Name: Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 현탁 세포 배양에서 근접 리게이션 분석(PLA)을 이용해 DNA 손상 유발 단백질 복합체를 검출하고 가시화하는 방법을. ATM과 p53 상호작용을 정량화하여 DNA 손상 응답 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.

1. 세포 및 DNA 손상 유도 처리 <ol><li> 20 % FCS, 50 μM β- 메르 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM에서 인간 BCR-ABL + B 세포 급성 림프 아교 성 세포주 BV173 또는 SUP-B15를 5 % CO2의 분위기에서 37 ℃. 5 ML / 잘 6 잘 접시에 2 X 10 6 세포 / ML에서 세포와 접시를 세고. 참고 : 선택적으로, 다양한 원산지의 서스펜션 세포주를 사용할 수 있습니다. </li><li> 세포주기의 G1 단계에서 BCR - ABL + B - ALL 세포를 체포하기 위해 5 μM의 imatinib methanesulfonate (STI571)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하십시오. <ol><li> 선택적으로, 세포주기 또는 BCR-ABL 음성 세포 유형에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구 할 때이 단계를 생략하십시오. </li></ol></li><li> 50 ng / ML neocarzinostatin (NCS)를 배양 물에 첨가하여 DNA 손상을 유도하고, 2 시간 동안 배양한다. <ol><li> 또는,0.5Gy / 분의 방사능 원을 사용하여 5Gy의 선량으로 세포를 조사함으로써 DNA 손상을 유도한다. 조사 후 5 % CO2의 분위기에서 37 ° C에서 2 시간 동안 세포를 회복 시키십시오. </li></ol></li><li> 선택적으로 DNA 손상에 대한 ATM 키나아제 활성의 관련성을 평가하려면 NCS 또는 방사선 치료를 추가하기 전에 5 μM의 ATM 키나아제 억제제 KU55933을 첨가하십시오. </li><li> 비이커 또는 삼각 플라스크에 1x PBS 50 mL에 분획 -V BSA 5 g을 겹쳐서 1 x PBS + 10 % BSA를 준비하고 BSA가 용해 될 때까지 RT에 놓습니다. 흔들 리거나 휘 저지 마십시오. 거품이 심하게 발생합니다. 0.22 μm 필터를 통해 천천히 여과하고 얼음 위에서 계속하십시오. </li><li> 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오. 1x PBS + 10 % BSA에서 2 x 10 6 / mL로 세포를 카운트하고 resuspend. 세포를 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 2. 세포 원심 분리, 고정 및 침투 <ol><li> 준비하기1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액. 용액이 깨끗해질 때까지 1x PBS 50 mL에 PFA 2 g을 넣고 55 ° C의 물을 가라 앉힌다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 여과하고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 참고 : 선택적으로 4 % PFA 고정액을 -20 ° C에서 냉동 보관할 수 있습니다. 냉동 후 사용하기 위해 한 번만 해동하십시오. 그렇지 않으면 PBS의 4 % PFA 용액을 직접 구입할 수 있습니다. </li><li> 보풀이없는 조직으로 76 mm x 26 mm 현미경 슬라이드를 조심스럽게 연마하고 5 분 동안 Coplin 병에 96 % 에탄올에 넣음으로써 탈지하십시오. 현미경 검사가 10 분 동안 공기 건조 슬라이드하자. </li><li> 6mm의 영역과 cytospin / cytology 퍼널에 현미경 슬라이드를 조립. 500 RPM에서 1 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 1x PBS + 10 % BSA 50 μL를 pipetting하여 슬라이드를 pre-coat하십시오. </li><li> 500 rpm에서 5 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 세포 현탁액 (0.2 x 10 6 세포와 동일) 100 μL를 추가합니다. 각 항체 조합의 경우,ast 4 준비가 필요합니다 (이중 항체 실험, 2 개의 단일 항체 대조군, 항체 대조군 없음). </li><li> 조심스럽게 깔때기를 분해하고 그 부분을 만지지 않도록주의하십시오. 샘플 고정 즉시 진행하십시오. <ol><li> 선택적으로 슬라이드를 30 분 이상 공기 건조시킵니다. 