Name: 복부 색소 침착 정량화 Drosophila melanogaster (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 복부 색소 침착을 디지털 이미지 분석으로 정량화하는 방법을. 비파괴 측정으로 진화생물학 및 형태학적 변이 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 National Science Foundation에서 IOS-1256565 및 IOS-1557638을 AWS에 기부하여 지원되었습니다. 우리는 Patricia Wittkopp과 3 명의 익명의 평론가들에게이 백서의 이전 버전에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다.

1. 시편 설치 참고 : 이미징하기 전에 죽은 파리를 물에 70 % 에탄올에 보관하십시오. <ol><li> 60 mm x 15 mm 페트리 접시에 끓는 물에 용해 된 1.25 % 한천 10 ML을 부어 그것을 설정할 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 젤의 표면에 ~ 20mm 옹이, 2mm 폭, 1mm 깊이 홈을 만들기 위해 미세 포인트 포셉 한 켤레를 사용합니다. 미세 포셉을 사용하여 성인 파리의 복부 측면을 그루브에 삽입하고 파리의 등쪽면을 젤 위에 돌출시킵니다. 참고 : 젤이 느슨하면 시편을 손상시키지 않고 쉽게 위치를 변경할 수 있습니다. 더럽고 부서지며 시간이 지나면 사용할 수 없지만 동일한 홈을 여러 표본에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 사용자는 동일한 젤에 다른 홈을 만들 수 있습니다. 각 접시는 200 파리를 이미지하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 물에서 70 % 에탄올로 표본을 완전히 덮어 왁스 같은 큐티클의 빛 반사를 줄이고 날개 손상을 방지하십시오.시험편 조작. </li></ol> 2. 현미경 설정 참고 : 이미지 수집 컨트롤 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 해부 범위, 전송 된 광원, 디지털 카메라 및 거위 목처럼 찬 광원을 사용하여 이미지를 수집합니다. 소프트웨어 지침은 ImageJ 45 를 통합 한 오픈 소스 소프트웨어 인 Micro-Manager v1.4.20 44 에만 해당됩니다. <ol><li> 현미경, 디지털 카메라, 이중 구즈넥 차가운 광원 및 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 이미지 캡처 소프트웨어를 실행하여 Micro-Manager 창과 ImageJ 창을 엽니 다. ImageJ 창에서 &quot;이미지&quot;&gt; &quot;유형&quot;&gt; &quot;8 비트&quot;를 클릭하여 모든 이미지를 8 비트로 설정하십시오. Micro-Manager 창에서 &quot;라이브&quot;를 클릭하면 카메라에서 실시간 미리보기를 보여주는 &quot;스냅 / 라이브&quot;창이 열립니다. <ol><li> &quot;스냅 / 라이브&quot;창의 크기를 최대화하십시오세서리. Micro-Manager 창의 &quot;Contrast&quot;탭에서 풀다운 &quot;Display mode&quot;메뉴에서 &quot;Grayscale&quot;을 선택하십시오. </li></ol></li><li> 차가운 광원을 최대 강도로 켜고 각 거위 목의 끝을 스테이지에서 약 120mm (왼쪽과 오른쪽에 각각 하나씩) 위치시킵니다. 참고 : 파리 복부 주위에 반사광이 울릴 수도 있지만 사용자는 환형 조명기를 사용할 수도 있습니다. </li><li> 수동으로 현미경 배율을 60X로 설정하여 시야에서 스테이지의 지름이 약 3mm 인 영역을 캡처합니다. </li><li> 스테이지에 2mm 무대 마이크로 미터를 놓습니다 (필요한 경우 배경을 흰색으로 전환). 실시간 미리보기를 보면서 무대 마이크로 미터에 초점을 맞추고 &quot;노출&quot;상자에 노출 시간을 ms 단위로 입력하여 마이크로 관리자 창에서 노출을 조정하십시오. </li><li> 공간적으로 카메라를 교정하려면 t에서 &quot;직선&quot;도구를 선택하십시오.