Name: 전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 배우세요 마우스 심실 조각을 이용한 심장 전기생리학 연구 방법을. 생존 가능한 조직에서 활동 전위를 기록하여 심근세포 이식 및 약물 효과를 분석할 수 있습니다.

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우리는 워크샵과 신경 생리학 연구소의 동물 시설에서 제공하는 지원을 인정합니다. 이 작업은 Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune 및 Deutsche Stiftung für Herzforschung에 의해 지원되었습니다.

동물 취급은 지역 동물 복지위원회의 지침과 유럽 의회의 2010 / 63 / EU 지침에 부합해야합니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코오스 10, HEPES 5, 2,3- 부탄 디온 모노 옥심 (BDM) 30. pH를 7.4로 조절하여 Ca 2+ (mM 조성)없이 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ℃에서 NaOH로 처리 하였다. </li><li> NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코스 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9를 사용하여 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ° C에서 NaOH로 pH를 7.4로 조절한다. </li><li> 4 % 저 용융 아가로 오스 준비 : Ca 2+가 없는 15 mL Tyrode 용액에 0.6 g 저 용융 아가로 오스를 넣으십시오. agarose가 녹을 때까지 10-15 초 동안 750W에서 전자 레인지에서 2 번 혼합물을 가열한다. 용액을 37 ° C의 일정 온도로 유지하십시오.# 176; C를 연속적으로 저어 준다. </li><li> 37 ℃에서 혈청없는 Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)을 carbogen (5 % CO2, 95 % O2)로 버블 링하십시오. </li></ol> 2. 마이크로톰을 준비하십시오. <ol><li> 마이크로톰을 켜십시오. </li><li> 외부 마이크로톰 챔버를 얼음으로 채 웁니다. </li><li> 내부 마이크로톰 챔버를 Ca 2+가 없는 얼음 차가운 Tyrode 용액으로 채우고 100 % O 2 로 계속해서 용액에 산소를 공급하십시오. </li><li> Microtome의 블레이드 홀더에 스틸 블레이드를 놓습니다. </li></ol> 3. 마우스 심장 격리 <ol><li> 피하에 2,500 U 헤파린 주입. 15 분간 기다리십시오. </li><li> 자궁 경관 탈구로 동물을 희생. </li><li> 흉골 절개로 가슴을 엽니 다. </li><li> 조심스럽게 작은 가위와 집게 # 5를 사용하여 심낭을 절개하십시오. </li><li> 상행 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고 관상 동맥을 얼음으로 차가운 Tyrode &#39;s로 관류시킵니다용액을 남은 혈액이 제거 될 때까지 제거한다. </li><li> 부드럽게 포셉과 가위로 심장을 절제하고 차가운 Tyrode의 용액을 Ca 2+ 없이 흘려 보내십시오. </li><li> 메스와 가위로 심방과 심방을 분리하십시오. </li></ol> 4. 4 % 저 융점 아가로 오스에 심실 내장 <ol><li> 정점이있는 심실을 아가로 오스 몰드 ( 그림 1 )에 위쪽으로 향하게하십시오. 