Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

이 근접 결찰 분석 실험의 전반적인 목표는 현탁 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 DNA 손상 반응 형성 및 복구 단백질 복합체의 형성을 시각화 및 정량화하는 것입니다. 이 방법은 공간적, 시간적 조직 및 조절, 다양한 복구 경로가 다양한 유형의 DNA 손상에 어떻게 반응하는지와 같은 DNA 손상 복구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고, 세포 수가 적으며, 단백질-단백질 상호 작용을 방해하거나 변경할 수 있는 광범위한 처리가 필요하지 않다는 것입니다.

이 방법은 DNA 복구, 배양 현탁 세포의 단백질 복합체 형성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 배양된 부착 세포, 동결 또는 파라핀 내장 조직, 심지어 전체 동물에도 적용할 수 있습니다. 인간 BCR 양성 b세포 급성 림프구 세포주인 BV-173은 본 연구에서 사용되며 5%CO2 분위기에서 섭씨 37도의 보충제와 함께 IMDM에서 배양됩니다.웰당 5밀리리터의 6웰 플레이트에서 밀리리터당 10의 2배에서 6배로 세포를 플레이트화합니다.

세포주기의 G1 단계에서 세포를 정지시키기 위해 각 웰에 5 마이크로 몰의 암모늄 메탄 설포 네이트를 추가하고 5 % CO2의 분위기에서 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 2개의 웰 각각에 ATM 억제제 5마이크로몰을 추가하고 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음으로, ATM 억제제로 전처리된 웰 중 하나와 전처리되지 않은 다른 웰에 NCS 밀리리터당 50나노그램을 첨가하여 DNA 손상을 유도합니다.

2시간 동안 배양합니다. 비이커에 1XPBS 50밀리리터 위에 5g의 fraction-5 BSA를 겹겹이 쌓아 1XPBS와 10%BSA를 준비하고 BSA가 용해될 때까지 흔들거나 젓지 않고 실온에 둡니다. 천천히 0.22 마이크로 미터 필터를 통해 PBS와 10 % BSA 용액을 필터링하고 얼음에 보관하십시오.

세포를 수확하여 각 웰의 내용물을 15ml 튜브로 전달합니다. 얼음처럼 차가운 1XBPS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 계수한 후 1XBPS에 10%BSA를 더한 10배에서 6번째 세포를 2배로 재현탁합니다.

세포를 얼음 위에 두십시오. 보푸라기가 없는 티슈로 조심스럽게 연마하고 Coplin 용기에 96% 에탄올을 5분 동안 넣어 탈지하여 이 절차를 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 10분 동안 자연 건조시킵니다.

현미경 슬라이드를 6ml 면적의 cytospin cytology 깔때기에 조립합니다. 50마이크로리터의 1XPBS와 10%BSA를 각 깔때기와 원심분리기에 500RPM으로 1분 동안 피펫팅하여 슬라이드를 사전 코팅합니다. 각 깔때기에 100마이크로리터의 세포 현탁액과 500RPM에서 5분 동안 원심분리를 추가합니다.

깔때기를 조심스럽게 분해하고 슬라이드의 부분을 만지지 않도록 하십시오. 끝이 5mm인 Pap 펜 리퀴드 블록제를 사용하여 각 지점 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 각 지점에 50마이크로리터의 4%PFA 고정 용액을 추가합니다.

그리고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 1XPBS로 세포를 실온의 Coplin 용기에 넣고 부드럽게 저어 세척합니다. 매번 5분씩 이런 식으로 세 번 씻습니다.

보푸라기가 없는 티슈로 반점 주위의 슬라이드를 말리고 슬라이드를 기울여 보푸라기가 없는 티슈로 건조시켜 반점에서 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 각 지점에 1XPBS의 0.25%Triton X 50마이크로리터를 첨가하고 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양합니다. 50-60ml의 TBS-T를 넣고 실온의 Coplin 용기에 넣고 부드럽게 저어주면서 슬라이드를 세척합니다.

매번 5분씩 3회. 차단하기 전에 TBS-T를 탭하고 보푸라기가 없는 티슈로 해당 부위 주위의 슬라이드를 말리십시오. 그 자리에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.

차단 용액을 간단히 와류로 만든 다음 각 지점에 약 40 마이크로 리터를 한 방울 떨어 뜨립니다. 슬라이드를 예열된 가습실에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 항체 칵테일을 준비합니다.

Vortex를 주입한 다음 상용 항체를 각 microfuge tube에 희석액으로 피펫화합니다. 1:1000에 염소 ATM 항체를 추가합니다. 그리고 토끼는 1:100에 항-포스포세린-15 p53 항체

단일 항체 대조군 실험의 경우, 염소 항-ATM 항체와 토끼 항-포스포세린-15 p53 항체만 포함하는 항체 희석액을 준비합니다. 1시간 배양이 완료되면 차단 용액을 두드리되 세포가 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 항체 칵테일 희석액 30마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도의 가습 챔버에서 밤새 배양합니다.