그는 ImageJ 창을 열고 스테이지 마이크로 미터의 길이를 그립니다. ImageJ 윈도우에서 &quot;Analyze&quot;&gt; &quot;Set Scale&quot;을 클릭하여 &quot;Set Scale&quot;창을 열고 &quot;Known distance&quot;상자에 μm로 마이크로 미터의 길이를 입력 한 다음 &quot;Unit of length&quot; 상자. <ol><li> &quot;Set Scale&quot;창이 &quot;pixels / μm&quot;단위로 스케일을 표시하는지 확인하십시오. 눈금을 적어두고 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Snap / Live&quot;창에서 &quot;Stop&quot;을 클릭 한 다음 &quot;Snap&quot;을 클릭하여 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하십시오. </li><li> 필요한 경우 이미지를 다시 공간적으로 조정할 수 있도록 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 저장하십시오. ImageJ 윈도우에서 &quot;파일&quot;&gt; &quot;다른 이름으로 저장&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot;를 클릭하십시오. 파일 브라우저에서 파일을 저장할 위치를 지정하고 파일 이름을 지정하고 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 무대를 검은 색과 장소로 전환하십시오.무대에서 한천 (단계 1.1-1.2)에 탑재 비행을 들고 페 트리 접시. </li><li> 현미경을 통해보고 염소 패턴을 가장 잘 볼 수 있도록 등쪽 중간 선이 곧게 펴지도록 파리를 배치하십시오. 날개와 부속 장치를 움직여 복부의 시야가 방해받지 않도록하십시오. 색소 표피 (a2-a5)가 보이지 않으면 복부를 옆으로 꽉 짜내십시오 (물의 70 % 에탄올에 저장된 파리의 복부가 팽창하기 때문에 일반적으로 필요하지 않습니다). 참고 : 플라이를 배치 할 때 사용자는 더 낮은 배율 (20X)을 사용해야 할 수도 있습니다. 진행하기 전에 배율을 60X로 돌려 주어야합니다. </li><li> 파리의 등 복부에 수동으로 초점을 맞 춥니 다. 수동으로 광원의 팁을 조정하여 등 복부의 그림자와 반사를 최소화합니다. </li><li> 컴퓨터 화면에서 실시간 미리보기를보고 Micro-Manager 창의 &quot;대비&quot;탭에서 픽셀 값 막대 그래프를 사용하는 동안,단계 2.4에서 설명한대로 노출을 조정하여 미리보기 이미지의 픽셀 값 범위를 최대화하십시오. </li><li> 파리와 페트리 접시를 제거하고 플라이와 같은 위치에서 시야를 중심으로 전압계에 연결된 LED (430-660 nm의 스펙트럼 출력)로 교체하십시오. LED와 전압계를 광도계로 사용하고 LED에 닿는 빛에 의해 생성 된 전압을 기록하십시오 (~ 125 mV). 참고 : LED 및 전압계는 단일 실험 내에서 여러 이미징 세션에서 조명 수준이 일정하도록 보장하는 데 사용됩니다. </li><li> 실험 기간 동안 광원의 위치 나 강도, 현미경의 배율 또는 카메라의 노출을 더 이상 변경하지 마십시오. </li></ol> 3. 시편 이미징 <ol><li> 한천 (단계 1.1-1.3)에 검은 색 현미경 stage.Ajust에 장착 된 비행 자세를 유지 페트리 접시를 놓으십시오 제 3과 fourt복부 세그먼트가 보이고 지느러미 정중선은 단계 2.9에서 설명한대로 곧게 펴집니다. 진행하기 전에 배율이 60 배인지 확인하십시오. </li><li> 수동으로 세 번째와 네 번째 등 쪽 복부 tergites 초점에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 단계 2.6에서 설명한대로 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 얻습니다. 참고 : 이미지를 컬러로 캡처 한 다음 분석을 위해 그레이 스케일로 변환 할 수 있습니다. </li><li> 단계 2.7에서 설명한대로 이미지를 &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;로 저장하십시오. 