Name: 미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 미세 전극 배열에서 E17 마우스 신경 세포를 배양하고 자극하여 네트워크 역학을 연구하는 방법을. 이 기술은 학습과 기억의 기본 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 보조금 CMMI - 1300007에 의해 재정 지원되었다. 우리는 조지 메이슨 대학교 (George Mason University)에서 이러한 프로토콜의 설계 및 문화 유지에 도움을 주신 이전 연구원들에게 감사드립니다. Joseph J. Pancrazio 박사, Hamid Charkhkar 박사, Gretchen Knaack 박사 , Franz Hamilton 박사, Michael Maquera 박사, Robert Graham 박사.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에 설명 된 단계는 초보자가 MEA에서 자신의 연결 문화를 판명하고 네트워크 활동을 기록 할 수 있도록 충분한 세부 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 문화가 전극 배열 위에 세포의 양탄자 층을 형성하고, 건강을 유지하고 몇 달 동안 오염 물질이 없도록 적절하게 부착하는 것을 보장합니다. 프로토콜의 모든 부분을 준수하는 것이 가장 좋지만 성공적인 결과에 중요한 단계가 프로세스 전반에 걸쳐 있습니다. 배양 물이 오염되는 것을 막기 위해서는 전체 공정에 걸쳐 무균 기술을 사용해야합니다. 프로토콜에 설명 된대로 새로운 MEA를 친수성으로 만들어야합니다. 그렇지 않으면 세포 접착력이 떨어집니다. 가혹한 피펫 팅을 피하고 해리 중에 공기 방울이 형성되면 손상된 세포의 수가 줄어들어 더 높고 더 건강한 수율로 이어질 것입니다. 첫 번째 이후 DMEM 5/5에서 DMEM +로 전환먹이는 것도 중요합니다. DMEM 5/5에는 말 혈청이 포함되어있어 지속적으로 사용하면 신경 교세포가 배양을 지배하게되어 문화가 건강 해 보일지라도 열악한 신경 세포 활동을 초래합니다. 예정대로 배양액을 공급하고 적절한 배양 조건에서 배양하는 것도 중요합니다. MEA에서 세포 배양 판을 만드는 것은 최적의 결과가 아닌 결과를 가져올 수있는 많은 변수를 포함합니다. 목표가 세포의 완벽한 &quot;양탄자&quot;이지만, 위에 언급 된 중요한 단계를 해결하지 못하면 세포 성숙이 불량 해지거나 오염 될 수 있습니다. 가난한 세포 성숙과는 다른 세포 접착력이 나쁘다는 것도 관심사입니다. 이것은 도금 이전의 불량한 MEA 준비 또는 오래된 매체의 사용을 포함하는 여러 요인들로 인해 발생할 수 있습니다. 안정화 된 형태의 L- 글루타민과 혈청이없는 신경 세포 배양액을 함유 한 오래된 배지 ( 물질 표)가 사용되면, 세포는 처음에 붙지 만 약 2 주 후에 떠 다니게됩니다. 세균 오염이 지속적으로 문제가된다면 암피실린이나 펜 렙틴과 같은 항생제를 배지에 첨가 할 수 있습니다. 곰팡이 오염을 치료할 수있는 살균제도 있습니다. 이것들은 문화적 결과에 영향을 줄 수있는보다 일반적인 변수입니다. 시간과 경험 후에 만 ​​만날 수있는 많은 다른 것들이 있습니다. 유리 미세 전극의 사용과 비교하여,이 기법은 네트워크 역학 및 약리학 적 반응을 연구하는데 탁월합니다. 그것은 많은 다른 시공간 자극 패턴의 사용을 가능하게하고 동시에 여러 영역에서의 신경 반응을 기록 할 수있게합니다. 이전 그룹은 여기에 설명 된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 흥미로운 결과를 보여주었습니다 18 . 문화가 몇 주 또는 몇 달 동안 지속되고 동일한 문화가 재사용 될 수 있기 때문에이 기술은 또한동일한 네트워크에서 여러 실험을 반복합니다. 그러나이 기술에는 한계가 있습니다. MEA는 비 침습적입니다. 따라서 패치 클램핑이나 피펫을 사용한 세포 내 기록과는 달리 세포 외 활동 만 기록 할 수 있습니다. 또한, 배열의 각 전극은 여러 개의 세포로 덮여 있기 때문에 단일 뉴런의 활동을 해결할 수 없습니다. 반대로 이것들은 시험 관내 배양 물이기 때문에 뇌에서의 네트워크의 구조적 특성을 완전히 재현 할 수는 없습니다. 또한, 세포가 pH 균형을 유지할 수 있도록 CO 2 대기를 제공하는 메커니즘없이 한 번에 30 분 이내에 만 활동을 기록 할 수 있습니다. 일단이 기술이 숙달되면, 전기 자극이 있거나없는 약리학 적 조작이 탐구 될 수 있습니다. 뉴런 네트워크에서 학습과 기억 형성을 탐색하기위한 새로운 프로토콜을 설계하고 테스트 할 수 있습니다.hippocampal 또는 척수 네트워크에 대한 rotoci. 네트워크의 자극과 훈련을위한 프로토콜은 이미 발표되었으며, 그 중 일부는 Eytan et al.이 제안한 &quot;선택적 적응&quot;과 같은 생체 내 프로토콜로 추가 개발 되었다. 19 . 여러 프로토콜이 테스트되었습니다. 그러나 2005 년 루아로 (Ruaro)가 제안한 파상풍 치료법을 수정 한 결과 만이 여기에 제시되어있다.