다음 날, 실온의 Coplin 용기에 1X NC2 세척 버퍼 A를 넣고 매번 5분씩 2회 부드럽게 교반하여 슬라이드를 세척합니다. 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척한 후 슬라이드에서 세척 버퍼를 두드리고 각 지점에 30마이크로리터의 근접 결찰 분석 프로브 혼합물을 추가합니다. 섭씨 37도의 예열된 가습실에서 1시간 동안 배양합니다.

50-60ml의 세척 버퍼 A를 Coplin 용기에 넣고 실온에서 부드럽게 저어주면서 슬라이드를 세척합니다. 다음으로, 각 지점에 대해 39마이크로리터의 결찰 용액에 1마이크로리터의 리가제를 첨가하여 얼음 위에 결찰 리가제 용액을 준비합니다. 각 지점에 40마이크로리터의 ligation ligase 용액을 추가합니다.

섭씨 37도의 예열된 가습실에서 30분 동안 배양합니다. 세척 버퍼 A가 있는 슬라이드를 Coplin 용기에 넣고 실온에서 부드럽게 저어주면서 세척합니다. 얼음 위에 증폭 중합효소 혼합물을 준비합니다.

먼저 증폭 원액을 1-5 정도로 물에 희석합니다. 그리고 각 지점에 대해 39.5마이크로리터의 1X 증폭 용액에 0.5마이크로리터의 중합효소를 추가합니다. 세척 버퍼를 두드리고 스폿당 40마이크로리터의 증폭 중합효소 혼합물을 추가합니다.

섭씨 37도의 예열된 가습실에서 100분 동안 배양합니다. 100분 배양이 완료되면 증폭 중합효소 혼합물을 탭오프하고 Coplin 용기에 담긴 1X NC2 세척 버퍼 B로 슬라이드를 세척합니다. 실온에서 10분씩 2회씩 부드럽게 저어줍니다.

그 후, 0.01x 세척 버퍼 B로 슬라이드를 1분 동안 세척합니다. 여분의 세탁 버퍼(Wash) 버퍼(B)를 두드리고 보푸라기가 없는 티슈로 해당 부위 주위의 슬라이드를 말리십시오. 그 자리에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.

DAPI가 없는 장착 매체에서 장착 매체를 1:5로 포함하는 DAPI를 희석하여 핵을 과도하게 염색하지 않는 장착 매체를 포함하는 DAPI를 준비합니다. 장착 매체가 포함된 희석된 DAPI 25-30마이크로리터를 24mm x 24mm 커버 슬립에 추가합니다. 슬라이드로 커버 슬립을 잡고 약간의 압력을 가하여 기포가 갇히지 않도록 합니다.

매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 이미징하기 전에 최소 15분을 기다립니다. 마지막으로 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화하고 분석합니다. 근접 결찰 분석은 G1 단계에서 체포된 BV 173 인간 BCR-가능 양성 세포에서 ATM과 포스포세린 15 p53 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다.

DNA 손상을 유도하기 위해 NCS를 처리하지 않은 세포와 대조적으로, NCS를 처리한 대부분의 세포는 세포당 평균 7개의 신호로 핵에서만 반점 신호를 보냈습니다. 이는 DNA 손상의 유도가 ATM과 포스포세린 15 p53 사이의 상호 작용을 초래한다는 것을 나타냅니다. DNA 손상을 유도하기 전에 특정 ATM 키나아제 억제제로 세포를 사전 처리하면 신호 수가 세포당 평균 2개의 신호로 감소하여 잔기 세린 15에서 p53의 인산화가 ATM 키나아제 활성에 의존한다는 것을 확인합니다.

항 ATM 또는 항 포스포세린 15 p53 항체를 방출한 단일 항체 대조군 실험에서는 예상대로 어떠한 신호도 생성되지 않았습니다. 이 그림은 현탁 세포 배양의 사이토스핀 제제에 대한 근접 결찰 분석 기술의 특이성을 입증하고 확인하는 결과의 정량화 및 통계 분석을 제시합니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 1차 항체로 하룻밤 동안 배양한 후 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 근접 결찰 분석을 수행하기 전에 관심 세포의 면역형광 염색을 통해 항체를 신중하게 적정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 연구자들이 종종 기술적 인공물을 초래하는 면역침전 및 FRET 기반 이미징과 같은 표준 방법을 사용하여 평가하기 어려운 일시적인 단백질 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 부유 세포 배양에서 근접 결찰 분석을 수행하여 현장에서 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.