참고 : [SESH]는 상수이고, [000]은 세션 번호이며 변수이지만 3 자릿수 여야하며 [sampleID]는 사용자가 원하는 모든 것이지만 추가 밑줄 (_) 문자를 포함 할 수는 없으며 일정한 길이 여야합니다. [표본 ID]는 색소 침착 데이터 ( 예 : 온도 또는 혈통) 분석에 사용 된 요소에 대한 세부 정보를 포함해야하며 특유한 비 알파벳하이픈 (-)과 같은 대문자. 이렇게하면 표준 통계 소프트웨어를 사용하여 [sampleID]에서 이러한 요소를 쉽게 파싱 할 수 있습니다. </li><li> 무대에서 페트리 접시를 제거하고 다음 표본과 파리를 교체하십시오. 조명 수준, 배율 또는 노출을 추가 조정하지 않고 모든 표본이 이미 찍힐 때까지 3.1-3.3 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 여러 세션에서 이미징 <ol><li> 이미지를 여러 세션으로 가져와야하는 경우 세션 전반에 걸쳐 광도, 노출 및 배율을 유지하십시오. 각 세션이 시작될 때 카메라의 공간 보정 (2.4 단계)과 스테이지의 광도 (LED / 전압계로 측정, 단계 2.12)를 확인하십시오. </li><li> 필요한 경우, 이미지를 공간적으로 다시 보정하는 기능을 보장하기 위해 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하고 저장합니다 (2.5-2.7 단계). </li><li> 적어도 15 개의 대조 표본을 사용하고 각 세션에서 무작위로 이미지를 재사용하십시오w를 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 세션 사이의 중복 대조 표본이 동일한 [표본 ID]이지만 [SESH000]이 서로 다른지 확인하십시오. 참고 : 대조 표본은 수집되어 저장되며 실험 시료와 동일하게 장착되지만 반복적으로 촬영됩니다. 정확한 대조 표본 수는 사용자의 실험 설정에 따라 달라집니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. </li></ol> 5. 이미지 분석 참고 : 이미지 분석은 ImageJ 45 에서 수행되며 &quot;Pigmentation.ijm 측정&quot;보조 매크로를 보조 파일로 사용합니다. <ol><li> 분석 할 모든 이미지를 같은 폴더에 놓습니다. </li><li> ImageJ를 시작하고 &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Run&quot;을 클릭하고 파일 브라우저에서 &quot;Pigmentation.ijm 측정&quot;을 선택한 다음 &quot;열다.&quot; 참고 : 모든 후속 단계는 매크로 내에 있습니다. 각 단계는 개별 매크로 명령입니다. </li><li> &quot;필요한 이미지를 저장할 폴더 선택&quot;이라는 &quot;작업 필요&quot;대화 상자가 열립니다. &quot;확인&quot;을 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 이미지가 들어있는 폴더를 선택한 다음 &quot;선택&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;필요한 작업을 저장할 폴더를 선택하십시오.&quot;라는 &quot;작업 필요&quot;대화 상자가 열립니다. &quot;OK&quot;를 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 염색 프로파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. &quot;선택&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 대화 상자가 열리면서 &quot;샘플 ID에 몇 개의 문자가 있습니까?&quot;라고 묻습니다. 데이터 입력 상자에 3.3에서 지정한대로 [SampleID]의 문자 수를 입력하고 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;ROI는 얼마나 넓습니까?&quot;라는 질문을하는 대화 상자가 열립니다. 데이터 입력 상자에 전방 십자형 커서의 픽셀 너비를 입력합니다.( 그림 1G , 그림 2A 및 2A &#39;의 녹색 직사각형)을 읽어야합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 기본값은 20 픽셀입니다. 