1 milliliters의 차가운 분리 버퍼가 들어 있는 5 milliliters Potter-Elvehjem 유리 튜브로 옮깁니다.그다음 균질기 교반기를 사용하여 균질화합니다. 균질화된 조직을 sucrose와 calcium 용액이 들어 있는 15 milliliters Falcon tube로 옮기고, 튜브를 천천히 뒤집어가며 혼합합니다. 이 용액을 초투명 원심분리 튜브에 넣고, 각 튜브 상단에 calcium chloride가 포함된 sucrose 2.5 milliliters를 추가합니다.그 다음, 격리 완충 용액으로 튜브를 보정하고 초원심분리기를 사용하여 4°C에서 100,000 G로 3시간 동안 원심분리합니다. 원심분리기 스틸 지지대에서 튜브를 조심스럽게 꺼내고, 시냅토솜이 포함된 sucrose 계면 내의 조밀한 링을 확인합니다. 블루 팁을 사용하여 상단의 부유층을 제거합니다.파스퇴르 피펫을 사용하여 시냅토솜 분획이 포함된 조밀한 링을 수집하여 울트라 클리어 원심분리관으로 옮기고 분쇄 얼음 위에 보관하십시오. 시냅토솜을 9배 부피의 차가운 분리 버퍼로 희석하고 4°C에서 15,000 G로 30분 동안 원심분리하십시오. 원심분리가 끝나면 튜브를 꺼내십시오.상층액을 제거합니다. 시냅토솜을 포함하는 펠렛이 보일 것입니다. 펠렛을 1.1 milliliters의 분리 버퍼로 재부유시킨 후 다음 단계를 위해 분쇄 얼음 위에 보관합니다.4°C에서 해당 pH로 조절하여 신선한 용액을 제조합니다. 얼음 위에 놓인 비커에서 지속적으로 교반하며, 재부유시킨 시냅토좀 펠릿 1 mL를 5 mL의 염화칼슘에 천천히 첨가합니다. 이어서 pH 6의 농축 가용화 버퍼 5 mL를 첨가합니다.얼음 위에서 50분간 방치한 후, 용액을 초투명 원심분리관으로 옮기고 4°C에서 40,000 G로 30분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브를 꺼냅니다. 시냅스 전 및 후 분획이 포함된 펠릿이 관찰되어야 합니다.시냅스 외 분획(extra synaptic fraction)이 포함된 상층액을 15 milliliters 농축 튜브에 수집합니다. 2 milliliters의 pH 6 가용화 버퍼(solubilization buffer)로 펠렛을 조심스럽게 세척합니다. 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 버퍼를 제거합니다.펠렛에 pH 8의 가용화 완충액 10 milliliters를 가하고, 파스퇴르 피펫을 사용하여 적정합니다. 비커를 얼음 위에 놓고 50분 동안 지속적으로 교반하며 배양합니다. 용액을 초투명 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 40,000 G로 30분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 튜브를 꺼냅니다. 시냅스 후 분획(post-synaptic fraction)을 포함하는 펠렛이 관찰되어야 합니다. 시냅스 전 분획(pre-synaptic fraction)이 포함된 상층액은 15 milliliters 농축 튜브에 수집합니다.시냅스 후 분획(post-synaptic fraction)이 포함된 펠렛을 200 µL의 STS 용액으로 재현탁합니다. 재현탁된 펠렛을 초음파 처리합니다. 단백질 정량 분석법을 통해 각 분획의 단백질 양을 측정합니다.각 분획에서 20 µg의 단백질을 취하여 STS Polyacrylamide Gel Electrophoresis 샘플 완충액으로 처리합니다. STS Polyacrylamide Gel Electrophoresis로 단백질을 분리하고 면역분석법(immunoblot)으로 분석합니다. GPR37은 주로 설치류 뇌에 존재하는 또 다른 G 단백질 결합 수용체 단백질입니다.파킨슨병이나 주요 우울증과 같은 다양한 병리 현상에 관여하며, 그 기능은 여전히 비정상적인 상태로 남아 있습니다. 시냅스에서 이 수용체의 존재를 연구하는 것은 중추신경계에서의 역할을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 야생형 및 GPR37 녹아웃 마우스로부터 시냅토솜을 분리한 후 분획하였습니다.각 시냅스 하부 구획의 순도는 각 시냅스 마커의 분리를 통해 확인되었습니다. 시냅스 외 소포 마커인 synaptophysin은 이 시냅스 외 분획에서 농축되었습니다. 전형적인 시냅스 후 밀도 마커인 BSD 95 단백질은 해당 시냅스 후 분획에서 농축되었습니다.마지막으로, 시냅스 전 활성 구역 마커인 SNAP 25의 존재를 통해 시냅스 전 분획의 순도를 검증하였습니다. 흥미롭게도 GPR 37 면역 반응성은 시냅스 외 분획에서 더 풍부하게 나타난 반면, 시냅스 전 분획보다 시냅스 후 분획에서 유의미하게 더 높은 선호도를 보였습니다. 시냅스 하단 단백질 조성을 평가하는 것은 신경과학 분야에서 중요한 과제입니다.하지만 이는 단백질-단백질 상호작용 리본에 의해 매우 엄격하게 조절되기 때문에 쉽지 않은 작업입니다. 이에 본 논문에서는 서로 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 선택하기 위한 견고한 절차인 뇌 막 분획 프로토콜을 제시합니다. 즉, 시냅스 전, 시냅스 후 및 시냅스 외 구획에서 단백질 농축을 수행하기 위한 화학적 기술에 대해 설명합니다.그럼 마칩니다. 분획 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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뇌막 분획 화 :

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