Name: 조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 쥐 지방 조직에서 미세 혈관 조각을 분리하여 조직 공학용 혈관 신생 단위를 생성하는 방법을. 이 기술은 복잡한 시험관 내 처리 없이 기능성 혈관 세그먼트를 얻어 조직 결손 치료에 활용할 수 있습니다.

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우리는 재닌 베커, 캐롤라인 비켈만와 루스 니클스의 우수한 기술 지원을 감사하고 있습니다. (- 독일 연구 재단 DFG) - LA 2682 / 7-1 본 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft의 연구비 지원을 받았다.

모든 절차는 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 및 제도적 지침 (Landesamt 대 Soziales, 어디 아퍼? 싶게 Verbraucherschutz,의 Abt. Lebensmittel- 싶게 Veterinärwesen, Zentralstelle, 자르브뤼켄, 독일)을 추적 관찰 하였다. 수술 도구 (1)의 제조 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 U / ㎖ 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 준비 절개 위 수술 집게, 소규모 제조 위 미세 겸자 15ml의 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM으로 무균 페트리 접시에 보관 ) 부고환 지방 패드를 수확합니다. </li><li> 5 분간 소독 용액에 노출 수술 도구. 대안 적으로, (증기 멸균을 121 ° C, 20 분)들을 소독. </li></ol> 2. 동물 및 마취 <ol><li> 연구 및 적응증으로 조심스럽게 쥐의 변형을 선택<html> 조사중인 될 수 있습니다. 참고 :이 연구에서 우리는 부고환 지방의 수확을위한 기증자로 남성 야생 형 C57BL / 6 마우스를 사용했다. 관심, 광고 MVF는 유전자 변형 녹색 형광 단백질 (GFP) 양성 기증자 동물 (C57BL / 6-Tg는 (CAG-EGFP) 1Osb / J) (22)로부터 분리 될 수있다. 이 단편은 GFP 음성 야생형 마우스 (14)에 주입 한 후 GFP의 면역 조직 화학 염색에 의해 쉽게 검출 할 수있는 큰 이점을 맺는다. </li><li> 자일 라진 (15 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (/ kg 75 mg)을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 동물 깊이 만 응답이 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. 기증자 동물은 지방 수확 후 희생으로 눈 윤활제는 표시되지 않습니다. 참고 : 진통 및 수술 불임이 실험을 계획하는 국가 및 기관의 각각의 가이드 라인과 일치 있는지 확인합니다. </li></ol>부고환 지방 패드의 제작 &quot;&gt; 3. 수확 <ol><li> 작업 테이블에 동물을 전송합니다. 수술 실체 현미경 하에서 앙와위에서 동물을 배치하고 발가락 핀치를 사용하여 깊은 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 용 드레이프에 테이핑하여 발을 고정 및 솔루션을 소독으로 복부를 소독. </li><li> 해부 가위로 기본 근육 층의 무료 복부 피부를 분리합니다. </li><li> 해부 가위 정중선 개복술을 수행하고 옆으로 복부 벽의 플랩을 전개. </li><li> 양측 고환, 부고환 및 미세 집게 (그림 1)를 사용하여 부고환 지방 패드를 식별합니다. 지방 패드의 분변 오염을 방지하기 위해 장 구조를 손상시키지 마십시오. </li><li> 실체 현미경 아래에있는 작은 준비 가위 및 미세 집게로 부고환 지방 패드를 수확. 부고환과 지방을 사이에 몇 mm의 안전 마진을 유지실수로 부고환 수확의 위험을 줄일 수 있습니다. 참고 :이 절차는 또한 실체없이 수행 할 수 있습니다. 그러나이 더 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 증가시킬 수 있습니다. </li><li> DMEM 15 mL를 함유하는 페트리 접시로 부고환 지방 패드를 이동시켜 세포 기관에 반송하여 37 ℃에서 사전 - 가열 하였다. </li><li> 복부 대동맥 경부 전위의 절개에 의해 동물을 희생. </li></ol> 광고 MVF 4. 분리 <ol><li> (15) 인산 완충 식염수 용액 (PBS), 멸균 수 14 ㎖의 폴리 프로필렌 (PP) 튜브, 멸균 된 50 mL의 삼각 플라스크에, 멸균 1.5 ㎖의 원추형 마이크로 원심 튜브 멸균 미세 위 세 멸균 페트리 접시를 준비한다. </li><li> 층류 후드 아래에 PBS의 15 mL의 페트리 접시에 세 번 지방 패드를 씻으십시오. </li><li> 14 mL의 PP 튜브에 지방을 전송합니다. t를 이용하여 (ML)에서 수확 된 지방 조직의 부피를 결정그는 튜브 규모. 