참고 : 염색 프로파일은 머리카락과 털로 인한 노이즈를 줄이기 위해 줄보다는 큐티클 스트립을 통해 읽습니다. 이 스트립의 너비는 이미지의 해상도에 따라 다르지만 복부 폭의 1 / 20 ~ 1 픽셀이어야합니다. </li><li> 매크로가 첫 번째 파리의 이미지를 열고 대화 상자에 현재 파리를 측정할지 ( &quot;예&quot;클릭), 다음 파리로 이동 ( &quot;아니오&quot;클릭) 또는 매크로 ( &quot;취소&quot;를 클릭하십시오). </li><li> &quot;ANTERIOR에서 POSTERIOR로 지느러미 복부의 정중선을 정의하십시오.&quot;라는 대화 상자가 열립니다. &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽에서 뒤쪽까지 선 그리기등 쪽 복부의 정중선을 정의한다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39;, 황색 선을 참조하십시오. 참고 : 이것은 이미지의 방향을 변경하여 등 쪽 정중선이 화면에서 가로로 놓이고 왼쪽이 앞쪽에 오도록하여 후속 단계를 더 쉽게 만듭니다. </li><li> &quot;Tergite 4의 POSTERIOR 가장자리를 안료 밴드 바로 뒤에 정의하십시오.&quot;라는 대화 상자가 열립니다. &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 구형 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 안료 밴드 (표피 a5)의 후부 가장자리 바로 뒤쪽에 위치하도록합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39;, 마젠타 색 선을 참조하십시오. 참고 : R 스크립트는 색소 프로파일에서 안료 밴드의 후방 가장자리를 자동으로 감지합니다. </li><li> 대화 상자상자가 열리 며 &quot;착색 된 큐티클 (a2)의 앞쪽 가장자리에 Tergite 4의 원형 가장자리를 정의하십시오.&quot; &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 색소 표피 (표피 a2)의 앞쪽 가장자리에 놓 이도록합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39; , 시안 색 선을 참조하십시오. 참고 : R 스크립트는이 점을 표백제의 색소 표피의 앞쪽 가장자리로 정의합니다. 이미지에서 색소 침착 프로파일을 읽는 관심 영역 (ROI)이 매크로에 표시됩니다 (녹색 장방형, 그림 2A 및 2A &#39;, 그림 2B 및 2B &#39;에서 확대). 또한 매크로는 ROI에 대한 색소 침착 프로파일을 보여주는 두 번째 창을 엽니 다 ( Figur<html> e 2C 및 2C &#39;), 여기에서 x 축은 프로파일의 후방 모서리로부터의 픽셀 수로 표현되는 위치이고, y 축은 각 위치의 평균 픽셀 값입니다. </li><li> 매크로에 의해 열리는 착색 프로파일의 플롯을 봅니다. 필요한 경우 프로필 창에서 &quot;라이브&quot;를 클릭하여 색소 침착 프로파일에 영향을 줄 수있는 구조 ( 예 : 털)가 없도록 ROI 위치를 조정합니다. 프로필이 만족 스러우면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> Tergite 3에 대해 5.8-5.11 단계를 반복하십시오. 참고 : 매크로는 색소 프로파일을 두 개의 CSV 파일 (각각 &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;)로 내 보냅니다. 여기서 [SESH000_samplename]은 이미지 이름이고 [TX]는 세 번째 및 네 번째 표준의 경우 T3 또는 T4입니다. </li><li> 매크로는 다음 이미지를 엽니 다. 모든 이미지가 분석 될 때까지 5.7-5.13 단계를 반복하십시오. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 6. 데이터 전처리, 분석 및 세션 수정 참고 : 모든 데이터 분석은 R 47 에서 수행되며 제공된 &quot;Pigmentation.R&quot;분석 스크립트를 사용합니다. 아래에서 &quot;L ...&quot;은 분석의 각 부분에 대해 실행할 스크립트의 줄을 나타냅니다. 