공기 건조 후 알루미늄 호일로 슬라이드를 개별적으로 감싸고 사용하기 전까지 -20 ° C에 보관하십시오. 냉동 제제를 사용할 때는 슬라이드에 과도한 응결이 생기지 않도록 종이 타월에 싸서 슬라이드를 녹여야합니다. </li></ol></li><li> PAP 펜 액 차단기 (팁 5 mm)를 사용하여 스폿 주위에 원 (대략 직경 15-20 mm)을 그립니다. </li><li> 각 지점에 4 % PFA 고정 솔루션의 50 μL를 추가하고 RT에서 30 분 동안 품어. </li><li> 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x PBS와 5 분 동안 세포를 3 번 ​​씻으십시오. </li><li> 보풀이없는 티슈로 얼룩 주위의 슬라이드를 건조시키고 파이를 사용하여 가능한 한 많은 양의 액체를 제거하십시오애완 동물을 그 자리에 닿지 않거나 슬라이드를 기울여서 닦으십시오. 각 지점에 1x PBS에 0.25 % 트리톤 X 50 μL를 추가하고 교반없이 RT에서 10 분 동안 품어 둡니다. </li><li> 부드럽게 교반하면서 실온에서 Coplin jar의 TBS (TBS-T) 중 0.05 % Tween-20 ~ 50-60 mL로 5 분 동안 3 번 슬라이드를 씻는다. 이 방식으로 10 개의 슬라이드를 동시에 처리 할 수 ​​있습니다. </li></ol> 3. 차단 및 일차 항체 인큐베이션 <ol><li> 보푸라기가없는 티슈로 TBS-T를 두드려 주변의 슬라이드를 말립니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오. 잠깐 블로킹 용액을 보텍스하고 한 방울 (~ 40 μL)을 각 지점에 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. </li><li> 사용하기 전에 상업용 항체 희석제, 와류 항체 희석제에 1 : 1,000의 염소 - 항 -ATM과 1 : 100의 토끼 항 - 포스 포 -Ser15-p53을 혼합하여 항체 칵테일을 준비한다. 대조군 실험자염소 - 항 -ATM 및 토끼 - 항 - 포스 포 - Ser15-p53 항체 (단일 항체 대조군)만을 함유하는 항체 희석액을 제조한다. </li><li> 차단 용액을 두 드리되 항체 희석액을 첨가하기 전에 세포가 건조하지 않도록주의하십시오. 각 항체 칵테일 희석액 30 μL를 첨가하고 밤새 가습 한 챔버에서 4 시간 동안 항온 배양하십시오. </li><li> 완충액 A와 완충액 B의 한 봉지의 내용물을 최종 용적이 각각 1,000mL 인 물에 용해시켜 원심 분리 완충액 A와 완충액 B를 준비한다. <ol><li> 또는 8.8 g의 NaCl, 1.2 g의 Tris-base 및 0.5 mL의 Tween-20을 800 mL의 물에 녹여서 완충액 A를 준비하십시오. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피 1,000 mL에 넣는다. </li><li> 또는 5.84 g의 NaCl, 4.24의 Tris-base 및 26.0 g의 Tris-HCl을 500 mL의 물에 녹여 세척 완충제 B를 준비한다. HCl을 사용하여 pH를 7.5로 조정한다. 1,000 mL의 최종 부피에 물을 넣으십시오. </li><li> 필터두 용액은 0.22 μm 필터를 통과했다. </li></ol></li><li> 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오. </li></ol> 4. PLA 프로브, 연결 및 증폭 <ol><li> 안티 - 염소 플러스와 안티 - 토끼 마이너스를 상업용 항체 희석액에서 1 : 5로 희석하여 PLA 프로브를 준비하십시오. 슬라이드에서 1x 현장 세척 버퍼 A를 떼어 내고 PLA 프로브 혼합물 30 μL를 각 지점에 첨가하십시오. 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 1 시간 동안 품어주십시오. 참고 : 적용된 기본 항체가 다른 종에서 자라는 한, 보조 항체 PLUS 및 MINUS PLA 프로브 (항 마우스, 항 토끼, 항 염소)의 모든 조합을 사용할 수 있으며 PLA 프로브의 조합은 항상 사용해야합니다 PLUS 프로브와 MINUS 프로브가 있습니다. </li><li> 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 ~ 50-60 mL 1x in situ 세척 완충액으로 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으시오. &lt;/ li&gt; <li> 라이 게이션 용액 39 μL에 리가 제 1 μL를 첨가하여 얼음 위에서 라이 게이션 - 리가 제 용액을 준비하고 각 리간드 - 라이 게이션 용액 40 μL를 첨가한다. 