Micro-electrode arrays (MEAs)는 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 1 . 단일 세포에서의 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑 (patch-clamping)과 단일 장소에서 전극을 둘러싸고있는 뉴런의 세포 외 반응을 기록 할 수있는 유리 피펫으로 필드 기록 (record recording)과 같은 전통적인 방법과 대조적으로 MEA는 동시에 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을하지 않고도 세포 배양의 여러 사이트에서 기록 할 수 있습니다. 이를 통해 해당 문화권 내에서 네트워크를 형성하는 세포 그룹 간의 동적 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 또한, 네트워크 소성 패턴 2 , 3 , 4 , 5 및 네트워크 제어 6 에 대한 전기 자극의 효과 &lt;/ sup&gt;는 잘 설명되어 있으며, 동일한 실험 설정 내에서 다양한 전기 자극 및 제어 구성을 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 시공간 역학을 탐구 할 수 있습니다. 이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13을 나타내는 속성을 나타내는 정도였습니다. Peixoto Lab은 이전에 Ruaro et al. 에 설명 된대로 고주파 훈련 신호의 영향을 조사했습니다 . 14 , microelectrode 배열에 도금 마우스 뉴런의 네트워크에. 이 실험에서 네트워크는 응답의 증가g 전기 자극에 의해 유발 된 훈련. 증가 된 반응은 자극 인식을 통한 학습의 한 형태로 간주되어 네트워크가 특정 자극 ( 예 : 훈련) 프로토콜을 적용한 후 자극의 변화에 ​​일관된 방식으로 응답했습니다. 이 프로토콜은 MEA에서 연결 세포를 배양하고 도금 된 접시의 95 % 이상에서 성공적으로 기록하고, 자극 패턴, 단일 단위 활동 정렬, 플롯 히스토그램에 응답하도록 네트워크를 훈련하는 프로토콜을 확립하고 결과를 해석하는 방법을 보여줍니다. 그러한 실험. 신경 세포 배양의 자극과 기록을위한 독점 시스템 ( Table of Materials 참조)의 사용뿐만 아니라 소프트웨어 패키지 ( Table of Materials 참조)를 사용하여 신경 단위를 분류 할 수 있습니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스 (재료 표 참조)를 사용하여 포스트 S를 시각화합니다.시간 간격 히스토그램, 인터 - 버스트 간격 및 버스트 지속 시간뿐만 아니라 훈련 프로토콜 전후에 자극에 대한 세포 반응을 비교할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마 알드리치</td><td>A4403</td> 신경 세포 배양을 위한 <td>4mg/mL 분취</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td> 무<td>혈청 보충제를 만듭니다. 1mL 분취액을 만들고 비</td></tr><tr><td>커 - 유리 - 100mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>비커 - 유리 - 500mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>뭉툭한 엄지 집게 World</td><td>Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 - 멸균, 2mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 - 멸균, 5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>안정화된 형태의 L-글루타민 DNase를 포함하는 세포 배양 배지</td></tr><tr><td></td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>끝이 가는 엄지 집게</td><td>World Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td> 안정화된 <td>형태의 L-글루타민이</td></tr><tr><td>혈액 세포 분석기 칩</td>으로 사용됩니다. <td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB complete</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2 세포 저장 매체</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>애틀랜타 생물학 제제</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마 알드리치</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS 필터 증폭기</td><td>다중 채널 시스템</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS 헤드 스테이지 / 프리 앰프</td><td>다중 채널 시스템</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS 미세 전극 어레이</td><td>다중 채널 시스템</td><td>60MEA200 / 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS 전원 공급 장치</td><td>다중 채널 시스템</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS 신호 분배기</td><td>다중 채널 시스템</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS 자극 발생기</td><td>다중 채널 시스템</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS 온도 컨트롤러</td><td>다중 채널 시스템</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>미디어 보관 병 - 유리 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로원심분리기 튜브 - 0.4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로원심분리기 튜브 - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 - 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 - 1,000 &mu; 엘&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 - 200 &mu; 엘&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>마이크로피펫터 - 10 & 엘&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터 - 1,000 &mu; 엘&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터 - 200 & 엘&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papain - 0.22 여과된</td><td>Worthington 생화학</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시 -100 mm 일회용</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시 -100 mm 유리</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시 -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 세척 시스템</td><td>플라즈마 에칭, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신 하이드로브로마이드(PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 원추형(원심분리기) 튜브 -15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원추형(원심분리기) 튜브 -50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>절차용 마스크</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>피루베이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>세계 정밀 기기</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>가위 - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>가위 - 대형</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>가위 - 소형 수술</td>용 <td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 - sterile, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 - 멸균, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 - 멸균, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 - 멸균, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>.mat 파일을 분석하는 데 사용됩니다.&nbsp; 요청 시 무료로 제공됩니다.&nbsp; 사본을 요청하려면 npeixoto@gmu.edu 연락하십시오.</td></tr><tr><td>소프트웨어: MCS MC_Rack</td><td>멀티채널 시스템</td><td>N/A</td><td>데이터 수집에 사용</td></tr><tr><td>소프트웨어: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>.nex 파일을 .mat 소프트웨어로 변환하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>신경 스파이크를 정렬하고 데이터 파일을 .plx로 변환한 다음 .nex로 변환하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>소프트웨어 설명서: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>소프트웨어 설명서: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>소프트웨어 매뉴얼: 오프라인 분류기</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>스패튤라 - 소형 양면</td><td>세계 정밀 기기</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &마이크로; m pore 필터 - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette - 대형 보어&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>전송 피펫 - 스몰 보어&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>유리 페트리 접시에 8개의 파이 웨지로 자르고 오토클레이브</td></tr></tbody></table>