조직 균질 현탁액이 얻어 질 때까지 미세 가위 기계적으로 지방 조직을 잘게. </li><li> 피펫을 측정 10 mL를 이용하여 50 mL의 삼각 플라스크에 NB4G 콜라게나 제 (0.5 U / ㎖ PBS)의 두 개의 볼륨으로 다진 조직을 옮긴다. 총 부피는 단계 4.3에서 측정 된 지방 조직의 체적 배로된다. 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 대기 조건 : 자동 교반기 (25mm 자기 교반 막대의 크기)을 이용하여 격렬한 교반하에 10 분 동안 항온 조직 분해를 수행한다. </li><li> 소화를 중지 할 수 있는지 여부를 판단하기 위해 현미경으로 소화 조직의 작은 부분 (10 μL)을 관찰한다. 효소 소화 과정 (그림 2)를 중지하는 적절한 시점을 나타내는 다 이제 주로 다음 하나의 셀에 &quot;무료&quot;광고 MVF 포함되어 있음을 확인. 참고 :이 단계는 절차에 경험을 필요로하며, 품질에 대한 중요의 광고 MVF을 격리합니다. 광고 MVF없이 단일 세포 현탁액 지방 소화 결과를 장시간. </li><li> PBS / 20 % FCS의 두 개의 볼륨으로 효소를 중화. 총 부피는 단계 4.4에서 세포 현탁액 용기의 용적 배로된다. PP 새로운 튜브에 다시 세포 현탁액 용기 전송. </li><li> 중력에 의해 지방 잔류 광고 MVF 별도 37 ° C에서 5 분 동안 현탁액을 인큐베이션. 그런 다음 조심스럽게 1 mL를 정밀 피펫 주요 지방 상층 액을 제거합니다. 서스펜션은 지방이없는 것으로 나타날 때까지 100 μL 정밀 피펫이 사이클을 여러 번 반복합니다. </li><li> 50ml의 원추형 원심 분리 튜브 위에 500 ㎛의 필터를 넣어. 지방 덩어리 나머지 제거하는 여과막에 14 mL의 PP 튜브에서 10 mL로 측정 피펫으로 셀 용기 현탁액을 전송. 개별 광고 MVF의 개수에 따라 새로운 14 mL의 PP 관으로 현탁액을 여과로 이동하면 계획된 실험 분리. 참고 : 대한의 vitr미세 혈관 망 형성을 중심 O의 분석은, 더 나아가 현미경 분석시 이미지 품질을 개선하기 위해 혈관 세포 현탁액을 정화하는 것이 유리할 수있다. 이를 위해, 현탁액을 추가로 필터에 수집 된 광고 MVF으로부터 단일 세포를 제거하기 위해 20 ㎛의 필터로 여과 한 번 할 수있다. </li><li> 광고 MVF를 함유하는 펠렛을 얻기 위해 세포 현탁액을 용기 (600 XG, 5 분, 실온)를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 용액이 남아 1까지 상청액을 제거한다. 이 1 ㎖의 광고 MVF와 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 mL의 원추형 마이크로 원심 튜브에 현탁 옮긴다. </li><li> 펠렛을 얻기 위해 마이크로 원심 튜브 내의 광고 MVF 현탁액 (600 XG, 5 분) 원심 분리기. </li><li> PBS / 20 % FCS의 필요한 최종 부피 펠렛을 재현 탁하는 상청액을 제거한다. 참고 : 분리 당 광고 MVF의 수는 미세한 계산에 의해 평가 될 수있다. 최종 세포 vesse의 목적 들어 1/10L 현탁액을 PBS에 1:10으로 희석하고,이 희석액 100 ㎕를 96- 웰 플레이트의 웰에 전달된다. 선박과 같은 형태를 보이는 광고 MVF의 전체 수는 계산하고 전체 분리로 추정된다. 필요한 광고 MVF 농도 및 정제는 개별적으로 시험 관내 또는 광고 MVF 생체 응용에 각각에 적용될 수있다. 이것은 미세 혈관 망 형성의 시험 관내 분석하거나 조직 결함으로 생체 내 이식 용 지지체에 광고 MVF 시드의 콜라겐 겔에 MVF 광고의 삽입을 포함 할 수있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 연구에서 우리는 광고 MVF의 절연을위한 잘 확립 된 프로토콜을 제시한다. 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF을 얻는 것은 몇 가지 중요한 단계를 간단한 절차입니다. 마우스는 다른 피하 및 복강 내 지방 예금을 나타낸다. 이전에 래트에 대해 기재된 바와 같이, 광고 MVF의 분리를위한 가장 적합한 지방 원 인해 큰 혈관 (11) 크기, 균일 한 구조와 최소한의 오염 (12)을 부고환 지방 패드이다. 반면, 마우스의 피하 지방 침착은 주변 조직에 더 작고 더 부착된다. 그러나, 부고환 지방 패드의 절제술은 정자와 수확 조직의 오염의 결과로, 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 맺는다. 따라서, 부고환, 고환 및 정삭의 식별이 절차의 주요 중요하다. 또한, 지방 패드 rapidl해야Y는 생체 조직의 손상을 최소화하기 위해 수확 후 처리. 마지막으로,이 쥐의 부고환 지방 패드 (...