좌심실의 금형 중앙에 핀을 놓습니다. </li><li> 심장이 완전히 덮일 때까지 37 ° C에서 4 % 저 용융 아가로 오스로 곰팡이를 채 웁니다. </li><li> 금형을 얼음에 담그면 아가로 오스가 빨리 경화되어 뜨는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 메스와 함께 금형에서 심실이 들어있는 아가로 오스 블록을 제거합니다. </li><li> 블록을 거꾸로 뒤집고 심실을 채우고 아가로 오스 블록의 뒷면에있는 간격을 채우십시오.s는 20G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 4 % 저 용융 아가로 오스가있는 털갈이의 핀으로 남겨 두었습니다. </li><li> 메스로 아가로 오스 블록을 자르면 블록의 평평한 바닥과 심장 정점의 직립 위치를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 5. 심실 조직 절개 <ol><li> cyanoacrylate 접착제 한 방울로 microtome의 표본 홀더에 블록을 고정하십시오. 심장 정점을 위로 향하게하십시오. </li><li> 표본 홀더를 칼슘 2가 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode로 채워진 마이크로톰의 내부 표본 챔버에 놓습니다. Tyrode의 솔루션으로 아가로 오스 블록을 완전히 덮으십시오. </li><li> 추가 응용 프로그램 (날카로운 전극 녹음 150-200 μm의)에 따라 150-400 μm의 두께로 짧은 축 슬라이스를 준비하고 블레이드의 진동 주파수를 60-70 Hz로 유지하고 가능한 한 천천히 블레이드를 앞으로 이동시킵니다 . </li><li> 작은 브러시를 사용하여 슬라이스에서 남아있는 아가로 오스를 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 부드럽게 전송0.9 % 칼슘 2 + 100 % O 2 와 함께 Tyrode의 솔루션에 파스퇴르 피펫으로 슬라이스 슬라이스 절차에서 회복하기 위해 얼음에 최소한 30 분 동안 그들을 저장합니다. </li><li> 그 후 37 ℃에서 DMEM으로 30 분간 슬라이스를 유지하고 카보 겐이 폭기되어 BDM을 더 잘 사용하기 전에 씻어 낸다. </li></ol> 6. 샤프 전극 준비 준비 <ol><li> 예열의 경우 녹음이 시작되기 30 분 전 모든 전기 장치를 켜십시오. </li><li> 거꾸로 현미경에 배치 가열 플레이트에 3cm 세포 배양 접시를 넣어. </li><li> 접시에 맞춤형 링 전극 ( 그림 2 )을 놓고 전치 증폭기와 자극 전극의 접지선을 연결하십시오. </li><li> 관류 시스템의 유연한 튜브를 접시에 연결하십시오. </li><li> carbogen으로 폭기 DMEM와 재관류 시스템의 저수지를 입력하십시오. </li><li> 관류 펌프를 켜고 관류를 설정하십시오2 ~ 3 mL / min. </li><li> 유량 히터와 가열 플레이트를 조절하여 37 접시에 DMEM의 온도를 조정합니다. </li></ol> 7. 활동 잠재 녹음 <ol><li> DMEM 가득 접시에 심실 슬라이스를 놓습니다. </li><li> 거꾸로 된 현미경으로 조직의 구조적 무결성과 생존력 (수축 기능에 기반)을 확인하십시오. </li><li> 기록 용 유리 전극을 3M KCL로 채 웁니다. </li><li> DMEM으로 자극 전극을 채 웁니다. </li><li> 녹음 전극과 자극 전극을 전극 홀더에 놓습니다. </li><li> 슬라이스에 자극 전극을 조심스럽게 넣고 전기 자극기를 켭니다. 1-2 Hz의 자극 주파수로 시작하십시오. </li><li> micromanipulator와 함께 기록 전극을 의도 된 기록 위치로 이동시킵니다. </li><li> 팁이 조직에 닿을 때까지 녹음 전극을 천천히 내립니다. </li><li> 짧은 직사각형 전기 펄스를기록 전극은 세포막을 관통한다. </li><li> 안정된 신호가 확보 될 때까지 기록 전극의 위치를 ​​조심스럽게 바꾸십시오. </li><li> 활동 잠재력의 기록을 시작하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 선언 할 것이 없다.