분석 수행 방법에 대한 추가 정보는 보충 정보를 참조하십시오. <ol><li> R 스크립트를 편집하여 작업 디렉토리 (L6)를 설정하고 .csv 프로파일이 들어있는 폴더 (L11)에 대한 파일 경로를 정의하십시오. </li><li> L13-15를 실행하여 프로필 폴더에 저장된 착색 프로필 목록을 생성하십시오. </li><li> 프로파일을 단일 데이터 프레임으로 읽으려면 &quot;reader&quot;및 &quot;addPrimaryKey&quot;기능 (L17-41)을로드하고 실행하십시오. </li><li> L43에서 스크립트를 편집하여 2.5 단계에서 결정한대로 μm / 픽셀 단위로 이미지의 공간 보정을 지정합니다. </li><li> &quot;adjus&quot;를로드하고 실행하십시오.그림 2C 와 2C &#39;의 프로파일 위치를 ROI의 픽셀 - 투 - 후 - 에지 (ROI)에서 ROI의 μm 전치로 변환하는 &quot;tments&quot;기능 (L46-58)과 (0 = 검정, 255 = 흰색)에서 색소 값 (0 = 색소 없음, 255 = 최대 색소)까지의 프로파일 값 (y 축, 그림 2C 및 2C &#39; </li><li> &quot;spline.der.er&quot;함수 (L60-71)를로드하고 실행하여 착색 프로파일과 그 첫 번째 및 두 번째 미분 ( 그림 2D -2F 및 2D &#39;- 2F &#39;)의 3 차 스플라인을 생성합니다. </li><li> 먼저 &quot;coord&quot;와 &quot;assmbly.coord&quot;함수 (L74-163)를 실행하여 안료 밴드의 후방 (T 3 )과 전방 (T 2 ) 모서리의 위치를 ​​추출합니다 ( 그림 2D 및 2D &#39;)와 a2 큐티클의 후단 모서리 (T1, 도 2D 및 2D &#39;)를 추출한 다음 T 3 및 T 1 에서 각각 취한 최대 (P max ) 및 최소 (P min ) 색소 값을 추출한다. 참고 : a2 큐티클의 앞쪽 가장자리는 이미 5.9 단계에서 정의되었습니다. </li><li> 옵션 : &quot;chek&quot;기능 (L165-175)을로드하고 실행하여 &quot;coord&quot;기능이 무작위로 선택된 착색 프로파일에 대해 T 1-3 위치 를 정확히 식별하는지 확인하십시오. </li><li> &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot;(Sample 및 Tergite의 연결), &quot;P max &quot;라는 제목의 데이터 테이블을 생성하려면 인덱스 및 메트릭 함수 (L178-193) &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot;(안료 밴드 폭 = T3 - T2) 및 &quot;W tergite &quot;(색소 c의 폭uticles a2-a5, = T3). </li><li> &quot;수정&quot;기능 (L196-234)을로드하고 실행하여 세션 효과로 인해 발생하는 불필요한 요소에 대해 P max 와 P min 을 수정하는 데이터 테이블을 생성하십시오. 일시적으로 인접한 세션에서 다시 촬영 한 대조군 표본의 P max 또는 P min 의 평균 증가 (또는 감소)를 사용합니다. </li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 방법론은 다중 하류 분석에 적합한 양적 형태로 색소 침착 데이터를 정확하고 신속하며 반복적으로 수집 할 수있게합니다. 이 방법은 파리의 등선에서 복부 색소 침착에 대한 온도 효과에 대한 자료를 수집하는 데 사용되었습니다. 그러나 전향 적 유전학 연구에서 개인, 개체군 또는 종 사이의 색소의 차이를 결정하는 유전자를 식별하거나 특정 유전자의 색소 침착 패턴에 미치는 영향을 조사하기위한 역 유전 연구에 사용할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이, D. melanogaster 색소 침착의 개발 및 진화를 연구 한 수많은 연구가 있었지만,이 방법론이 색소 침착 데이터를 정량적 형태로 포착하는 정밀도는보다 강력한 통계적 접근법을 가능하게한다. 이것은 차례로 연구원이 착색 패턴을 분석 할 때 샘플을 적게 사용하거나 더 미세하게 해명 할 수있게 해줍니다.착색의 양상. 또한이 방법은 파리의 절개를 필요로하지 않으므로 형태 학적 측정이나 유전자형 분석과 같은 추가 분석을 위해 샘플을 연속적으로 사용할 수 있습니다. 실제로,이...