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

마이크로 전극 배열 (MEAs)은 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는데 사용될 수 있습니다. 단일 세포에서 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑과 같은 기존의 방법과 달리 MEA는 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을 수행하지 않고도 네트워크의 여러 사이트에서 동시에 기록 할 수 있습니다. 더욱이, 수많은 제어 및 자극 구성을 동일한 실험 설정 내에서 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 역학을 탐구 할 수 있습니다. 이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습을 나타내는 특성을 나타내는 범위였습니다. MEA에서 배양 된 마우스의 신경 세포는 전기적 자극에 의해 유도 된 훈련 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 MEA에서 신경 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 성공적으로 다시도금 된 접시의 95 % 이상에서 코드; 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립한다. 그러한 실험의 결과를 정렬, 플롯 및 해석합니다. 신경 세포 배양을 자극하고 기록하기위한 독점 시스템의 사용이 입증되었습니다. 소프트웨어 패키지는 또한 연결 단위를 정렬하는 데 사용됩니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스는 자극 후 시간 히스토그램, 인터 버스트 간격 및 버스트 지속 시간을 시각화하고 훈련 프로토콜 전후의 자극에 대한 세포 반응을 비교하는 데 사용됩니다. 마지막으로,이 연구 노력의 대표 결과 및 향후 방향에 대해 논의한다.