조직 공학에서는 생체 대응 1, 2에서 불가능한 기능을 복원하거나 보강 조직 및 장기를 유지한다 대체품의 제조에 초점을 맞추고있다. 조직 공학 구조물의 운명은 결정적 적절한 혈관 3에 의존한다. 이러한 구조 내에서 미세 혈관 네트워크는 계층 적으로받는 사람의 혈관 4 inosculation 후 효율적인 혈액 관류를 허용하는 소동맥, 모세 혈관과 정맥으로 구성되어야한다. 이러한 네트워크의 생성은 조직 공학의 주요 과제 중 하나입니다. 이를 위해 실험 혈관 전략의 폭 넓은 스펙트럼은 지난 20 년 5, 6을 통해 소개되었다. 혈관 접근 방식은 설계, 담배 마는으로받는 미세 혈관의 증식을 자극이러한 성장의 혼입 7 요인 구조적 또는 물리 골격 변형 수단에 의해 단말. 그러나 대형 입체 구조의 혈관에 대한 혈관 신생에 의존하는 전략은 크게 미세 혈관 (8) 개발의 느린 성장 속도에 의해 제한됩니다. 조직들은 주입하기 전에 9 내에 구축 반대로 prevascularization의 개념은 네트워크 기능 미세 혈관의 생성을 목적으로한다. 종래 prevascularization는 골격 내의 내피 세포 벽화 세포 또는 줄기 세포 (10)와 같은 혈관 형성 세포의 공동 배양을 포함한다. 미세 혈관 망 형성 후 prevascularized 구조이어서 조직 결함을 주입 할 수있다. 이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 체외 기반으로하기 때문에 주목,이 prevascularization 접근 방식은 임상에 적용하기 어려운 &lt;/ EM&gt; 주요 규제 장애물 (9)에 의해 제한되는 절차. 따라서, 폭 넓은 임상 응용 프로그램에 더 적합한 새로운 prevascularization 전략의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 이러한 prevascularization 전략은 지방 조직 유래의 미세 혈관 단편 (AD-MVF)을 적용 할 수있다. 광고 MVF 쥐 (11), (12)와 마우스 (13)의 지방 조직에서 다량으로 수확 할 수있는 강력한 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 세동맥, 모세 혈관 및 루멘 생리 미세 혈관 형태를 나타내는 세정맥 용기 세그먼트 및 안정화 혈관 주위 세포를 14, 15로 구성된다. 이 독특한 기능은 precultivation없이 조직 결함에 광고 MVF 시드 발판의 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 이 광고-MVF 빠르게에서 재 조립기능성 미세 혈관 네트워크. 또한, 광고 MVF은 또한 자신의 놀라운 재생 능력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포 (16)의 풍부한 소스를 나타냅니다. 따라서, 광고 MVF 점점 조직 공학 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21의 다양한 분야에서 사용된다. 광고 MVF의 분리는 원래 12 쥐 11 년에 설립되었습니다. 여기서, 우리는 부고환 지방 패드에서 쥐의 광고 MVF의 표준화 분리를 허용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 형질 전환 마우스 모델을 사용하여 광고 MVF 기능을 기본 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력을 제공 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>1.5-mL 원추형 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>100-&micro; L 정밀 피펫</td><td>Eppendorf, 함부르크, 독일</td><td>4920000059</td><td></td></tr><tr><td>10-mL 측정 피펫</td><td>Costar, Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>14-mL PP 튜브</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>1-mL 정밀 피펫</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>500-&micro; m 필터(pluriStrainer 500 &micro; m)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>50-mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Erlenmeyer 플라스크</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>214-0211</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>65518</td><td></td></tr><tr><td>cell detachment solution (Accutase)</td><td>eBioscience, 샌디에고, 캘리포니아 미국</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River, 쾰른, 독일</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-TG(CAG-EGFP)1Osb/J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>CD117-FITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553354</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 NB4G&nbsp;</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>17465.02</td><td>효소 활성에 대해 제조업체에서 테스트 한 로트</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BC 601</td><td></td></tr><tr><td>DNA 결합 염료 (Bisbenzimide H33342)</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)&nbsp;</td><td>PAN Biotech, Rickenbach, Germany</td><td>P04-03600</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>파인 펜치</td><td>S& T AG, 노이하우젠, 스위스</td><td>FRS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>월드 프리시전 인스트루메츠, 사라소타, 플로리다, 미국</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>피부 대체물(Integra)</td><td>Integra Life Sciences, Sain Priest, France</td><td>62021</td><td></td></tr><tr><td>케타민&nbsp;</td><td>Serumwerk Bernburg AG, 베른부르크, 독일</td><td>7005294</td><td></td></tr><tr><td>M-IgG2AKAL488&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-4724-80</td><td></td></tr><tr><td>옥테니덤(소독액)</td><td>Sch&uuml; LKE & Mayer, Norderstedt, Germany</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Lonza Group, Basel, Switzerland</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20-&micro; m (20 &마이크로; m filter)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akFITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553988</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akPE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>소형 준비 가위</td><td>S& T AG, 노이하우젠, 스위스</td><td>SDC-15 R-8S</td><td></td></tr><tr><td>외과용 겸자</td><td>Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BD510R</td><td></td></tr><tr><td>테이프 (Heftpflaster Seide) 1.25 cm</td><td>Fink & Walter GmbH, 독일 메흐바일러</td><td>1671801</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td><td>1320422</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-SMA-AL488</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-9760-82</td><td>세포 내 라벨링에는 Cytofix/Cytoperm이 추가로 필요합니다(BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)</td></tr></tbody></table>