색소 침착은 종, 개체군, 개개인간에, 심지어 개체 발생 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 동안 개인 내에서도 거대한 표현형의 변화를 보여줍니다. 다양한 동물에서 색소 침착에 대한 수많은 연구가 있지만 염색은 Drosophila melanogaster에서 가장 잘 연구되었을 것입니다. 분자 유전학의 모든 힘이 색소 침착을 조절하는 발달 및 생리적 메커니즘을 밝혀 내고 이러한 메커니즘이 어떻게 발전하는지 1 , 6 . D. melanogaster 7 과 8 에서 색소의 생화학 적 합성을 조절하는 유전자와 시간 및 공간적 di를 조절하는 유전자에 대해 많이 알려져있다 .이 생합성에 대한 스트라이핑 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . 또한, 유전지도 작성은 D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 에서 착색의 내부 및 내부 특이적인 차이점을 나타내는 유전자 좌의 위치를 ​​확인했다. 행동 18 , 19 , 면역 19 , 20 과 같은 착색과 pleiotropic 특성 사이의 관계도 착색 패턴 15 , 21 , 22 의 적응 의미를 가지고 탐험되었습니다. 이와 같이, D. melanogaster의 색소 침착 은 강력하면서도 단순한 m복잡한 표현형의 개발과 진화를위한 odel. 성인에서 색소 침착 D. melanogaster 는 특히 날개와 지느러미 흉부와 복부에서 몸 전체에 뚜렷한 무늬가 특징입니다. 그러나 대부분의 연구 관심을받은 것은 배 쪽 복부에있는 각 큐티 큘라 플레이트 (tergite)의 착색입니다. 유전 적 17 , 23 및 환경 24 , 25 요인 때문에이 색소 침착 ( 그림 1A- F )에 상당한 차이가 있습니다. 복강 각질의 큐티클은 전방 및 후방 발달 구획으로 구성되며 ( 그림 1G ), 각 구별은 색소 침착 및 장식에 따라 더 세분화 될 수 있습니다. 전방 구획에는 6 개의 큐티클유형 (a1-a6)을 포함하고 후방 구획은 세 가지 (p1-p3)를 포함한다 ( 그림 1G ). 이 중 p1, p2 및 a1 표피는 일반적으로 미연 신 (un-stretched abdomens)의 표층 아래에 ​​접혀있어 숨겨져 있습니다. 확실하게 눈에 보이는 표피는 큐티클 유형 a4 (중간 정도의 털이있는 털이)와 a5 (털이 큰 털이있는)로 구성되어 있고 밴드의 뒷부분 가장자리로 구성된 무거운 색소의 밴드를 특징으로합니다. ( 그림 1G )보다 강하게 색소 침착되었다. 이 밴드의 앞부분은 가볍게 착색 된 털이 많은 큐티클의 영역으로, 뒤쪽으로 (a3) ​​딱딱하고 앞쪽으로는 (a2)가 없습니다. 파리 사이의 색소 침착의 변이는 색소의 강도와 색소의 폭 모두에서 관찰된다. 일반적으로, 변이는 대부분의 후부 분절 (복부 분절 5, 6 및 7)에서 가장 크며, 더 많은 전 안부 분절에서 더 낮다 (복부3과 4 장) 24 . 또한, D. melanogaster 색소 침착에 성적 이형성이 있으며, 남성은 일반적으로 5 번째 및 6 번째 복부 tergites를 완전히 색칠합니다 ( 그림 4C ). D. melanogaster 의 복부 색소 침착에 대한 대부분의 연구에서, 색소 침착은 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 의 척도에서 정 성적으로 27 , 28 , 29 또는 semi-quantitatively로 측정 된 패턴을 가진 범주 형 또는 서수 형으로 처리되었습니다. , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . 이러한 방법은 필연적으로 정밀도 부족으로 고통 받고 있으며 색소 침착의 주관적인 평가에 의존하기 때문에 여러 연구에서 데이터를 비교하기가 어렵습니다. 몇몇 저자들은 착색 38,39의 공간적 차원, 특정 큐티클 유형 23 , 25 , 39 , 40 의 착색 강도 또는 복부 용제 전체의 착색 강도 평균을 41 , 42 , 43 로 계량화했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 정량화 방법은 복부 색소 침착의 강도와 공간 분포를 동시에 측정하지 않으므로 색소 침착이 abd에서 어떻게 변하는 지에 대한 뉘앙스를 포착하지 않습니다ominal tergite. 또한, 이러한 정량화 방법들 (38 , 41 , 42 , 43) 중 몇 가지는 복부 표피의 해부 및 장착을 필요로한다. 이것은 시간이 많이 걸리고 샘플을 파괴하므로 추가적인 형태 학적 분석에 사용할 수 없습니다. 복부 색소 침착의 발달과 진화에 대한 이해가 심화됨에 따라 공간 분포와 색소 침착을 신속하고 정확하게 측정 할 수있는보다 정교한 도구가 필요합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 D. melanogaster 에서 복부 색소 침착에 대한 복제 가능하고 정확한 측정을 얻기 위해 디지털 이미지 분석을 이용하는 것 입니다. 