심실 슬라이스는 조직 구조와 같은 생체 내에서 보존되고 심장의 모든 부위에 측정 기술을 직접 액세스 할 수있는 전기 생리 학적, 약리학 적 및 기계적 연구를 가능하게합니다. 생리 작용 잠재 성질은 배아, 신생아 및 성인 조각 9 , 10 , 11 에서 입증되었습니다. 슬라이싱 절차에 의해 직접적으로 손상된 표면층을 제외한 슬라이스의 활력은 활력 염색으로 확인되었습니다 9 . 날카로운 유리 전극을 사용하는 조각 내에서의 활동 전위 기록은 여기에 설명 된 이식 된 심근 세포의 통합 및 성숙을 조사하거나 심장 활성 화합물을 첨가 한 후 약리학 연구에 사용할 수 있습니다. 개별 셀에서 1 시간 이상 지속되는 장기간 녹음이 가능합니다. 이 녹음 시간은 테스트하기에 충분합니다.순차적 재관류 및 세척에 의한 하나의 ...

얇은 조직 조각은 Yaman과 Mcllwain이 1966 년에 뇌 조각의 전기적 활동이 시험 관내에서 유지 된다는 것을 보여주기 때문에 기초 과학에서 자주 사용되었습니다 1 . 그 이후로 뇌 2 , 간 3 , 폐 4 및 심근 조직 5 , 6 , 7의 조각에 대해 전기 생리 학적 및 약리학 적 연구가 수행되었습니다. 신생아 쥐의 심실 조각에서 첫 번째 패치 - 클램프 녹음은 1990 년 8 월 에 기술되었지만,이 기술은 오랫동안 망각에 빠졌다. 10 년이 지난 후에, 우리 그룹은 쥐 배아 9 , 신생아 10 및 성인 11 심장 조각을 준비하는 새로운 방법을 확립했습니다. 이러한 생존 가능한 조직 절편은 급성 실험 (성인 슬라이스몇 시간 동안 배양 할 수 있음) 또는 단기 배양 실험 (배아 및 신생아 슬라이스를 며칠 동안 재배 할 수 있음). 전기 생리학적인 특성과 날카로운 전극 활동 전위 및 미세 전극 배열 녹음 11 에 의해 평가 된 동질적인 자극 확산과 같은 생체 내 슬라이스가 표시 됩니다 . &quot;2 차원&quot;형태로 인해 심전도의 모든 영역에 녹음 전극을 직접 액세스 할 수 있기 때문에 전기 생리 학적 연구를위한 흥미로운 도구가되며 Langendorff- 관류 심장 전체에 비해 새로운 실험 옵션이 제공됩니다. 베라파밀 (L-type Ca 2+ -channel blocker), 리도카인 (Na + 채널 차단제), 4- 아미노 피리딘 (비 선택적 전압 의존성 K + 채널 차단제) 및 리노피딘 (KCNQ K)과 같은 이온 채널 차단제에 대한 상기 약물의 약물 반응은, + 채널 차단기) 9 , 11 </sup&gt;는 해리 된 심근 세포에 대한 공지 된 효과에 상응 하였다. 등척성 힘 측정은 양의 힘 주파수 관계를 나타내었고 손상되지 않은 수축 기능을 강력하게 제안 하였다. 이러한 결과는 쥐 뇌실 절편이 생리 및 약리 연구를위한 시험 관내 조직 모델로서 적합 함을 입증했다. 또한, 심전도 기록과 결합 된 수축 심실의 심실 슬라이스는 전기 및 기계적 통합뿐만 아니라 이식 된 태아 12 , 13 , 14 및 줄기 세포에서 파생 된 15 개의 심근 세포의 성숙을 특성화하는 데 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다. 요약하면, 심실 슬라이스는 귀중하고 잘 확립 된 다세포 조직 모델이며 해리 된 심근 세포와 Langendorff- 관류 된 심장을 보완하는 것으로 간주되어야합니다심장 혈관 연구에서 심장 내 모든 부위에 예리한 전극 기록과 같은 측정 기술의 직접 액세스뿐만 아니라 생체 내 조직 구조 (해리 된 세포와 대조적으로)를 제공한다는 큰 이점이 있습니다 (전체 심장 조제와는 대조적으로).

