세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 심혈관 조직에서 당화 부위의 식별과 글리칸 형태의 구성적 특성 분석을 포함하여 세포외 기질 단백질 조성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 구조적 기질의 당화가 심혈관 질환 중 조직 섬유화에 어떻게 영향을 미치는지와 같이 조직 섬유화 과정의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전체적인 당화 변화를 분석하는 이전 프로토콜과 달리, 구조적 기질 단백질의 특정 부위에서의 당화 특성 분석을 가능하게 하여 보다 표적화된 후속 기전 연구를 위한 도구를 제공한다는 점입니다.

실험 절차 시연은 본 연구실의 Dr. Marika Fava와 Ms. Ferheen Baig가 진행하겠습니다. 본 절차를 시작하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 추출 버퍼를 준비하십시오. 다음으로, 메스를 사용하여 20~50 mg의 조직을 약 2 mm 크기의 작은 조각 3~4개로 절단합니다.

다진 조직을 1.5 milliliter 튜브에 넣고 얼음처럼 차가운 PBS 500 microliters를 추가합니다. 혈액 오염을 최소화하기 위해 각 세척 단계마다 500 microliters의 PBS를 사용하여 조직을 5회 세척합니다. 세척된 샘플을 스크류 캡이 있는 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 조직 무게의 10배 부피에 해당하는 염화나트륨 완충액을 추가합니다.

실온에서 최소 속도로 1시간 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음, 추출물을 새 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 생성된 조직 펠릿을 신선한 염화나트륨 완충액으로 가볍게 세척합니다.

그 후, 조직 무게의 10배 부피에 해당하는 SDS 완충액을 첨가하고 상온에서 최저 속도로 16시간 동안 볼텍싱합니다. 추출물을 새 원심분리 튜브로 옮겨 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 생성된 펠렛을 2차 증류수로 세척합니다.

조직 무게의 5배 부피에 해당하는 guanidine hydrochloride 완충액을 첨가하고, 실온에서 72시간 동안 최대 속도로 vortexing합니다. 생성된 추출물을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 단백질 정량 후, 당쇄화 부위 점유율 평가를 위해 각 샘플당 10 µg을 새 튜브에 분주하고, 직접적인 glycopeptide 분석을 위해 50 µg을 별도의 튜브에 분주합니다.

각 시료에 10배 부피의 에탄올을 추가하고 20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 4 °C에서 16,000 ×g로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 침전된 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그 다음 진공 농축기를 사용하여 실온에서 15분 동안 펠릿을 건조합니다. 준비된 탈당쇄화 버퍼 10 µL를 각 시료에 첨가합니다. 시료 튜브를 50 mL 원뿔형 튜브 안에 넣고 25 °C에서 45도 각도로 2시간 동안 배양합니다.

그 후, 온도를 37 °C로 높이고 부드럽게 교반하며 36시간 동안 배양합니다. 16,000 ×g에서 1분간 원심분리한 후, 실온에서 진공 농축기를 사용하여 45분 동안 수분을 증발시킵니다. 건조된 시료를 50 U/mL PNGase F가 포함된 10 µL의 O-18 표지수에 재현탁합니다. 37 °C에서 지속적으로 교반하며 36시간 동안 배양한 다음, 모든 시료에 대해 용액 내 트립신 소화를 수행하고 C-18 정제 과정을 진행합니다.

먼저, 레진을 활성화하기 위해 C-18 스핀 플레이트의 각 웰에 200 µL의 methanol을 첨가합니다. 1,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 각 웰에 80% ACN 및 0.1% TFA-water 200 µL를 첨가하고 1,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 각 웰에 물에 1% ACN과 0.1% TFA가 포함된 용액 200 µL를 첨가하고, 1,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 이 용액의 첨가와 원심분리 과정을 두 번 더 반복합니다. 그 후, 샘플을 스핀 플레이트의 웰에 로딩하고 1,500 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 통과액을 다시 로딩하고 원심분리를 반복합니다.

그런 다음 각 웰에 1% ACN과 0.1% TFA가 포함된 수성 용액 200 µL를 첨가하고, 1500 ×g에서 1분간 원심분리합니다. 이 용액의 첨가와 원심분리 과정을 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 각 웰에 50% ACN과 0.1% TFA가 포함된 수성 용액 170 µL를 첨가하고 1500 ×g에서 1분간 원심분리합니다.