이 방법론은 세 단계로 구성됩니다. 첫째, 성충은 비파괴 적으로 장착되고 등 쪽 복부의 디지털 이미지가 촬영됩니다. 둘째, ImageJ 매크로를 사용하여 사용자는 a2 큐티클의 앞쪽에서 세 번째 및 네 번째 복부 세그먼트의 a5 큐티클 (녹색 상자, 그림 1G )의 후방까지 연장되는 픽셀의 앞 / 뒤쪽 스트립을 정의합니다. 이 스트립의 너비에 걸친 평균 픽셀 값은 장축을 따라 추출되어 테르가 트의 전방에서 후방으로 변화함에 따라 색소의 공간 분포와 강도를 포착하는 프로파일을 생성합니다. 셋째, R 스크립트는 큐빅 스플라인을 사용하여 수학적으로 착색 프로파일을 설명하는 데 사용됩니다. 그런 다음 R 스크립트는 스플라인과 첫 번째 및 두 번째 미분을 사용하여 a2-a5 표피의 너비, 안료 밴드의 너비 및 염색의 최대 및 최소 레벨을 추출합니다. 따라서이 방법은 복부 색소 침착의 깊이와 공간 특성을 정량화합니다. 이 방법론은 세 번째 및 네 번째 복부 tergites의 착색을 정량화,이들은 이전의 많은 연구 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42의 초점이었으며, 오직 더 많은 후부 표적과 배타적으로 또는 조합으로 사용되었다. 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites보다 덜 변하지 만, 세 번째 및 네 번째 tergites은 남성에서 완전히 색칠되지 않습니다, 그래서이 프로토콜은 남성과 여성 모두에 적용 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된대로, 프로토콜은 여성의 다섯 번째와 여섯 번째 복부 tergites의 색소를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 염색 프로파일의 특성을 추출하는 데 사용되는 스크립트의 사소한 수정을 통해 다양한 방법으로 색소 침착의 변이를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다유기체.

<table><tbody><tr><td>Dumont # 5 생물학 겸자</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>기본</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>구즈넥 콜드 라이트 소스</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 제어 소프트웨어</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>멀티미터</td><td>Fluke</td><td>75 시리즈 II</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Celltreat Scientific 제품</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>재질 보기 KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

복부 색소 침착 정량화<em&gt; drosophila melanogaster</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

색소 침착은 형태 적으로 간단하지만 매우 가변적 인 특성으로 종종 적응의 중요성이 있습니다. 그것은 형태 학적 표현형의 발달과 진화를 이해하기위한 모델로서 광범위하게 사용되어왔다. Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 은 특히 ​​유용하여 연구원은 형태학의 내부 및 내부 특이성 변이의 기초가되는 좌위를 확인할 수있었습니다. 그러나, D. melanogaster 복부 색소 침착은 색소 침착 데이터에 적용 할 수있는 통계 분석의 형태를 제한하는 정량적 인 것이 아니라 정량적으로 정량적으로 분석되어왔다. 이 작품은 성인 D. melanogaster 의 복부 색소 침착 패턴의 다양한 측면을 정량화 할 수있는 새로운 방법론을 설명 합니다. 이 프로토콜에는 표본 장착, 이미지 캡처, 데이터 추출 및 분석이 포함됩니다. 이미지 캡처 및 분석 기능 매크로에 사용되는 모든 소프트웨어오픈 소스 이미지 분석을 위해 작성되었습니다. 이 방법의 장점은 다른 이미징 시스템에서 재현성이 높은 방법론을 사용하여 색소 특성을 정확하게 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 기법은 성인 D. melanogaster 의 tergal pigmentation 패턴의 변이를 측정하는 데 사용 되었지만 ,이 방법은 무수히 많은 유기체에서 색소 침착 패턴에 유연하고 광범위하게 적용될 수 있습니다.