미리 데워진 가습 챔버에서 37 ° C로 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 온화한 교반과 RT에서 코 플린 항아리에 ~ 50-60 ML 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오. </li><li> Amplification 원액을 물에 1 : 5로 희석하여 얼음 위에서 증폭 - 중합 효소 혼합물을 준비한다. 그런 다음 각 지점마다 1x Amplification solution 39.5 μL에 0.5 μL의 polymerase를 첨가합니다. 참고 : 증폭 시약은 빛에 민감하므로 빛에 직접 노출되지 않도록 보호해야합니다. 증폭 시약은 4 가지 다른 색상 (RED : 여기 594 nm, 방출 624 nm, FarRED : 여기 644 nm, 방출 669 nm, ORANGE : 여기 554 nm, 방출 576 nm, 녹색 : 여기 501 nm, 방출 523 nm) 사용할 수있는 현미경 설정이uitable 여기 속성 및 이러한 색상을 이미지 필터. </li><li> 1x in situ 세척 완충액 A를 가볍게 두드려서 증폭 증폭 효소 중합 효소 혼합물 40 μL를 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 100 분 동안 품어 둡니다. </li></ol> 5. 장착 및 이미징 <ol><li> 물 99mL 에 1X 세척 버퍼 B 1mL를 추가하여 현장 세척 버퍼 B를 0.01x 준비합니다. </li><li> Amplification - Polymerase 혼합물을 꺼내 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 1x in situ 세척 완충액으로 10 분 동안 2 번 슬라이드를 씻는다. </li><li> 0.01x 세척 버퍼 B에서 1 ​​분 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 0.01x 초과 세척 버퍼 B를 두드리고 보풀이없는 조직으로 스폿 주변의 슬라이드를 건조시킵니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오. </li><li> DAPI가 포함 된 장착 매체를 DAPI가없는 장착 매체에 1 : 5로 희석하여 핵의 과도한 염색을 피하십시오. </li><li> 25 - 30 μL의 1 : 5 DAPI 함유 장착 매체를 24 mm x 24 mm coverslip에 추가하고 슬라이드와 함께 커버 슬립을 집어 올리십시오. 약간의 압력을 가해 공기 방울이 없음을 확인하십시오. 매니큐어로 coverslip을 봉쇄하고 이미징하기 전에 적어도 15 분을 기다립니다. </li><li> (공 촛점) 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. <ol><li> 적어도 4 개의 취득 이미지 필드 (20x 객관적, 조건 또는 항체 조합 당 20 세포를 계산, 처리 세포에서 7 ± 5 신호의 예상 평균을 사용하여 전력 계산을 기반으로 세포 당 punctate PLA 신호의 수를 세고, 이전에보고 된 바와 같이, 유형 I 오차가 0.05, 확률이 80 % 인 확률로 치료되지 않은 세포에서 2 ± 2 개의 신호가 발생했다. 참고 : 최상의 해결 방법은 소프트웨어 패키지 ( 예 : ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS))를 사용하여 Z- 스택 및 디콘 볼 루션을 얻는 것입니다. 신호DAPI 염색에 의해 정의 된대로 핵 경계 내에서 쉽게 식별 할 수 있어야한다. </li><li> 핵 외부에 명확하게 나타나는 신호는 세지 마십시오. 전형적으로, NCS 처리 또는 γ- 조사는 세포 당 약 5-10 개의 phosho-p53 / ATM PLA 신호를 초래한다. &#39;단일 항체&#39;컨트롤은 배경 시그널을 제공 할 수 있지만, 이것은 매 20 개의 세포 중 1 개당 1-2 개의 PLA 신호를 초과해서는 안됩니다. </li><li> 출판 및 프리젠 테이션 목적으로 40X 또는 63X 침지 오일 대물 렌즈를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. 슬라이드는 4 ° C에서 보관할 수 있으며 빛에 노출되지 않도록 보호해야합니다. </li></ol></li></ol>

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이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 인산화 된 p53과 상호 작용하는 것으로 나타났다. 이전에 PLA 기술은 ATM과 FOXO1 전사 인자가 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 상호 작용한다는 것을 보여주기 위해 사용되었지만,이 상호 작용은 FOXO1의 ATM 의존성 인산화를 초래하지 않을 가능성이 높습니다. PLA 데이터를 뒷받침하기 위해, 내인성 ATM / ATR- 인산화 단백질의 면역 침전에 의해, 확립 된 ATM 기질 p53 및 NBS1과 대조적으로, FOXO1은 D의 유도시 ATM에 의해 인산화 되지 않는다는 것이 확인되었다N...