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

기능성 미세 혈관 네트워크는 생존과 설계 조직 구조의 통합을위한 중요한 중요하다. 이러한 목적을 위해, 여러 혈관 및 prevascularization 전략이 수립되었다. 그러나, 대부분의 셀 기반 접근 방식은 미세 혈관 네트워크의 형성에 시간이 많이 소요되는 체외 단계를 포함한다. 따라서, 그들은 수술 한 단계 절차에 적합하지 않다. 지방 조직 유래 미세 혈관 조각 (광고 MVF)는 유망 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 쉽게 지방 조직에서 분리 및 기능성 미세 혈관의 형태를 나타낼 수 있습니다. 또한, 이들은 생체 빠르게 주입 후 새로운 미세 혈관 망으로 조립. 또한, 광고 MVF은 림프관을 유도하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 그들은 더 높은 혈관 잠재력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포의 풍부한 소스. 이전의 연구에서 우리는 놀라운 vascularizati을 증명하고있다설계 뼈와 피부 대체에 광고 MVF의 용량에. 본 연구에서 우리는 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF의 효소 분리를위한 표준화 된 프로토콜에보고한다.

본 연구에서 우리는 12 개월 된 수컷 야생형 C57BL / 6 마우스 (35 ± 1g 체중을 의미)에 7-에서 지방 조직과 육 광고 MVF 분리 절차를 수행. 도 1은 후속 기계적 및 효소 광고 MVF 절연 및 뮤린 부고환 지방 패드의 채취를 나타낸다. 지방의 수확에 필요한 시간은 30 분이었고, 광고 MVF의 분리 120 분이었다. 전체적으로, 절차는 150 분 걸렸다. 우리는 기증자 동물 당 지방 조직의 1.2 ± 0.1 mL를 수확. 지방이 금액은 용액 당 42,000 ± 2,000 광고 MVF의 분리를 허용했다. 단리 광고 MVF의 평균 길이가 42 ± 1 ㎛ (도 2a)이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 소화 효소의 기간은 미세한 제어를 이용하여 결정 하였...

