미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 절차의 전반적인 목표는 미세 전극 어레이에서 신경 네트워크를 배양, 기록 및 자극하기 위해 E17 마우스 신경 조직을 분리하고 연결하는 것입니다. 이 방법은 학습 및 기억의 기본 메커니즘과 관련이 있기 때문에 네트워크 역학 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마이크로 전극 어레이가 여러 사이트에서 동시에 기록할 수 있으므로 단일 사이트 기록에서 기존의 유리 피펫에 비해 더 나은 공간적, 시간적 해상도를 제공할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 학습 및 기억의 네트워크 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약물 독성을 조사하거나 차세대 맞춤형 의학을 위한 패러다임을 설계하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 과정을 시각적으로 보여주는 것은 매우 중요한데, 해부 및 해리 과정에서 조직을 조작하는 것은 단순히 프로토콜을 읽는 것만으로는 배우기 어렵기 때문입니다. 어레이를 준비하려면 멸균 피펫 팁을 사용하여 각 MEA의 중앙에 40-50마이크로리터의 해동된 라미닌을 추가하고 0.2ml의 라미닌을 대조 플레이트에 추가합니다.

바이오후드의 모든 MEA와 대조군 접시를 덮고 섭씨 37도의 인큐베이터로 1시간 동안 옮깁니다. 1시간 후, 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 MEA 중심에서 과도한 라미닌을 조심스럽게 제거하고 도금하기 전에 표면을 자연 건조시킵니다. 다음으로, L-15 배지를 4개의 100mm 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 덮은 다음 매체가 슬러시 농도를 갖지만 단단하게 얼지 않을 때까지 섭씨 영하 20도의 냉동고에 약 40-60분 동안 넣습니다.

해부를 준비하려면 얼음이 가득 찬 쟁반에 유리 페트리 접시를 뒤집어 놓습니다. 이제 동물에게 70 % 에탄올을 하복부에 뿌립니다. 작은 수술용 가위를 사용하여 하복부의 피부와 피하 지방을 V자 모양으로 절개하여 흉강의 말단 끝까지 절단을 확장하고 자궁을 노출시킵니다.

겸자를 사용하여 배아 사이의 자궁을 조심스럽게 들어 올립니다. 자궁 전체가 자유로워질 때까지 해부 가위로 결합 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 자궁을 70% 에탄올로 짧게 헹구어 혈액을 제거한 다음 차가운 L-15로 채워진 4개의 페트리 접시 중 하나에 넣습니다.

그런 다음, 끝이 가는 두 쌍의 집게를 사용하여 자궁과 내부 배아 주머니에서 각 배아를 방출합니다. 방출된 배아를 차가운 L-15로 가득 찬 두 번째 접시에 넣고, 머리는 세 번째 페트리 접시에, 몸체는 네 번째 접시에 옮긴다. 바이오후드에서 냉각된 유리 페트리 접시 스테이지에 오토클레이브 여과지 쐐기를 놓고 여과지에 배아 머리 하나를 놓습니다.

다음으로 홍채 가위의 하부 전단기의 절단면을 두개골 기저부에 삽입하고 하부 전단기를 두개골의 내부 표면에 대고 뇌에서 멀리 떨어진 상태로 한 다음 후두판을 절단한 다음 두정판 사이의 정중선을 따라 절단합니다. 연골 전두골 플레이트 사이를 가로로 계속 절단합니다. 그런 다음 후두판의 중심에서 시작하여 중앙 절단의 왼쪽과 오른쪽으로 수직 절단을 만듭니다.

그런 다음 뇌의 복부 표면과 아래쪽 두개골 판 사이에 작은 주걱을 완전히 뇌 아래에 올 때까지 조심스럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 주걱을 들어 올려 뇌를 제거합니다. 깨끗한 주걱을 사용하여 먼저 후각구를 제거한 다음 전두엽을 사다리꼴 패턴으로 절개합니다.

다음으로, 조직을 저장 매체가 들어 있는 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이 절차에서는 두 개의 멸균 메스 날을 사용하여 조직을 다집니다. 그런 다음 Dnase 파파인 혼합물 2.5ml를 페트리 접시의 다진 조직에 추가합니다.

페트리 접시를 부드럽게 휘젓어 용액에 모든 조직이 없고 접시 바닥에 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 15분 동안 놓습니다. 바이오후드에서는 멸균 광경 전사 피펫을 사용하여 모든 매체와 조직을 5mm 멸균 극저온 튜브로 옮깁니다.