DNA 손상은 단백질 - 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포<html> 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous end-joining (NHEJ) repair pathway가 우세하다. DNA 손상 후 가장 초기의 사건 중 하나는 DNA 손상 감지 키나제 인 Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM)의 활성화로 세포주기의 G1- 및 G2 / M- 상에 주로 활성화되고 NHEJ를 조절하며, 및 Ataxia Telangiectasia 및 Rad3 관련 단백질 (ATR) (HR 활성화에 의해 S 상으로 작용 함). ATM과 ATR은 모두 DNA 복구, 세포 사멸 및 생존과 관련된 많은 단백질을 인산화시키는 매우 pleiotropic kinases입니다. 두 키나아제 모두 유전 독성 스트레스에 노출 된 후 종양 억제 단백질 p53을 인산화시키고 활성화시키는 것으로 나타 났는데, 이는 이들 키나아제가 중추적 인 종양 억제 시그널링 축의 상류 중재자임을 나타낸다&quot;xref&quot;&gt; 5 , 6 . IRIF의 형성과 구성은 전형적으로 이중 색 면역 형광 염색법과 현미경 검사법을 사용하여 여러 단백질의 공존을 결정함으로써 평가되지만 수리 단백질 복합체의 일부인 모든 단백질이 IRIF를 형성하는 것은 아니며이 접근법의 적용 가능성을 제한합니다. 또한, (공 초점) 면역 형광 현미경 검사는 빛의 회절 특성에 의해 제한되어 약 200-300 nm의 공간 분해능을 나타내며, 대부분의 세포 하부 구조의 크기를 초과하며, 단백질 - 단백질 상호 작용의 직접적인 조사를 기본적으로 금지합니다 분자 수준. 이와 같이, (공 초점) 형광 현미경에 의해 검출 된 면역 형광 염색 패턴의 공동 위치 화는 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내는 것은 아닙니다. 최근에, 3 차원 구조와 같은 새로운 초 - 해상도 기술이 개발되었다공 초점 레이저 스캐닝 현미경으로 검출 할 수 없었던 이들 단백질의 공간 분포 특성을 밝혀내는, 나노 스케일의 53BP1 및 BRCA1 IRIF 형성을 성공적으로 연구하는데 사용 된 tured illumination microscopy (3D-SIM) 7 . 공동 면역 침전법, 풀다운 방법 및 효모 2 하이브리드 스크리닝 방법과 같은 생체 내에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 데 몇 가지 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 다소 번거롭고 다량의 세포 또는 단백질을 필요로하거나 단백질의 과발현을 포함하여 실험적 인공물을 유발합니다. 보다 최근에는 Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 이라고 불리는 인 - 시튜 ( 즉 , 세포와 조직에서)의 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 새로운 기술이 개발되었습니다. Pr관심있는 두 단백질을인지하는 imary 항체는 올리고 뉴클레오티드 (이른바 PLA 프로브)에 접합 된 2 차 항체에 의해 검출된다. 2 개의 상이한 2 차 항체가 1 차 항체에 의해 인식되는 단백질 사이의 상호 작용으로 인해 충분히 가깝다면, 접합 된 올리고 뉴클레오티드는 하이브리드 화되고 폐쇄 된 원형 DNA 기질을 형성하도록 연결될 수있다. 이 순환 기질은 롤링 서클 증폭에 의해 증폭되고, 형광색 - 결합 된 상보적인 올리고 뉴클레오타이드로 가시화된다. PLA를 사용하면, 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 위치는 형광 라벨 된 롤링 서클 증폭 - 제품이 PLA 프로브에 부착 된 상태로 보존된다. 이 분석법의 분해능은 항체의 직경이 약 7-10 nm 인 것으로 밝혀지면 &lt;50 nm입니다. 롤링 서클 증폭은 두 쌍의 항체 (primary + secondary)는 크기 (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm)로 정의 된 경계 내에서 물리적으로 상호 작용합니다. 