세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 당화(glycosylation) 부위 식별 및 심혈관 조직에서 글라이칸 형태의 조성 특성화를 포함하여 세포외 기질 단백질 구성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환 중 구조적 기질 당화(glycostlation)가 조직 섬유증에 미치는 영향과 같은 조직 섬유화 과정에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전반적인 당화(glycosylation) 변화를 분석하는 이전 프로토콜과 달리 구조 매트릭스 단백질의 특정 부위에서 당화(glycosylation)를 특성화할 수 있어 보다 표적화된 후속 기계론적 연구를 위한 도구를 제공한다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Marika Fava 박사와 Ferheen Baig 씨가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 추출 버퍼를 준비합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 20-50mg의 조직을 약 2mm 크기의 3-4개의 작은 조각으로 깍둑썰기합니다.

깍둑썰기한 조직을 1.5ml 튜브에 넣고 얼음처럼 차가운 PBS 500마이크로리터를 추가합니다. 혈액 오염을 최소화하기 위해 한 번 씻을 때마다 500마이크로리터의 PBS를 사용하여 조직을 다섯 번 씻습니다. 세척된 샘플을 나사 캡이 있는 1.5ml 튜브로 옮기고 조직 무게의 10배에 해당하는 염화나트륨 완충액을 추가합니다.

실온에서 1시간 동안 최소 속도로 소용돌이. 그런 다음 추출물을 새 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 000회 G로 원심분리합니다. 생성된 조직 펠릿을 신선한 염화나트륨 완충액으로 간단히 세척합니다.

그 후, 조직 무게의 10배의 SDS 완충액을 추가하고 실온에서 16시간 동안 최소 속도로 와류를 추가합니다. 추출물을 새로운 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 000회 G로 원심분리기를 이동합니다. 생성 된 펠릿을 이중 증류수로 세척하십시오.

조직 무게의 5배인 구아니딘 염산염 완충액을 부피 첨가하고 실온에서 72시간 동안 최대 속도로 와동합니다. 생성된 추출물을 새 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 000회 G로 원심분리합니다. 단백질을 정량화한 후, 당화(glycosylation) 부위 점유를 평가하기 위해 각 샘플에 대해 10마이크로그램을 새 튜브에 분취하고, 직접 글리코펩타이드 분석을 위해 50마이크로그램을 별도의 튜브에 분취합니다.

각각에 에탄올 부피의 10배를 추가하고 섭씨 20도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 16, 000 시간 G에 표본을 4 섭씨 온도에 30 분 동안 원심 분리하십시오. 침전된 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 흡입합니다.

그런 다음 진공 농축기를 사용하여 펠릿을 실온에서 15분 동안 건조시킵니다. 준비된 탈당화 완충액 10마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 50ml 원뿔형 튜브 안에 샘플 튜브를 포장하고 섭씨 25도에서 2시간 동안 45도 각도로 배양합니다.

그 후 온도를 섭씨 37도로 높이고 부드러운 교반으로 36시간 동안 배양합니다. 16, 000 번 G에서 1 분 동안 원심 분리 한 후 실온에서 진공 농축기를 사용하여 45 분 동안 물을 증발시킵니다. 건조된 샘플을 밀리리터당 50단위를 함유한 O-18 라벨이 표시된 물 10마이크로리터로 재현탁시키고, PNGase F.지속적인 교반 하에서 섭씨 37도에서 36시간 동안 배양한 다음 모든 샘플에 대해 용액 내 트립신 분해를 수행하고 C-18 세척을 진행합니다.

시작하려면 C-200 스핀 플레이트의 각 웰에 18마이크로리터의 메탄올을 추가하여 수지를 활성화합니다. 1, 1 분 동안 000 번 G에서 원심 분리기. 그런 다음 물에 있는 80%ACN 및 0.1%TFA의 200 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 1 분 동안 1, 000배 G로 원심분리하십시오.

다음으로, 물에 있는 1%ACN 그리고 0.1%TFA를 포함하는 해결책의 200 마이크로리터를 각 우물에 추가하고, 1, 000배 G.Repeat 이 해결책 및 원심분리의 추가를 두번 1 분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 샘플을 스핀 플레이트의 웰에 넣고 1분 동안 1500배 G로 원심분리합니다. 흐름을 다시 로드하고 원심분리를 반복합니다.

그런 다음 물에 1%ACN과 0.1%TFA가 포함된 용액 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 1분 동안 1500배 G로 원심분리합니다. 이 용액을 첨가하고 원심분리를 두 번 반복합니다. 다음으로, 50%ACN과 0.1%TFA가 함유된 용액 170마이크로리터를 각 웰에 넣고 1분 동안 1500배 G로 원심분리합니다.