<table><tbody><tr><td>라이카 VT 1000s</td><td>라이카 마이크로시스템즈, 베츨라, 독일</td><td></td><td>진동 블레이드가 있는 마이크로톰.</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 블레이드</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>파인 브러시, eg 크기 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>심</td>실을 내장하기 위해 <td>자체 만든</td>Molt 준비 테이블 <td></td><td></td></tr><tr><td> agarose</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, 미국</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4'' Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2'' Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Scissor</td><td>WPI, Sarasota, 미국</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>산소 가스(의료용 O2)</td><td>Linde, 독일 뮌헨</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카보겐 가스 (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, 뮌헨, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, 미국</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose Roth</td><td>, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저배율 미세 조작기</td><td>Narashige, Tokyo, 일본</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>고배율, 3축 미세 조작기</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>연동 관류 펌프</td><td>다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2채널 온도 컨트롤러</td><td>다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>사각 펄스 자극기</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine 심근 세포는 심장 생리학 및 새로운 치료 전략에 대한 시험 관내 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 해리 된 심근 세포의 다세포 제제는 심장의 기계적 및 전기 생리 학적 성질에 영향을 미치는 심근 세포, 비 - 근세포 및 세포 외 기질의 생체 내 구조의 복합체 를 대표하지 못한다. 여기서 우리 는 생체 내 조직 구조와 같은 보존 된 생쥐 심근의 실용적 심실 슬라이스를 준비하고 전기 생리 학적 기록에 대한 적합성을 입증하는 기술을 설명합니다. 심장 절제 후 심실을 심방에서 분리하고 2,3-butanedione monoxime이 포함 된 Ca 2+가 없는 용액으로 관류하고 4 % 저 용융 아가로 오스 블록에 묻힌다. 블록을 진동 날이있는 마이크로톰 위에 놓고 150-400 μm 두께의 조직 절편을 준비하여 진동을 유지합니다. fre블레이드를 가능한 한 천천히 앞으로 움직이게합니다. 조각의 두께는 추가 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 슬라이스는 0.9 mM Ca 2+ 및 2,3- 부탄 다이옥신 모노 옥심 (BDM)을 함유 한 차가운 타이로드 용액에 30 분 동안 저장한다. 그 후, 슬라이스를 37 ℃의 DMEM으로 옮겨 30 분간 BDM을 세척한다. 조각은 수축 기능을 분석하거나 이식 된 줄기 세포 유래 심근 세포와 숙주 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 힘 측정을 위해 날카로운 전극 또는 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다. 날카로운 전극 녹음을 위해, 슬라이스는 거꾸로 현미경의 가열 판에 3cm 세포 배양 접시에 배치됩니다. 슬라이스는 단 극성 전극으로 자극되고 슬라이스 내의 심근 세포의 세포 내 활동 전위는 날카로운 유리 전극으로 기록됩니다.

심근 경색은 심근 세포의 사실상 비가 역적 손실을 초래합니다. 줄기 세포 유래의 심근 세포를 외인성 심장 재생에 사용하는 세포 대체 요법이 유망한 치료법이다. 이식 된 세포의 전기적 통합과 성숙은 세포 대체 요법의 안전성과 효율성을 위해 매우 중요합니다. 통합 및 성숙을 평가하기 위해 우리는 성숙한 생쥐의 건강한 심장에 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 발현하는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCM, 0.5 x 106 iPSCM / 10 μL 2 회 주사)에서 유래 한 심근 세포를 이식했다. (Peinkofer et al. 방법에 대한 자세한 설명은 15 )을 참조하십시오. 이식 6 일 후에, 수혜자 심장의 심실 조각을 기술 된 프로토콜을 사용하여 준비 하였다. 대표적인 녹음은그림 3. 이식 ...