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

이 절차의 전반적인 목적은 조직 공학용 혈관화 단위 생성을 위해 마우스 지방 조직에서 미세혈관 조각을 분리하는 것입니다. 이 방법은 조직 대체물의 생체 내 혈관화에 관한 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 장점은 복잡한 체외 처리 과정 없이도 지지체에 파종하여 조직 결손 부위에 이식할 수 있는 완전히 기능적인 미세혈관 분절을 얻을 수 있다는 점입니다.이 방법은 미세혈관 네트워크 형성 및 리모델링의 기저에 있는 분자적 메커니즘을 밝히기 위한 in vitro 혈관 형성 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 먼저 마취된 수컷 야생형 C57 black six 마우스를 수술용 실체 현미경 아래에서 배와 닿는 자세(supine position)로 배치하고, 발가락 집기 자극에 반응이 없는지 확인합니다. 테이프로 발을 고정하고 복부를 소독합니다.다음으로, 해부 가위를 사용하여 복벽층을 아래의 근육 조직으로부터 분리하고 정중선 개복술을 시행합니다. 복벽의 플랩을 외측으로 젖혀 양측의 고환, 부고환 및 부고환 지방 패드를 확인합니다. 그 후, 소형 조작 가위와 미세 핀셋을 사용하여 부고환 조직이 수집되지 않도록 주의하며 지방 패드를 채취하고, 이를 37 °C의 DMEM 15 ml가 담긴 페트리 접시에 넣습니다.층류 후드 내에서 PBS 15 ml가 담긴 세 개의 서로 다른 페트리 접시에 지방 패드를 넣어 세척하고, 세척된 지방을 빈 14 ml 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 튜브 스케일을 사용하여 수집된 지방의 부피를 측정합니다. 그런 다음 미세 가위를 사용하여 지방 조직을 기계적으로 잘게 다집니다.균질한 조직 현탁액이 얻어지면, 10 mL 측정 피펫을 사용하여 잘게 자른 조직과 2배 부피의 collaginase NB 4G를 25 millimeter 교반바가 들어 있는 50 mL 삼각 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 강하게 교반하며 10분 동안 둡니다. 그런 다음, 소화된 조직 10 mcL를 현미경으로 관찰합니다.이 분리 절차에서 가장 어려운 단계는 소화를 중단할 적절한 시점을 식별하는 것입니다. 지방 패드를 너무 오래 소화시키면 미세혈관 파편 없이 단일 세포 현탁액만 남게 됩니다. 소화물에 단일 세포와 함께 지방 조직 유래 미세혈관 파편이 포함되어 있다면, 20% FCS가 첨가된 PBS를 2배 부피로 넣어 효소를 중화시키고 세포 용기 현탁액을 새로운 폴리프로필렌 튜브로 옮기십시오.중력에 의해 미세혈관 조각을 나머지 지방과 분리하기 위해 용액을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음, 1 mL 정밀 피펫을 사용하여 주요 지방 상층액 1 mL를 조심스럽게 제거하고, 이어서 100 µL 정밀 피펫을 사용하여 현탁액에 지방이 더 이상 보이지 않을 때까지 나머지 상층액을 제거합니다. 지방이 모두 제거되면, 10 mL 측정 피펫을 사용하여 세포 용기 현탁액을 50 mL 원추형 튜브 위의 50 µm 스트레이너로 여과하고, 여과된 현탁액을 각 개별 미세혈관 조각 분리물에 맞는 새로운 14 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.