신호 증폭 단계는 PLA 분석의 감도를 증가시키고 거의 발현되지 않은 단백질의 상호 작용을 검출 할 수있게합니다. PLA는 세포 간 기초 (per cell basis)로 정량화 할 수있는 뾰족한, 초점과 같은 신호 패턴을 생성함으로써 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 및 세포 간 변이를 평가할 수있다. DNA 복구 복합체 및 IRIF의 형성 및 조성은 인간 골육종 육종 상피 세포주 U2OS, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 및 망막 색소 상피 세포주 RPE-1과 같은 접착 성 세포주에서 주로 연구된다. 성장하고 transfect하기 쉽습니다. 서스펜션 세포 배양은 림프 성 및 골수성 세포주와 같이 덜 사용되는데, 이들은 트랜스 팩션에 덜 민감하고 일반적으로 커버 슬립을 준수하지 않으므로 추가 / 대체 스트레스가 필요하다.이미징을위한 eps. 그러나 DNA 손상 반응은이 종양의 게놈 (운전자) 수차에 의해 자주 영향을 받기 때문에 림프계 및 골수 악성 종양의 맥락에서 매우 관련이 있으며 정상 림프구 및 골수이의 악성 형질 전환에 중추적 인 역할을한다 ( 전구 세포 (12 , 13 , 14) . 이 프로토콜은 정지 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하고 정량화하기 위해 PLA를 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 여기에서, PLA는 G1 상 세포주기 정지를 겪도록 유도 된 인간 B 세포 백혈병 세포에서 DNA 손상시 ATM과 p53 간의 상호 작용을 결정하고 시각화하기 위해 수행된다. 참고로 여기에 제시된 프로토콜은 G1 구속 백혈병 세포에서 ATM 및 p53 상호 작용을 연구하는 것에 국한되지 않고 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수도 있습니다다양한 세포 유형 및 현탁 세포 배양 물에 사용된다.

<table><tbody><tr><td>BV173 세포주</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL 세포주</td></tr><tr><td>SUP-B15 세포주</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL 세포주</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib methanesulfonate</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>DMSO에 용해, 10mM 재고 용액 준비</td></tr><tr><td>neocarzinostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>돌연변이 유발/기형 유발, 주의해서 다루</td></tr>기 <tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>DMSO에 용해, 5mM 원액 준비</td></tr><tr><td>Starfrost 현미경 슬라이드</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜 액체 차단제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 깔때기</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red 스타터 키트 염소/토끼</td><td>시그마 Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>다양한 종/조합에 사용 가능하며, FarRED, Orange 및 Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA 등급에서도 사용 가능; 우리는 우리의 연구에서 lot#A300-136A-1을 성공적으로 사용했습니다</td></tr>. <tr><td>Rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td> 우리는 DAPI Vector Labs<td></td></tr><tr><td>와 함께 Vectashield 안티페이딩 마운팅 매체</td><td></td>를 연구에서 성공적으로 사용했습니다.<td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 페이드 방지 장착 매체</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>다른 다양한 공급업체에서도 사용 가능</td></tr></tbody></table>

proximity ligation assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 dna 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다. In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.

