플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

이 절차의 전반적인 목표는 광유전학을 사용하여 신경 활동을 유도한 후 전자 현미경으로 막 역학을 캡처한 다음 자극 후 정의된 시점에서 세포를 동결하는 것입니다. 이 방법은 시냅스 소포 재활용 메커니즘에 대한 신경 과학 및 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 매우 빠른 시간 척도로 모델링할 수도 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 밀리초 시간 척도에서 전자 현미경을 사용하여 세포 내의 형태학적 변화를 시각화할 수 있다는 것입니다.

이 절차는 대학원생인 Shuo Li와 연구원인 Sumana Raychaudhuri가 시연할 예정입니다. 둘 다 내 연구실에서. 정착제를 준비하기 전에 두 개의 밀리리터 극저온 파일에 표본 번호에 따라 연필로 레이블을 지정합니다.

그런 다음 모든 정착제 시약을 결합하고 각 바이알에 1ml의 정착제를 분주합니다. 튜브를 덮은 후 즉시 고정제를 액체 질소에 담그고 바이알을 밀폐된 스티로폼 상자에 보관하십시오. 다음으로, 자동 유리 대체 장치와 고압 냉동고에 액체 질소를 채웁니다.

그런 다음 작은 아세톤 용기를 자유 치환 장치의 시편 챔버에 넣고 치환 장치의 온도가 섭씨 영하 90도에 도달할 때까지 기다립니다. 광 자극 프로토콜을 프로그래밍하려면 터치스크린 모니터의 광 자극 창에서 편집을 클릭합니다. 다른 창이 열립니다.

어두운 단계의 경우 15초를 입력합니다. 기간의 경우 100밀리초, 펄스의 경우 10밀리초, 단일 10밀리초 자극의 주기 수를 입력합니다.

메인 화면에서 Light stimulation(광 자극) 상자가 선택되어 있는지 확인하고 Specimen Storage(표본 저장)를 클릭한 다음 Edit(편집)를 클릭합니다. 새 창에서 더하기 또는 빼기 버튼을 사용하여 2개를 선택하여 각 채널에 두 개의 표본을 저장하고 저장 액체 질소 활성화가 선택되었는지 확인합니다. 이제 실체 현미경 아래에서 사파이어 디스크 셀 면이 위로 향하게 하여 중간 검은색 플레이트의 웰에 놓습니다.

그 다음에는 100미크론 스페이서 링이 있습니다. 빈 사파이어 디스크의 한쪽 면을 예열된 식염수에 담그고 식염수 면이 아래로 향하게 하여 디스크를 스페이서 링 위에 놓습니다. 또 다른 100미크론 스페이서 링을 배치합니다.

그리고 마지막 사파이어 디스크 위에 400미크론 스페이서 링을 끼우고 여과지를 사용하여 과도한 액체를 제거합니다. 샘플을 들고 있는 동안 사파이어 디스크 사이에 기포가 끼지 않도록 하십시오. 그런 다음 두 개의 투명한 하프 실린더 사이에 전체 어셈블리를 놓고 상단 빨간색 덮개를 닫아 동결 과정을 시작합니다.

동결 과정이 완료되면 빨간색 덮개가 자동으로 나타납니다. 모든 샘플이 얼면 보관 듀어의 문을 열고 듀어를 벤치탑으로 옮깁니다. 시료 챔버를 보관 듀어에서 액체 질소로 채워진 특수 시료 트레이로 옮깁니다.

그리고 손잡이를 풀어 표본 컵을 분리합니다. 그런 다음 액체 질소 냉각 팁이 있는 핀셋을 사용하여 시편 컵에서 투명한 반 실린더를 제거합니다. 그리고 가운데 검은색 플레이트를 액체 질소가 들어 있는 작은 컵에 조심스럽게 옮깁니다.

냉동 샘플을 항상 액체 질소 상태로 유지하고 항상 사전 냉각된 핀셋으로 샘플을 취급하도록 주의하십시오. 핀셋을 다시 예냉각하고 첫 번째 중간 플레이트를 예냉각된 아세톤으로 빠르게 옮깁니다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 두드려 플레이트에서 사파이어 디스크를 분리합니다.