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

본 절차의 전반적인 목표는 E17 마우스 신경 조직을 분리 및 결합하여, 미세전극 어레이(microelectrode arrays) 상에서 신경망을 배양, 기록 및 자극하는 것입니다. 이 방법은 학습과 기억의 기본 메커니즘과 관련된 네트워크 역학 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세전극 어레이가 여러 지점에서 동시에 기록할 수 있어, 기존의 단일 지점 유리 피펫 기록 방식에 비해 더 나은 공간적 및 시간적 해상도를 제공할 수 있다는 점입니다.이 방법은 학습 및 기억의 네트워크 역학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 약물 독성을 조사하거나 차세대 맞춤형 의료를 위한 패러다임을 설계하는 데에도 활용될 수 있습니다. 해부 및 해리 과정 중의 조직 조작은 단순히 프로토콜을 읽는 것만으로는 배우기 어렵기 때문에, 이 과정에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 어레이를 준비하려면 멸균 피펫 팁을 사용하여 각 MEA 중앙에 해동된 laminin 40~50 마이크로리터를 추가하고, 대조군 플레이트에는 laminin 0.2 밀리리터를 추가하십시오.바이오후드 내의 모든 MEA와 대조군 디쉬를 덮고, 37 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 멸균 파스퇴르 피펫을 이용한 흡입 방식으로 MEA 중앙의 과잉 라미닌을 조심스럽게 제거하고, 세포 분주 전 표면을 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, 100 mm 페트리 디쉬 4개에 L-15 배지를 붓고 덮개를 덮은 뒤, 배지가 완전히 얼지 않고 슬러시 상태가 될 때까지 -20 °C 냉동고에서 약 40~60분 동안 보관합니다.해부를 준비하기 위해, 유리 페트리 접시를 얼음이 가득 담긴 트레이 위에 뒤집어 놓습니다. 이제 동물의 하복부에 70% ethanol을 분무합니다. 작은 수술용 가위를 사용하여 하복부의 피부와 피하 지방을 V자 모양으로 절개하고, 절개 부위를 흉강의 원위단까지 확장하여 자궁을 노출시킵니다.포셉을 사용하여 배아 사이의 자궁을 조심스럽게 들어 올립니다. 전체 자궁이 완전히 분리될 때까지 해부용 가위로 결합 조직을 절단합니다. 그런 다음 70% ethanol로 자궁을 빠르게 헹구어 혈액을 제거하고, 차가운 L-15가 채워진 4개의 페트리 접시 중 하나에 넣습니다.그 후, 두 쌍의 미세 팁 핀셋을 사용하여 각 배아를 자궁과 내부 배아낭에서 분리합니다. 분리된 배아를 차가운 L-15가 가득 담긴 두 번째 디쉬에 넣은 다음, 머리 부분은 세 번째 페트리 접시로, 몸통 부분은 네 번째 접시로 옮깁니다. 바이오후드 내의 냉각된 유리 페트리 접시 스테이지 위에 오토클레이브 멸균된 필터 페이퍼 조각을 놓고, 그 위에 배아 머리 하나를 올립니다.다음으로 아이리스 가위의 하단 날 끝을 두개골 기저부에 위치시키고, 하단 날을 두개골 내면과 밀착시켜 뇌와 떨어뜨린 상태에서 후두판을 절개한 후 두 정수리판 사이의 정중선을 따라 절개합니다. 연골성 전두 두개판 사이를 따라 전방으로 절개를 계속합니다. 그런 다음 후두판 중심에서 시작하여, 중심 절개선을 기준으로 왼쪽과 오른쪽으로 수직 절개를 수행합니다.그 후, 작은 스패튤라를 뇌의 복측 표면과 두개골 바닥판 사이에 조심스럽게 밀어 넣어 스패튤라가 뇌 아래에 완전히 위치하도록 합니다. 그런 다음 스패튤라를 들어 올려 뇌를 제거합니다. 깨끗한 스패튤라를 사용하여 먼저 후각구(olfactory bulb)를 제거한 다음, 전두엽을 사다리꼴 패턴으로 절개합니다.다음으로, 조직을 보관 배지가 들어 있는 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 과정에서 멸균된 메스 날 두 개를 사용하여 조직을 잘게 다집니다. 그런 다음 페트리 접시에 담긴 다져진 조직에 Dnase papain 혼합물 2.5 milliliters를 추가합니다.페트리 접시를 가볍게 돌려 모든 조직이 용액 내에서 자유롭게 움직이며 접시 바닥에 달라붙지 않았는지 확인합니다. 그 후 37 °C의 인큐베이터에 접시를 넣고 15분 동안 둡니다. 바이오후드 내에서 멸균된 광구 전송 피펫(wide-bore transfer pipette)을 사용하여 모든 배지와 조직을 5 mL 멸균 냉동 보관 튜브로 옮깁니다.동일한 전이 피펫의 팁을 튜브 바닥 가까이 두고, 혼합물을 10~15회 부드럽게 피펫팅합니다. 그다음 따뜻하게 데운 DMEM 5/5 2 mL를 분리된 세포 혼합물에 추가하고 원심분리 튜브의 캡을 닫습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한 후, 상온에서 573 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.바이오후드 내에서 펠릿이 손상되지 않도록 모든 상층액을 제거합니다. 