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

본 기술의 전반적인 목적은 전기생리학적 기록에 적합한 생존 가능한 심실 심장 슬라이스를 얻는 것입니다. 이 방법은 이식된 심근세포의 전기적 통합이나 심장 활성 약물의 효과와 같이 조직 수준에서의 심장 전기생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생존 가능한 심실 조직 슬라이스가 생체 내와 유사한 조직 구조를 유지하고 있어, 심장의 모든 영역에서 직접적인 측정이 가능하다는 점입니다.이 방법은 마우스 심장 전기생리학에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 토끼나 기니피그와 같은 다른 동물에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 동물의 피부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 흉강을 연 후, 작은 가위와 핀셋을 사용하여 심장의 심낭을 조심스럽게 박리합니다.좌심실에 캐뉼라를 삽입하고, 남은 혈액이 모두 제거될 때까지 칼슘이 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode 용액으로 심장을 제자리에서 관류합니다. 그런 다음, 심장을 조심스럽게 절제하여 칼슘이 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode 용액으로 옮깁니다. 메스나 가위를 사용하여 심방을 심실에서 분리합니다.다음으로, 심실의 첨단부가 위를 향하도록 하여 아가로스 몰드에 놓습니다. 이어서, 몰드의 중앙이자 좌심실 챔버 위치에 핀을 꽂습니다. 심장이 완전히 덮일 때까지 37 °C의 4% 저융점 아가로스를 몰드에 채웁니다.그런 다음, 조직이 뜨는 것을 방지하기 위해 아가로스를 더 빠르게 경화시키도록 몰드를 얼음 위에 둡니다. 1분 후, 메스로 몰드에서 뇌실이 포함된 아가로스 블록을 제거합니다. 그 후, 블록을 뒤집고 주사기를 사용하여 뇌실강과 아가로스 블록 뒷면의 틈새를 4% low-melt agarose로 채웁니다.그런 다음, 메스로 아가로스 블록을 다듬어 바닥면을 평평하게 만들고 심장 첨단부가 수직이 되도록 합니다. 이 과정에서 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 사용하여 심장 첨단부가 위를 향하도록 마이크로톰의 시료 홀더에 블록을 고정합니다. 다음으로, 칼슘이 없는 차가운 Tyrode 용액이 채워진 마이크로톰의 내부 시료 챔버에 시료 홀더를 넣습니다.아가로스 블록이 Tyrode 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 이후의 응용 목적에 따라 150 내지 400 micrometers 두께로 슬라이스를 준비하십시오. 블레이드의 진동 주파수를 60 내지 70 Hertz로 유지하고, 블레이드를 가능한 한 천천히 전진시키십시오.그 후, 가는 붓을 사용하여 슬라이스에 남아 있는 아가로스를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 이용하여 슬라이스를 100% 산소로 포화시킨 0.9 millimolar calcium 함유 Tyrode 용액으로 부드럽게 옮깁니다. 슬라이싱 과정으로부터 회복될 수 있도록 얼음 위에서 최소 30분 동안 보관하십시오.절편들을 그물망 위에 놓으면 평평하게 유지하는 데 도움이 됩니다. 그 후, 거름종이와 두 번째 그물망을 사용하여 절편들을 37°C의 carbogen이 버블링되는 DMEM으로 옮겨 추가로 사용하기 전 BDM을 씻어냅니다. 예열을 위해, 기록 시작 30분 전에 모든 전기 장치를 켭니다.가열 플레이트가 장착된 3cm 세포 배양 접시를 도립 현미경 위에 놓습니다. 그런 다음, 맞춤 제작된 링 전극을 접시에 넣고 프리앰프와 자극 전극의 접지선을 연결합니다. 그 후, 관류 시스템의 유연한 튜브를 접시에 연결합니다.관류 시스템의 저장조를 DMEM으로 채우고 카보젠으로 폭기합니다. 그런 다음, 관류 펌프를 켜고 관류 속도를 분당 2~3 mL로 설정합니다. 유량 가열기와 가열판을 조절하여 디쉬 내 DMEM의 온도를 37 °C로 맞춥니다.이제 뇌실 슬라이스를 DMEM이 채워진 디시에 넣으십시오. 도립 현미경을 사용하여 조직의 구조적 무결성과 생존력을 확인합니다. 그런 다음, 기록용 유리 전극에는 3 M KCl을, 자극 전극에는 DMEM을 채우십시오.다음으로, 전극 홀더에 기록 전극과 자극 전극을 배치합니다. 그 후, 자극 전극을 슬라이스 위에 조심스럽게 올립니다. 전기 자극기를 켜고 1~2 Hz의 자극 주파수로 시작합니다.그런 다음, 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 기록 전극을 의도한 기록 위치로 이동시킵니다. 전극 팁이 조직에 닿을 때까지 기록 전극을 천천히 내립니다. 기록 장치에서 접촉이 감지되면, 기록 전극을 통해 짧은 직사각형 전기 펄스를 가하여 세포막을 관통시킵니다.다음으로, 안정적인 신호가 확보될 때까지 기록 전극의 위치를 조심스럽게 조정합니다. 그 후, 활동 전위 기록을 시작합니다. 통합 및 성숙도를 평가하기 위해, eGFP를 발현하는 iPSCM 유래 심근세포를 성체 마우스의 건강한 심장에 이식하였습니다.여기에는 숙주 조직에 배치된 단극 전극으로 국소 자극을 준, 이식된 iPSCM이 포함된 심실 심장 슬라이스가 표시되어 있습니다. 세포 내 활동 전위는 3 M KCl로 채워진 날카로운 유리 미세전극을 사용하여 eGFP 양성 이식 iPSCM 및 슬라이스 내의 인접한 숙주 조직에서 기록되었습니다. 다음은 건강한 숙주 조직과 이식된 iPSCM에서의 활동 전위 기록입니다.슬라이스는 숙주 조직에 배치된 자극 전극을 통해 약 2 Hz 및 5 Hz로 국소 자극되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 마이크로톰 날의 전진 속도를 가능한 한 느리게 유지하는 것이 중요합니다.이 절차에 이어, 추가적인 질문에 답하기 위해 초기 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 세포 치료 분야의 연구자들이 수신자 심장에 이식된 심근세포의 전기적 통합 및 성숙도를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 진동 칼날 마이크로톰을 사용하여 생존 가능한 심실 단축 단면 슬라이스를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절편들은 유리 미세전극을 이용한 전기생리학적 기록에 특히 적합합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