이 첨가 및 원심분리 과정을 한 번 더 반복합니다. 진공 농축기를 사용하여 혼합된 용리액을 상온에서 2시간 동안 건조합니다. 건조된 샘플은 사용 전까지 80 °C에서 보관하십시오.

이후, 글라이코사이트 점유도(glycosite occupancy) 평가 대상 샘플에 대해 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(liquid chromatography tandem mass spectrometry)을 수행합니다. 직접적인 글라이코펩타이드 분석 대상 샘플의 경우, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 TMT zero 라벨링을 진행하십시오. 우선 10 µL의 TMT zero 라벨링된 샘플 각각에 제공된 결합 버퍼(binding buffer) 50 µL를 첨가합니다.

그런 다음, 균질화된 glyco capture resin 현탁액 50 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 분주하고 2500 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 피펫을 사용하여 레진 펠릿이 포함된 튜브에 샘플 및 결합 버퍼 용액 60 µL를 넣어 혼합합니다. 1200 RPM으로 교반하며 실온에서 20분 동안 배양합니다. 2,000 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

그 후, 피펫을 사용하여 각 레진 튜브에 150 µL의 세척 버퍼를 첨가하고 혼합하여 세척 과정을 시작합니다. 1200 RPM으로 교반하며 상온에서 10분 동안 배양합니다. 2500 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 각 상층액을 해당 상층액 보관 튜브로 옮겨 세척을 완료합니다.

이 세척 과정을 두 번 더 반복하십시오. 다음으로, 75 µL의 용출 버퍼를 첨가하고 피펫으로 혼합합니다. 1200 RPM으로 교반하며 상온에서 5분 동안 배양하십시오.

2500 ×g에서 2분 동안 원심분리하고, 각 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 파이펫을 사용하여 75 µL의 용리 버퍼를 추가해 혼합한 다음, 샘플의 배양 및 원심분리 과정을 반복합니다. 각 용리액을 해당 튜브로 옮깁니다.

혼합된 용출액을 2500 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 레진이 완전히 제거되도록 각 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 진공 농축기를 사용하여 실온에서 2시간 동안 용출액을 건조합니다. 건조된 당펩타이드를 이중 증류수에 2% ACN 및 0.5% TFA가 포함된 용액 15 µL에 재용해합니다.

그 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분석을 수행합니다. 본 연구에서는 심혈관 조직의 ECM 단백질을 준비하여 ECM 조성에 대한 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석과 간접 및 직접 글라이코펩타이드 분석을 실시합니다. 핵심 전략은 염화나트륨, SDS 및 구아니딘 염산염으로 순차적으로 배양한 후 간접 또는 직접 글라이코펩타이드 분석을 진행하는 것입니다.

추출 효율은 시각화를 위해 silver staining을 처리한 bis-tris acrylamide 겔에서 모니터링합니다. 실행한 세 가지 추출물 중, 대부분의 ECM 당단백질은 guanadine hydrochloride 분획에서 관찰됩니다. ECM 당단백질은 짧고 다양한 N-결합 및 O-결합 올리고당과 함께 크고 반복적인 glycosamine 글리칸 사슬이 결합되어 있습니다.

탈당쇄화의 효율성은 글리코아미노성 글리칸을 분해하는 효소와 더 작은 N-결합 및 O-결합 올리고당을 표적으로 하는 효소를 추가함으로써 확인할 수 있습니다. 그 후, NXT 또는 NXS 서퀀 내에서 oxygen 18로 표지된 탈아미드화된 아스파라긴의 존재를 통해 당단백질을 식별합니다. 여기에는 2번 위치에 탈아미드화된 아스파라긴을 포함하는 데코린 펩타이드의 대표적인 HCD 탠덤 질량 분석 스펙트럼이 나타나 있습니다.

그 다음, 당단백질이 농축된 ECM 추출물을 분석하기 위해 HCD ETD 단편화를 사용합니다. ETD 탠덤 질량 분석 스펙트럼을 통해 당쇄 조성을 규명할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하는 데는 약 2~3주가 소요됩니다.

이 당단백질체학 분석을 통해 단백질체의 변화뿐만 아니라 당 구성의 변화를 바탕으로 섬유화 기능의 생리학적 및 병리학적 특성을 탐구할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 질량 분석법을 이용한 단백질 당화 연구를 위한 시료 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 호흡기 질환이나 암과 같이 섬유화가 발생하는 다른 병리 현상에도 적용될 수 있습니다.