그 후, 튜브 내의 펠릿에 가온된 DMEM 5/5 1 mL를 첨가하여 세포를 재부유시킵니다. 멸균된 소구경 트랜스퍼 피펫을 사용하여 혼합물이 균질해질 때까지 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 풀어줍니다.그런 다음 세포 현탁액 10 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 바이오후드 외부에서, 마이크로 원심분리 튜브에 들어있는 세포 현탁액 10 µL에 트립판 블루 10 µL를 추가합니다. 그런 다음 세포 수를 세기 위해 트립판 블루 세포 현탁액 10 µL를 일회용 헤모사이토미터 칩에 로딩합니다.생물안전작업대(biohood) 내에서 멸균된 마이크로파이펫을 사용하여 세포 현탁액 50 µL를 각 어레이의 중앙과 각 대조군 페트리 접시에 분주합니다. 그 다음, 덮개가 덮인 페트리 접시를 37 °C로 설정된 배양기에 넣고 3~4시간 동안 배양합니다. 이어서, 가온된 DMEM 5/5 1 mL를 각 MEA에 조심스럽게 첨가합니다.배지를 MEA의 안쪽 가장자리를 따라 한 방울씩 조심스럽게 첨가하며, 배열 중심에서 세포가 씻겨 내려가지 않도록 주의하십시오. 그 후, 가스 투과성 FEP 막이 포함된 캡을 각 MEA에 씌운 다음 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 이틀 후, 디쉬에서 배지를 뽑아내어 따뜻하게 데운 DMEM+로 배지를 완전히 교체하십시오.피펫 팁을 내부 벽면에 조심스럽게 대고, 따뜻하게 데운 DMEM+ 1 mL를 분주합니다. 이후의 배양액 교체 시에는 디쉬에서 배지 500 µL를 뽑아내고, 따뜻하게 데운 DMEM+ 500 µL를 다시 분주합니다. 이 과정에서 이틀마다 현미경으로 디쉬 샘플을 관찰하여 어레이 위의 세포 피복 상태와 박테리아 또는 진균 오염 여부를 확인합니다. 배양물을 인큐베이터에서 꺼내기 전, 온도 컨트롤러의 전원을 연결하고 시스템을 켜서 프리앰프의 가열 베이스플레이트가 35 °C에 도달하도록 합니다.그런 다음 캡을 씌운 배양물을 프리앰플리파이어에 배치하여, MEA 웰의 검은색 선이 기준 접지(reference ground)와 일치하도록 합니다. 프리앰플리파이어 핀이 정렬되어 프리앰플리파이어 상단이 고정되고 배양물 캡이 그대로 유지되었는지 확인하십시오. 다음으로, 소프트웨어 환경에서 시작 버튼을 눌러 신호 시각화를 시작합니다.메인 창에서 Spikes, Detection, Automatic을 선택하고 표준 편차 값을 -5로 변경한 후 Refresh를 클릭하여 임계값을 재설정합니다. 신호를 시각화한 후 Stop, Record, Play를 클릭하여 활동 기록을 시작합니다. 배아 마우스 뉴런을 60 채널 MEA에 플레이팅하며, 이를 통해 각 전극으로부터 네트워크 전체의 뉴런 활동을 동시에 기록할 수 있습니다.훈련 전후 자극에 반응하는 8개 전극의 활동을 나타낸 대표적인 래스터 플롯입니다. 수직 빨간색 선은 자극 시간을 나타내며, 검은색 표시(tick marks)는 활동 전위를 나타냅니다. 훈련 전에는 모든 채널에서 자극 펄스에 대해 즉각적인 반응이 나타납니다.훈련 후, 네트워크는 자극에 대한 즉각적인 반응뿐만 아니라 더 연장된 활동 반응을 보입니다. 여기에 12개의 훈련된 네트워크와 10개의 대조군 네트워크의 평균값이 표시되어 있으며, 훈련된 네트워크는 유의미하게 변화된 스파이크 빈도를 나타냅니다. 이 영상을 시청하신 후에는 배아 생쥐로부터 신경 조직을 분리하고 결합하는 방법과 마이크로전극 어레이를 사용하여 신경 네트워크를 배양, 기록 및 자극하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

대뇌 피질의 임계 상태 역학 지표의 연결 눈사태, 즉 스케일 - 불변량 spatio - 관자놀이 활동 파열을 연구하는 강력한 방법입니다. 눈사태 정확하게 제어 조건 하에서 평면 통합 다중 전극 어레이 (MEA)와 활동의 장기 측정을 허용 교양 피질의 표면 레이어를 개발에 자발적으로 등장.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

환경 독 소에 노출 수 있습니다 심하게 발전 태아에 영향을. 내 분 비 혼란 시키는 화학 제품 bisphenols 부정적인 알려져 있습니다와 같은 신 경계에 영향을. 여기는 초기 배아에 독 소 노출의 기능에 미치는 영향을 연구 하는 생체 외에서 (병아리 태아) 척추 신경 네트워크 모델을 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다.

내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

학습하세요 미세 전극 배열에서 E17 마우스 신경 세포를 배양하고 자극하여 네트워크 역학을 연구하는 방법을. 이 기술은 학습과 기억의 기본 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

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