조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 조직 공학을 위한 혈관 형성 단위를 생성하기 위해 쥐 지방 조직에서 미세혈관 조각을 분리하는 것입니다. 이 방법은 조직 치환의 생체 내 혈관화에 대한 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 복잡한 체외 처리 없이 골격에 파종하고 조직 결함에 이식할 수 있는 완전한 기능의 미세혈관 분절을 생성한다는 것입니다.

이 방법은 체외 혈관 신생 분석과 같은 다른 시스템에도 적용하여 미세혈관 네트워크 형성 및 리모델링의 기저에 있는 분자 메커니즘을 규명할 수 있습니다. 먼저 마취된 수컷 야생형 C57 블랙 식스 마우스를 수술용 실체현미경으로 앙와위 자세로 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인합니다. 테이프로 발을 고정하고 복부를 소독합니다.

다음으로, 해부 가위를 사용하여 하부 근육 조직에서 복층을 분리하고 정중선 개복술을 만듭니다. 복벽의 플랩을 측면으로 펼치고 고환, 부고환 및 부고환 지방 패드를 양측으로 식별합니다. 그런 다음 작은 준비 가위와 가는 집게를 사용하여 지방 패드를 채취하고 부고환 조직을 수집하지 않도록 주의하고 지방 패드를 섭씨 37도의 DMEM 15ml가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.

층류 후드에서 15ml의 PBS가 들어 있는 세 개의 개별 페트리 접시로 지방 패드를 세척하고 세척된 지방을 빈 14ml 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 튜브 저울을 사용하여 수확된 지방의 양을 측정합니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 지방 조직을 기계적으로 다집니다.

균질한 조직 현탁액이 얻어지면 10mL 측정 피펫을 사용하여 2가지 부피의 콜라기나제 NB 4G가 함유된 다진 조직을 25mm 교반 막대가 포함된 50mL 삼각 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣고 격렬하게 저어줍니다. 그런 다음 현미경으로 소화된 조직의 10mcL를 관찰합니다.

이 분리 절차에서 가장 어려운 단계는 분해를 중지할 적절한 시간을 식별하는 것입니다. 지방 패드를 너무 오래 소화하면 미세혈관 조각이 없는 단일 세포 현탁액이 발생합니다. 소화액에 단세포 옆에 유리 지방 조직 유래 미세혈관 단편이 포함되어 있는 경우, 20%FCS가 보충된 두 부피의 PBS로 효소를 중화하고 세포 혈관 현탁액을 새로운 폴리프로필렌 튜브로 전달합니다.

용액을 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 중력에 의해 남아 있는 지방에서 미세혈관 조각을 분리합니다. 그런 다음 1mL 정밀 피펫을 사용하여 주요 지방 상층액 1mL를 조심스럽게 제거한 다음 100mcL 정밀 피펫을 사용하여 현탁액에 지방이 없는 것처럼 보일 때까지 나머지 상층액을 제거합니다. 지방이 모두 제거되면 10mL 측정 피펫을 사용하여 50mL 원뿔형 튜브 위의 50미크론 스트레이너를 통해 세포 혈관 현탁액을 여과하고 여과된 현탁액을 각 개별 미세혈관 단편 분리물에 대해 새로운 14mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.

원심분리를 통해 미세혈관 절편 펠릿을 수집하고 각 튜브에서 마지막 1mL의 상층액을 제외한 모든 것을 제거합니다. 펠릿을 나머지 상부에 재현탁합니다. 그런 다음 각 현탁액을 개별 1.5mL 코니컬 미세원심분리 튜브로 옮기고 미세혈관 단편을 다시 펠레화하여 계획된 다운스트림 분석을 위해 적절한 최종 부피의 PBS 및 20%FCS로 재현탁합니다.

여기서, 6개월, 7개월에서 12개월 된 야생형 C57 블랙 6 마우스에서 갓 분리된 미세혈관 단편의 길이 분포를 보여주며, 평균 평균 길이는 약 42마이크로미터로 관찰되었습니다. 이 대표적인 세포 혈관 현탁액 도말에서 알 수 있듯이, 지방 조직이 충분히 소화되었을 때 단일 세포뿐만 아니라 크고, 중간 및 작은 미세혈관 단편이 관찰됩니다. 더 높은 배율은 미세혈관 단편이 계층적 미세혈관 분절과 함께 성숙한 미세혈관 형태를 나타낸다는 것을 보여줍니다.

유세포 분석에 의한 미세혈관 단편의 특성 분석은 CD31 양성 내피 세포, 알파 평활근 액톤 양성 주위 혈관 세포 및 CD117 양성 중간엽 줄기 세포, 마커 발현 세포를 포함하고 있음을 나타냅니다. 피부 대용품에 파종한 후, 더 큰 미세혈관 조각은 주로 임플란트 표면에 국한되어 있으며 일부 모세혈관 분절은 임플란트 코어 내에서 감지됩니다. 파종된 미세혈관 단편의 면역화학적 염색은 세동맥, 정맥 및 모세혈관과 같은 단편을 가진 생리학적 미세혈관 구성을 추가로 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직 공학을 위한 혈관 생성 단위로서 쥐 지방 조직에서 미세혈관 조각을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.