잔류 Ser15에서의 p53의 인산화는 ATM 키나제 활성에 의존하는 것으로 나타났다. 부유 세포 배양 물의 cytospin 조제에 대한 PLA 기술의 특이성을 증명하고 확인하기 위해, 세포주기의 G1- 단계에서 정지 된 BCR-ABL + B-ALL 세포의 2 시간 NCS 처리에 의한 DNA 손상 유도가 나타났다 예상대로 ATM과 phospho-Ser15-p53 사이의 특이 적 상호 작용을 일으켰다. Punctate PLA 신호는 NCS ( 도 1B )로 처리 된 세포의 대다수의 핵에서 관찰되었고, NCS로 처리하지 않은 세포에서는 신호가 검출되지 않았지만 ( 도 1A ), 세포 당 평균 7 PLA 신호가 관찰되었다 . DNA 손상 유도 전에 특정 ATM 키나아제 억제제 인 KU55933으로 세포를 전처리하면 PLA 신호의 수를 평균적으로 감소시켰다2 개의 PLA...

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

본 근접 결찰 분석(proximity ligation assay) 실험의 전반적인 목표는 부유 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 형성되는 DNA 손상 반응 및 복구 단백질 복합체를 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 시공간적 조직화 및 조절, 그리고 다양한 복구 경로가 서로 다른 유형의 DNA 손상에 어떻게 반응하는지와 같은 DNA 손상 복구의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고, 필요한 세포 수가 적으며, 단백질-단백질 상호작용을 방해하거나 변경할 수 있는 광범위한 처리 과정이 필요하지 않다는 점입니다.이 방법은 부유 배양 세포 내의 DNA 복구 및 단백질 복합체 형성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 부착 배양 세포, 동결 또는 파라핀 임베딩 조직, 그리고 전신 동물 모델에도 적용할 수 있습니다. 본 연구에서는 인간 BCR-ABL 양성 B세포 급성 림프구성 백혈병 세포주인 BV-173을 사용하였으며, 보충제가 첨가된 IMDM 배지에서 37 °C, 5% CO2 환경으로 배양하였습니다. 6-웰 플레이트에 웰당 5 mL씩, 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 세포를 분주합니다.세포 주기의 G1기에 세포를 정지시키려면, 각 웰에 5 µM의 ammonium methanesulfonate를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 분위기의 배양기에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 두 개의 웰에 각각 5 µM의 ATM 억제제를 첨가하고 플레이트를 다시 배양기에 넣어 30분 동안 유지하십시오. 그 다음, ATM 억제제로 전처리한 웰 하나와 전처리하지 않은 다른 웰 하나에 50 ng/mL의 NCS를 첨가하여 DNA 손상을 유도하십시오.2시간 동안 배양합니다. 비커에 1XPBS 50 milliliters를 넣고 그 위에 fraction-5 BSA 5g을 얹어 1XPBS plus 10%BSA를 준비하며, BSA가 완전히 용해될 때까지 흔들거나 젓지 않고 실온에 둡니다. PBS plus 10%BSA 용액을 0.22 micrometer 필터로 천천히 여과하여 얼음에 보관합니다.각 웰의 내용물을 15 milliliter 튜브로 옮겨 세포를 수확합니다. 얼음처럼 차가운 1XBPS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 수를 센 후, 1XBPS에 10%BSA를 추가한 용액에서 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 재부유시킵니다.세포를 얼음 위에 유지하십시오. 