그런 다음 고정액의 열린 극저온 파일을 치환 장치의 표본 챔버에 놓습니다. 사파이어 디스크를 바이알에 옮깁니다. 그리고 즉시 바이알의 뚜껑을 닫으십시오.

모든 샘플이 전송되면 적절한 자유 대체 프로그램 매개변수를 설정하고 프로그램을 시작합니다. 무료 대체 프로그램이 끝나면 장갑을 사용하여 극저온 파일을 검체 챔버에서 화학 후드로 옮기고 피펫을 사용하여 각 바이알에 실온 아세톤을 추가합니다. 각 바이알의 세척물을 1-2시간 동안 4-6회 새 아세톤으로 교체하십시오.

그런 다음 새로 준비한 30% 에폭시 수지를 각 바이알에 추가하여 120rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 30% 에폭시 수지를 70% 에폭시 수지로 교체하여 오비탈 쉐이커에서 3-4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 각 디스크를 세포면이 위로 향하게 하여 임베딩 캡슐의 캡으로 옮기고 디스크에 90% 에폭시 수지를 추가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 각 사파이어 디스크를 새 임베딩 캡슐의 캡으로 옮기고 갓 준비한 100% 에폭시 수지로 캡을 채웁니다. 마지막 100% 에폭시 수지 배양 후 섭씨 60도 오븐에서 48시간 동안 샘플을 중합합니다. 샘플이 중합되면 첫 번째 샘플을 실체 현미경에 거꾸로 올려 사파이어 디스크가 수지 블록의 상단에 위치하도록 하고 면도날을 사용하여 샘플 상단에서 얇은 수지 층을 제거합니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 디스크 가장자리를 따라 얕은 선을 잘라 사파이어 디스크와 에폭시 수지를 분리합니다. 그리고 디스크를 액체 질소에 약 10초 동안 담그어 디스크를 수지의 나머지 부분과 분리합니다. 해부 현미경으로 레진을 옮기고 샘플을 현미경 스테이지에 테이프로 붙입니다.

4-10X 배율을 사용하여 세포가 있는 영역을 찾고 양날 면도날을 사용하여 관심 영역 주위를 2 x 2mm 영역으로 자릅니다. 그런 다음 초강력 접착제를 사용하여 에폭시 수지로 만든 원통형 더미 블록에 세포를 장착하고 블록을 섭씨 60도에서 1시간 동안 배양합니다. 울트라 마이크로 북을 절편한 후 샘플을 투과 전자 현미경으로 옮겨 930, 000X 배율로 이미징합니다.

이 이미지에서는 쥐 해마 뉴런에서 시냅스전 막의 활성 영역 내에서 광 시작 후 15밀리초 후에 기록된 엑소사이토시스를 통한 시냅스 소포 융합이 표시됩니다.광 시작 후 100밀리초 후에 활성 영역에 인접한 세포내 구덩이를 관찰할 수 있으며, 이는 신경 세포에 의한 초고속 세포내이입(endocytosis)을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 플래시 및 동결 실험으로 샘플을 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

글루타르알데히드, 사산화오스뮴 및 액체 질소로 작업하는 것은 정말 위험할 수 있으므로 보호복을 착용해야 합니다. 일단 숙달되면 이 절차의 동결 부분은 12개의 샘플에 대해 몇 시간 안에 완료할 수 있지만 이미징 및 이미지 분석을 포함한 나머지 절차는 최대 며칠 또는 몇 주 또는 몇 달이 걸릴 수 있으므로 정말 긴 절차가 될 수 있습니다. 단백질을 국소화하거나 단백질의 역학을 시각화하는 경우, 다양한 프로토콜을 사용하여 진주빛 단백질의 항원 또는 진주 형성을 보존하고 이러한 기술을 사용하여 단백질의 역학을 시각화할 수도 있습니다.