프로토콜은 복부 색소 침착에 온도를 키우는 효과를 탐색하는 데 사용되었습니다. 이전 연구에 의하면 발달 온도의 증가는 D. melanogaster 30 , 32를 포함 하여 여러 종의 초파리 에서 복부 색소 침착의 확산을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 특히, 복부 tergites 3과 4, 착색의 범위 (안료 밴드의 폭) 17 ° C에서 25 ° C로 감소하고 25 ° C에서 28 ° C 24,36 동일하게 유지됩니다. 이 연구는 1-10 등급 (0 : 안료 밴드 없음, tergite 완전 황색, 5 : 색소 밴드는 tergite의 50 %, 10 : tergite는 완전히 어둡다)의 색소 침착 정도를 기록했다. 정량적 방법론이 이러한 표현형 소성을 포착 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 착색은 th17 번 (일곱 개의 파리),...

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

이 방법론의 전반적인 목표는 초파리 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착을 신속하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 형질 특이적 변이 형태의 기초가 되는 유전자 궤적을 식별하고 형태학적 표현형의 발달과 진화를 이해하는 것과 같이 진화 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 색소 침착의 범위와 깊이를 포함하여 복부 색소 침착의 다양한 측면을 비파괴적으로 측정할 수 있다는 점입니다.이 방법은 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 Drosophila 종에도 적용할 수 있으며 다른 곤충 및 동물 분류군의 색소 침착 패턴을 측정하도록 쉽게 조정될 수 있습니다. 이미징 전에 초파리를 70% ethanol에 보관하여 색소 침착 상태를 유지할 수 있습니다. 시각화를 위해서는 마운팅 패드가 필요합니다.60 mm 페트리 접시에 1.25% 수성 한천(agar) 약 10 mL를 채웁니다. 현미경 하에서 미세 핀셋을 사용하여 겔에 길이 20 mm, 너비 2 mm, 깊이 1 mm의 도랑을 팝니다. 하나의 접시에 여러 개의 도랑을 만들 수 있습니다.그 다음, 분석 대상 표면이 겔 표면 바로 위에 오도록 초파리를 트렌치에 매립합니다. 이 경우, 등 쪽 면이 분석 대상입니다. 이제 초파리가 완전히 잠길 때까지 접시에 70% ethanol을 채웁니다.이렇게 하면 큐티클의 반사를 줄여 색소 침착 패턴이 가려지는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 현미경에 연결된 이미징 소프트웨어와 디지털 카메라를 시작하십시오. 광원의 경우, 더블 구스넥 장치의 냉광원으로도 충분합니다.이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 유형을 8-bit로 설정하십시오. 그런 다음 이미지 캡처 소프트웨어에서 Live 설정을 토글하여 카메라 뷰 창을 엽니다. 이미지 유형을 Grayscale로 설정하십시오.이제 광원의 강도를 최대로 설정하고, 조명을 스테이지에서 약 120 millimeters 떨어진 곳에 배치하십시오. 시야 너비가 3 millimeters가 되도록 현미경 배율을 60배로 설정하십시오. 그런 다음 2 millimeter 스테이지 마이크로미터를 시야 내에 놓고 초점을 맞추십시오.소프트웨어로 돌아가 노출 박스에 있는 필드를 사용하여 마이크로미터가 보이도록 노출 시간을 조정하십시오. 그런 다음 스케일을 설정하십시오. 직선 도구를 열고 스

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는​​ 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.

준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법

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복부 색소 침착 정량화

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