보풀 없는 티슈로 세심하게 닦고, 96% ethanol이 담긴 Coplin jar에 5분 동안 넣어 탈지함으로써 본 절차에 사용할 현미경 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 10분 동안 공기 중에서 건조시키십시오.6 mL 용량의 사이토스핀 세포학 깔때기에 현미경 슬라이드를 조립합니다. 각 깔때기에 1XPBS와 10%BSA 혼합액 50 µL를 피펫팅하여 슬라이드를 사전 코팅한 후, 500 RPM에서 1분간 원심분리합니다. 각 깔때기에 세포 현탁액 100 µL를 첨가하고 500 RPM에서 5분간 원심분리합니다.깔때기를 조심스럽게 분해하고 슬라이드의 스팟 부분을 만지지 않도록 주의하십시오. 5mm 팁이 달린 Pap pen 액체 차단제를 사용하여 각 스팟 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 각 스팟에 4% PFA 고정액 50 µL를 첨가합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, Coplin jar에 담긴 1XPBS를 사용하여 실온에서 부드럽게 흔들어 세포를 세척합니다. 이런 방식으로 5분씩 총 3회 세척합니다.보풀 없는 티슈로 스팟 주변의 슬라이드를 건조시키고, 슬라이드를 기울인 후 보풀 없는 티슈로 닦아내어 스팟에서 액체를 최대한 제거합니다. 각 스팟에 1XPBS에 희석된 0.25% Triton X 50마이크로리터를 첨가하고, 교반 없이 상온에서 10분 동안 배양합니다. Coplin jar에 담긴 50~60밀리리터의 TBS-T로 상온에서 가볍게 흔들어 슬라이드를 세척합니다.5분씩 세 번 반복합니다. 블로킹 전에 TBS-T를 털어내고 보풀 없는 티슈로 스폿 주변의 슬라이드를 건조시킵니다. 스폿에서 액체를 최대한 제거하십시오.블로킹 용액을 가볍게 볼텍싱한 후, 각 스팟에 약 40 µL씩 한 방울씩 첨가합니다. 슬라이드를 미리 데워진 가습 챔버에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 항체 칵테일을 준비합니다.볼텍싱 후 각 마이크로 튜브에 시판 항체 희석액을 피펫으로 분주합니다. goat anti ATM 항체를 1:1000 비율로 첨가합니다. 그리고 rabbit anti-phosphoserine-15 p53 항체를 1:100 비율로 첨가합니다.단일 항체 대조군 실험을 위해 염소 anti-ATM 항체만 포함된 항체 희석액과 토끼 anti-phosphoserine-15 p53 항체만 포함된 항체 희석액을 각각 준비합니다. 1시간의 배양 단계가 끝나면 블로킹 용액을 털어내되, 세포가 건조해지지 않도록 주의합니다. 각 항체 칵테일 희석액 30 µL를 첨가하고 습윤 챔버에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 실온에서 Coplin jar에 1X NC2 wash buffer A를 채우고 슬라이드를 부드럽게 흔들어 5분씩 2회 세척합니다. wash buffer A로 슬라이드를 2회 세척한 후, 슬라이드에서 세척 버퍼를 털어내고 각 스팟에 proximity ligation assay 프로브 혼합물 30 µL를 첨가합니다. 미리 데워진 가습 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다.실온에서 완만하게 흔들어주며 코플린 자(Coplin jar)에 담긴 50 내지 60 mL의 세척 완충액 A로 슬라이드를 세척합니다. 다음으로, 각 스팟당 39 µL의 결찰 용액에 리가제(ligase) 1 µL를 첨가하여 얼음 위에서 결찰 리가제 용액을 준비합니다. 각 스팟에 결찰 리가제 용액 40 µL를 첨가합니다.미리 가온된 가습 챔버에서 37 °C로 30분 동안 배양하십시오. 실온의 Coplin jar에서 세척 버퍼 A를 사용하여 슬라이드를 부드럽게 흔들어 세척하십시오. 증폭 폴리머라제 혼합물을 얼음 위에서 준비하십시오.먼저 증폭 스톡 용액을 증류수로 1:5 비율로 희석하십시오. 