고주파 도플러 초음파는 지역 심근 기능을 평가하기위한 새로운 기술입니다. 이 작품은 심근 스트레인, 국소 빈혈 - reperfused (IR) murine 마음에 DP / DT 및 승모판 병리 현상의 반복 측정이 다양한 이미징 플랫폼의 응용을 보여주는 첫번째 증거를 제공합니다.

고주파 고해상도 Echocardiography : 국소 빈혈 - reperfused Murine 중심부에 심근 스트레인, 수축성 및 승모판 병리 현상의 비침습 반복 측정에 대한 최초의 증거

외과 외상은 염증 반응을 유도합니다. 크린 시토킨 및 내생 리간드는 국소 빈혈과 reperfusion에 따라 심근 경색 크기를 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 thoracotomy의 영향을 최소화하기 위해 매달려 가중치를 사용하여 murine 국소 빈혈과 reperfusion의 수정된 폐쇄 가슴 모델을 제시.

심근 국소 빈혈 및 Reperfusion의 Murine 폐쇄 가슴 모델

이 비디오는 돼지 심장의 실행 가능한 초박형 절편을 생성하는 진동 기반 절차를 보여줍니다. 준비된 조직 절편은 배양하여 약리학적 검사를 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다.

돼지 심실 절편의 생성: 돼지 심장 조직의 초박형 절편을 준비하기 위한 비브라톰 기반 기술

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

복잡한 해부학으로 인해 심장 샘플에 대한 일관되게 재현 가능한 해부 및 수확 프로토콜을 구현하기가 어려울 수 있습니다. 이 원고는 일부 표준 심장 해부 프로토콜의 핵심 요소를 제시하여 전체 검사 접근 방식과 조직 병리학 검사에 일반적으로 사용되는 샘플링 부위를 강조합니다.

심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

배우세요 마우스 심실 조각을 이용한 심장 전기생리학 연구 방법을. 생존 가능한 조직에서 활동 전위를 기록하여 심근세포 이식 및 약물 효과를 분석할 수 있습니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

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