미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

본 절차의 전반적인 목표는 E17 마우스 신경 조직을 분리 및 결합하여, 미세전극 어레이(microelectrode arrays) 상에서 신경망을 배양, 기록 및 자극하는 것입니다. 이 방법은 학습과 기억의 기본 메커니즘과 관련된 네트워크 역학 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세전극 어레이가 여러 지점에서 동시에 기록할 수 있어, 기존의 단일 지점 유리 피펫 기록 방식에 비해 더 나은 공간적 및 시간적 해상도를 제공할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 학습 및 기억의 네트워크 역학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 약물 독성을 조사하거나 차세대 맞춤형 의료를 위한 패러다임을 설계하는 데에도 활용될 수 있습니다. 해부 및 해리 과정 중의 조직 조작은 단순히 프로토콜을 읽는 것만으로는 배우기 어렵기 때문에, 이 과정에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 어레이를 준비하려면 멸균 피펫 팁을 사용하여 각 MEA 중앙에 해동된 laminin 40~50 마이크로리터를 추가하고, 대조군 플레이트에는 laminin 0.2 밀리리터를 추가하십시오.

바이오후드 내의 모든 MEA와 대조군 디쉬를 덮고, 37 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 멸균 파스퇴르 피펫을 이용한 흡입 방식으로 MEA 중앙의 과잉 라미닌을 조심스럽게 제거하고, 세포 분주 전 표면을 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, 100 mm 페트리 디쉬 4개에 L-15 배지를 붓고 덮개를 덮은 뒤, 배지가 완전히 얼지 않고 슬러시 상태가 될 때까지 -20 °C 냉동고에서 약 40~60분 동안 보관합니다.

해부를 준비하기 위해, 유리 페트리 접시를 얼음이 가득 담긴 트레이 위에 뒤집어 놓습니다. 이제 동물의 하복부에 70% ethanol을 분무합니다. 작은 수술용 가위를 사용하여 하복부의 피부와 피하 지방을 V자 모양으로 절개하고, 절개 부위를 흉강의 원위단까지 확장하여 자궁을 노출시킵니다.

포셉을 사용하여 배아 사이의 자궁을 조심스럽게 들어 올립니다. 전체 자궁이 완전히 분리될 때까지 해부용 가위로 결합 조직을 절단합니다. 그런 다음 70% ethanol로 자궁을 빠르게 헹구어 혈액을 제거하고, 차가운 L-15가 채워진 4개의 페트리 접시 중 하나에 넣습니다.

그 후, 두 쌍의 미세 팁 핀셋을 사용하여 각 배아를 자궁과 내부 배아낭에서 분리합니다. 분리된 배아를 차가운 L-15가 가득 담긴 두 번째 디쉬에 넣은 다음, 머리 부분은 세 번째 페트리 접시로, 몸통 부분은 네 번째 접시로 옮깁니다. 바이오후드 내의 냉각된 유리 페트리 접시 스테이지 위에 오토클레이브 멸균된 필터 페이퍼 조각을 놓고, 그 위에 배아 머리 하나를 올립니다.

다음으로 아이리스 가위의 하단 날 끝을 두개골 기저부에 위치시키고, 하단 날을 두개골 내면과 밀착시켜 뇌와 떨어뜨린 상태에서 후두판을 절개한 후 두 정수리판 사이의 정중선을 따라 절개합니다. 연골성 전두 두개판 사이를 따라 전방으로 절개를 계속합니다. 그런 다음 후두판 중심에서 시작하여, 중심 절개선을 기준으로 왼쪽과 오른쪽으로 수직 절개를 수행합니다.

그 후, 작은 스패튤라를 뇌의 복측 표면과 두개골 바닥판 사이에 조심스럽게 밀어 넣어 스패튤라가 뇌 아래에 완전히 위치하도록 합니다. 그런 다음 스패튤라를 들어 올려 뇌를 제거합니다. 깨끗한 스패튤라를 사용하여 먼저 후각구(olfactory bulb)를 제거한 다음, 전두엽을 사다리꼴 패턴으로 절개합니다.

다음으로, 조직을 보관 배지가 들어 있는 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 과정에서 멸균된 메스 날 두 개를 사용하여 조직을 잘게 다집니다. 그런 다음 페트리 접시에 담긴 다져진 조직에 Dnase papain 혼합물 2.5 milliliters를 추가합니다.

페트리 접시를 가볍게 돌려 모든 조직이 용액 내에서 자유롭게 움직이며 접시 바닥에 달라붙지 않았는지 확인합니다. 그 후 37 °C의 인큐베이터에 접시를 넣고 15분 동안 둡니다. 바이오후드 내에서 멸균된 광구 전송 피펫(wide-bore transfer pipette)을 사용하여 모든 배지와 조직을 5 mL 멸균 냉동 보관 튜브로 옮깁니다.