이 첨가와 원심분리를 한 번 더 반복합니다. 진공 농축기를 사용하여 결합된 용리액을 실온에서 2시간 동안 건조합니다. 건조된 샘플을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 80도에서 보관하십시오.

그런 다음 당사이트 점유 평가를 위한 샘플에 대해 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 분석을 수행합니다. 직접 글리코펩타이드 분석을 목적으로 하는 샘플의 경우, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 TMT zero 라벨링을 진행하십시오. 시작하려면 각 10마이크로리터의 TMT 제로 라벨링 샘플에 제공된 결합 완충액 50마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음, 50 마이크로 리터의 균질 글리코 포집 수지 현탁액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 분취하고 2500 회 G.에서 1 분 동안 원심 분리기를 제거합니다.상등액을 제거하고 60 마이크로 리터의 샘플과 결합 완충 용액을 피펫을 사용하여 수지 펠릿이 들어있는 튜브에 첨가하여 혼합합니다. 1200 RPM으로 교반하면서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 2, 000 시간 G에 2 분 동안 원심분리 후에 새로운 관으로 상등액을 옮깁니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 각 수지 튜브에 150마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 세척 과정을 시작합니다. 1200 RPM으로 교반하면서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 2500회 G에서 2분 동안 원심분리한 후 각 상층액을 해당 상층액 보관 튜브로 옮겨 세척을 완료합니다.

이 세탁 과정을 두 번 더 반복하십시오. 다음으로, 75마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 피펫과 혼합합니다. 1200 RPM으로 교반하는 동안 실온에서 5분 동안 배양합니다.

2500배 G에서 2분 동안 원심분리기를 하고 각 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 75마이크로리터의 용출 완충액을 첨가하여 혼합한 다음 샘플의 배양 및 원심분리를 반복합니다. 각 용리액을 해당 튜브로 옮깁니다.

결합된 용리액을 2500회 G로 2분 동안 원심분리한 후 각 상층액을 새 튜브로 옮겨 수지를 완전히 제거합니다. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 실온에서 2시간 동안 용리액을 건조합니다. 건조된 글리코펩타이드를 이중 증류수에 2%ACN 및 05%TFA 15마이크로리터에 재현탁합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분석 분석을 수행합니다. 이 연구에서는 심혈관 조직의 ECM 단백질을 ECM 조성의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 분석과 간접 및 직접 글리코펩타이드 분석을 위해 준비합니다. 핵심 전략은 염화나트륨, SDS 및 구아나딘 염산염을 사용한 순차적 배양 후 간접 또는 직접 글리코펩타이드 분석을 기반으로 합니다.

추출의 효율성은 시각화를 위해 은 염색이 된 bis-tris 아크릴아미드 겔에서 모니터링됩니다. 3가지 추출물 중 ECM 당단백질의 대부분은 구아나딘 염산염 분취량에서 볼 수 있습니다. ECM 당단백질은 짧고 다양한 N 및 O 결합 올리고당과 함께 크고 반복적인 글리코사민 글리칸 사슬로 장식되어 있습니다.

탈당화(deglycosylation)의 효율성은 글리코사민 글리칸을 소화하는 효소와 더 작은 N 및 O 결합 올리고당을 표적으로 하는 효소의 추가에서 볼 수 있습니다. 그런 다음 당단백질은 NXT 또는 NXS 염기서열 내에서 oxygen 18로 표지된 탈아미드화된 아스파라긴의 존재에 의해 식별됩니다. 위치 2 11에서 탈아미드화된 아스파라긴을 사용한 데코린의 펩타이드에 대한 대표적인 HCD 탠덤 질량 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다.

그런 다음 HCD ETD 단편화를 사용하여 당단백질이 풍부한 ECM 추출물을 분석합니다. ETD 탠덤 질량 스펙트럼을 통해 글라이칸 조성을 특성화할 수 있습니다. 이 기술을 마스터하면 약 2-3주가 소요됩니다.

이 당단백질체학(glycoproteomics)을 통해 섬유증의 생리학적, 병리학적, 단백질체학의 변화뿐만 아니라 생각 당의 구성에 대한 기능을 탐구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 질량 분석법에 의한 단백질 당화(glycosylation) 연구를 위해 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 호흡기 질환이나 암과 같은 대량 섬유증의 다른 병리학에도 적용할 수 있습니다.