원심분리를 통해 미세혈관 파편 펠렛을 수집하고, 각 튜브에서 마지막 1 mL의 상층액을 제외한 나머지를 모두 제거합니다. 남은 상층액에 펠렛을 다시 현탁합니다. 그런 다음, 각 현탁액을 개별 1.5 mL 원추형 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 미세혈관 파편을 다시 펠렛화하여, 계획된 하위 분석에 적합한 최종 부피의 PBS 및 20% FCS로 재현탁합니다.여기서 7~12개월 된 야생형 C57 black six 마우스 6마리로부터 갓 분리한 미세혈관 조각의 길이 분포를 보여주며, 평균 길이는 약 42 µm로 관찰되었습니다. 이 대표적인 세포 혈관 현탁액 도말 표본에서 알 수 있듯이, 지방 조직이 충분히 소화되면 크기가 큰, 중간, 작은 미세혈관 조각뿐만 아니라 단일 세포들이 관찰됩니다. 고배율로 관찰하면 미세혈관 조각들이 계층적 미세혈관 분절을 가진 성숙한 미세혈관 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있습니다.유세포 분석을 통한 미세혈관 단편의 특성 분석 결과, 이들은 CD31 양성 내피세포, alpha smooth muscle acton 양성 혈관 주위 세포 및 CD117 양성 중간엽 줄기세포 마커를 발현하는 세포들을 포함하고 있는 것으로 나타났습니다. 진피 피부 대체제에 파종한 후, 더 큰 미세혈관 단편들은 주로 이식물 표면에 위치하였으며 일부 모세혈관 분절은 이식물 중심부 내에서 검출되었습니다. 파종된 미세혈관 단편의 면역조직화학 염색 결과, 세동맥, 세정맥 및 모세혈관과 유사한 단편들이 포함된 생리적 미세혈관 구성이 추가로 확인되었습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 조직 공학을 위한 혈관화 단위로서 생쥐의 지방 조직에서 미세혈관 단편을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

이 프로토콜은 마우스 지방 저장소를 해부하고 각 동맥을 분리 및 소화하여 내피 세포 집단을 유리시키고 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 다운스트림 응용 분야에 사용되는 새로 분리된 세포는 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애의 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 것입니다.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

이 연구는 혈관벽 상주 CD34+ 줄기세포(CD34+ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

타악기 흐름 생물 반응기에서 교양 혈관 평활근 세포와 탄성 PGS의 공사장 공중 발판은 비교적 짧은 기간에 문화 기본 ECM 생산과 유망 중소 지름 동맥 구조가 발생할 수 있습니다.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

학습하세요 쥐 지방 조직에서 미세 혈관 조각을 분리하여 조직 공학용 혈관 신생 단위를 생성하는 방법을. 이 기술은 복잡한 시험관 내 처리 없이 기능성 혈관 세그먼트를 얻어 조직 결손 치료에 활용할 수 있습니다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

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