동일한 전이 피펫의 팁을 튜브 바닥 가까이 두고, 혼합물을 10~15회 부드럽게 피펫팅합니다. 그다음 따뜻하게 데운 DMEM 5/5 2 mL를 분리된 세포 혼합물에 추가하고 원심분리 튜브의 캡을 닫습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한 후, 상온에서 573 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

바이오후드 내에서 펠릿이 손상되지 않도록 모든 상층액을 제거합니다. 그 후, 튜브 내의 펠릿에 가온된 DMEM 5/5 1 mL를 첨가하여 세포를 재부유시킵니다. 멸균된 소구경 트랜스퍼 피펫을 사용하여 혼합물이 균질해질 때까지 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 풀어줍니다.

그런 다음 세포 현탁액 10 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 바이오후드 외부에서, 마이크로 원심분리 튜브에 들어있는 세포 현탁액 10 µL에 트립판 블루 10 µL를 추가합니다. 그런 다음 세포 수를 세기 위해 트립판 블루 세포 현탁액 10 µL를 일회용 헤모사이토미터 칩에 로딩합니다.

생물안전작업대(biohood) 내에서 멸균된 마이크로파이펫을 사용하여 세포 현탁액 50 µL를 각 어레이의 중앙과 각 대조군 페트리 접시에 분주합니다. 그 다음, 덮개가 덮인 페트리 접시를 37 °C로 설정된 배양기에 넣고 3~4시간 동안 배양합니다. 이어서, 가온된 DMEM 5/5 1 mL를 각 MEA에 조심스럽게 첨가합니다.

배지를 MEA의 안쪽 가장자리를 따라 한 방울씩 조심스럽게 첨가하며, 배열 중심에서 세포가 씻겨 내려가지 않도록 주의하십시오. 그 후, 가스 투과성 FEP 막이 포함된 캡을 각 MEA에 씌운 다음 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 이틀 후, 디쉬에서 배지를 뽑아내어 따뜻하게 데운 DMEM+로 배지를 완전히 교체하십시오.

피펫 팁을 내부 벽면에 조심스럽게 대고, 따뜻하게 데운 DMEM+ 1 mL를 분주합니다. 이후의 배양액 교체 시에는 디쉬에서 배지 500 µL를 뽑아내고, 따뜻하게 데운 DMEM+ 500 µL를 다시 분주합니다. 이 과정에서 이틀마다 현미경으로 디쉬 샘플을 관찰하여 어레이 위의 세포 피복 상태와 박테리아 또는 진균 오염 여부를 확인합니다. 배양물을 인큐베이터에서 꺼내기 전, 온도 컨트롤러의 전원을 연결하고 시스템을 켜서 프리앰프의 가열 베이스플레이트가 35 °C에 도달하도록 합니다.

그런 다음 캡을 씌운 배양물을 프리앰플리파이어에 배치하여, MEA 웰의 검은색 선이 기준 접지(reference ground)와 일치하도록 합니다. 프리앰플리파이어 핀이 정렬되어 프리앰플리파이어 상단이 고정되고 배양물 캡이 그대로 유지되었는지 확인하십시오. 다음으로, 소프트웨어 환경에서 시작 버튼을 눌러 신호 시각화를 시작합니다.

메인 창에서 Spikes, Detection, Automatic을 선택하고 표준 편차 값을 -5로 변경한 후 Refresh를 클릭하여 임계값을 재설정합니다. 신호를 시각화한 후 Stop, Record, Play를 클릭하여 활동 기록을 시작합니다. 배아 마우스 뉴런을 60 채널 MEA에 플레이팅하며, 이를 통해 각 전극으로부터 네트워크 전체의 뉴런 활동을 동시에 기록할 수 있습니다.

훈련 전후 자극에 반응하는 8개 전극의 활동을 나타낸 대표적인 래스터 플롯입니다. 수직 빨간색 선은 자극 시간을 나타내며, 검은색 표시(tick marks)는 활동 전위를 나타냅니다. 훈련 전에는 모든 채널에서 자극 펄스에 대해 즉각적인 반응이 나타납니다.

훈련 후, 네트워크는 자극에 대한 즉각적인 반응뿐만 아니라 더 연장된 활동 반응을 보입니다. 여기에 12개의 훈련된 네트워크와 10개의 대조군 네트워크의 평균값이 표시되어 있으며, 훈련된 네트워크는 유의미하게 변화된 스파이크 빈도를 나타냅니다. 이 영상을 시청하신 후에는 배아 생쥐로부터 신경 조직을 분리하고 결합하는 방법과 마이크로전극 어레이를 사용하여 신경 네트워크를 배양, 기록 및 자극하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.