그리고 각 스팟당 1X 증폭 용액 39.5 µL에 폴리머라제 0.5 µL를 첨가합니다. 세척 버퍼를 털어내고 각 스팟당 40 µL의 증폭 폴리머라제 혼합물을 첨가하십시오.미리 가온된 습윤 챔버에서 37 °C로 100분 동안 배양합니다. 100분 배양이 완료되면 증폭 폴리머라제 혼합액을 제거하고, Coplin jar를 사용하여 슬라이드를 1X NC2 wash buffer B로 세척합니다. 실온에서 부드럽게 흔들어주며 10분씩 2회 세척합니다.그 후, 슬라이드를 0.01x 세척 버퍼 B로 1분 동안 세척합니다. 과량의 세척 버퍼 B를 쳐서 제거하고, 보풀 없는 티슈로 스팟 주변의 슬라이드를 건조시킵니다. 스팟에 남아 있는 액체를 가능한 한 많이 제거합니다.DAPI 함유 봉입액을 DAPI가 없는 봉입액으로 1:5 비율로 희석하여 핵이 과염색되지 않도록 DAPI 함유 봉입액을 준비합니다. 희석된 DAPI 함유 봉입액 25~30마이크로리터를 24mm x 24mm 커버슬립에 첨가합니다. 슬라이드가 부착된 커버슬립을 들어 올려 가볍게 압력을 가함으로써 기포가 갇히지 않도록 합니다.커버슬립을 매니큐어로 밀봉하고 이미징 전 최소 15분 동안 기다립니다. 마지막으로, 공초점 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미징하고 분석합니다. G1기에 정지된 BV 173 인간 BCR-abl 양성 세포에서 ATM과 phosphoserine 15 p53 사이의 상호작용을 조사하기 위해 근접 결찰 분석법(proximity ligation assay)을 사용하였습니다.DNA 손상을 유도하기 위해 NCS를 처리하지 않은 세포와 대조적으로, NCS를 처리한 대부분의 세포는 핵 내에서만 점상 신호가 나타났으며 세포당 평균 7개의 신호가 관찰되었습니다. 이는 DNA 손상 유도가 ATM과 phosphoserine 15 p53 간의 상호작용을 초래한다는 것을 나타냅니다. DNA 손상을 유도하기 전 세포에 특정 ATM 키나아제 억제제를 전처리하면 신호 수가 세포당 평균 2개로 감소하며, 이를 통해 serine 15 잔기에서 p53의 인산화가 ATM 키나아제 활성에 의존적임을 확인할 수 있었습니다.anti-ATM 또는 anti-phosphoserine 15 p53 항체 중 하나만 방출시킨 단일 항체 대조군 실험에서는 예상대로 아무런 신호가 검출되지 않았습니다. 이 그림은 부유 세포 배양물의 사이토스핀(cytospin) 표본에 대해 근접 결찰 분석(proximity ligation assay) 기술의 특이성을 입증하고 확인하는 결과의 정량화 및 통계 분석을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 1차 항체와 하룻밤 동안 배양한 후 약 5시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 수행하기 전에 관심 세포의 면역형광 염색을 통해 항체 역가를 주의 깊게 적정하는 것이 중요합니다. 이 기술은 개발 이후, 면역침강법이나 기술적 아티팩트가 자주 발생하는 FRET 기반 이미징과 같은 표준 방법으로는 평가하기 어려운 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 세포 생물학 연구자들이 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 부유 세포 배양물에서 근접 결찰 분석을 수행하여 단백질-단백질 상호작용을 in situ에서 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

배우세요 현탁 세포 배양에서 근접 리게이션 분석(PLA)을 이용해 DNA 손상 유발 단백질 복합체를 검출하고 가시화하는 방법을. ATM과 p53 상호작용을 정량화하여 DNA 손상 응답 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

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