동일한 전사 피펫의 끝을 튜브 바닥 가까이에 놓고 혼합물을 10-15회 부드럽게 표팅합니다. 그런 다음 해리된 세포 혼합물에 2ml의 데워진 DMEM 5/5를 넣고 원심분리 튜브를 닫습니다. 반전으로 부드럽게 혼합하고 실온에서 573 회 g으로 5 분 동안 원심 분리하십시오.

바이오후드에서 팔레트를 깨지 않고 모든 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 1ml의 가열된 DMEM 5/5를 튜브의 팔레트에 추가하여 셀을 다시 현탁시킵니다. 멸균 소구경 이송 피펫을 사용하여 혼합물이 균일해질 때까지 위아래로 부드럽게 파이프를 연결하여 팔레트를 분해합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 바이오후드 바깥쪽에서 마이크로원심분리기 튜브의 10마이크로리터 세포 현탁액에 10마이크로리터의 트리판 블루를 추가합니다. 그런 다음 세포를 계수하기 위해 10마이크로리터의 트리판 블루 셀 현탁액을 폐기 혈구계 칩에 로드합니다.

바이오후드에서 멸균 마이크로피펫을 사용하여 50마이크로리터의 세포 현탁액을 각 어레이의 중앙으로 옮기고 각 제어 페트리 접시를 제어합니다. 그런 다음 뚜껑을 덮은 페트리 접시를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 3-4시간 동안 놓습니다. 다음으로, 예열된 DMEM 5/5 1ml를 각 MEA에 부드럽게 첨가합니다.

MEA의 내부 가장자리 주위에 한 번에 한 방울씩 매체를 조심스럽게 추가하고 어레이 중심에서 세포를 씻어내지 마십시오. 그런 다음 인큐베이터로 되돌리기 전에 각 MEA에 가스 투과성 FEP 멤브레인이 들어 있는 캡을 놓습니다. 이틀 후, 접시에서 배지를 꺼내 데운 DMEM+로 매체를 완전히 교체합니다.

피펫 끝을 내벽에 조심스럽게 놓고 1ml의 가열된 DMEM+을 분배합니다.후속 공급을 위해 접시에서 500마이크로리터의 배지를 꺼내고 500마이크로리터의 가열된 DMEM+를 다시 분배합니다. 이 절차에서는 격일로 현미경으로 접시 샘플을 검사하여 어레이 전체의 세포 범위와 박테리아 또는 곰팡이에 의한 오염을 확인합니다. 인큐베이터에서 배양물을 꺼내기 전에 온도 조절기를 연결하고 시스템을 켜서 프리앰프의 가열된 바닥판이 섭씨 35도에 도달하도록 합니다.

그런 다음 캡이 있는 배양물을 프리앰프에 배치하여 MEA 웰의 검은색 선이 기준 접지와 정렬되도록 합니다. 프리앰프 핀이 프리앰프 상단이 정렬되어 앰프가 고정되어 있고 배양 캡이 여전히 켜져 있는지 확인합니다. 그런 다음 소프트웨어 환경에서 시작을 눌러 신호 시각화를 시작합니다.

주 창에서 스파이크, 감지, 자동을 선택하고 표준 편차 값을 마이너스 5로 변경한 다음 새로 고침을 클릭하여 임계값을 재설정합니다. 신호를 시각화한 후 Stop(중지), Record(기록) 및 Play(재생)를 클릭하여 활동 기록을 시작합니다. 배아 마우스 뉴런은 60채널 MEA에 도금되어 있어 각 전극에서 네트워크를 통해 뉴런 활동을 동시에 기록할 수 있습니다.

다음은 훈련 전과 훈련 후의 자극에 대한 반응으로 8개의 전극에서 나오는 활동의 대표적인 래스터 플롯입니다. 빨간색 세로선은 자극의 시간을 나타내고 검은색 눈금 표시는 활동 전위를 나타냅니다. 사전 훈련에서는 채널을 가로지르는 자극 펄스에 대한 즉각적인 반응이 있습니다.

훈련 후, 네트워크는 자극에 대한 즉각적인 반응뿐만 아니라 더 장기적인 활동 반응을 보입니다. 여기에 표시된 것은 12개의 훈련된 네트워크와 10개의 제어 네트워크의 평균이며, 훈련된 네트워크는 크게 변경된 스파이크 주파수를 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배아 마우스에서 신경 조직을 분리하고 연결하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 미세 전극 어레이에서 신경 세포망을 배양, 기록 및 자극할 수 있어야 합니다.