복부 색소 침착 정량화 Drosophila melanogaster

이 방법론의 전반적인 목표는 초파리 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착을 신속하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 신뢰 특이적 변이 형태학의 기초가 되는 유전적 위치를 식별하고 형태학적 표현형의 발달 및 진화를 이해하는 것과 같은 진화 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 사용자가 색소 침착의 확산과 깊이를 포함하여 복부 색소 침착의 다양한 측면을 비파괴적으로 측정할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 초파리 종에도 적용할 수 있으며 다른 곤충 및 동물 분류군의 색소 침착 패턴을 측정하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 이미징 전에 파리는 색소 침착을 유지하기 위해 70% 에탄올에 보관할 수 있습니다. 시각화에는 마운팅 패드가 필요합니다.

60mm 페트리 접시에 약 10ml의 1.25%한천을 물에 넣습니다. 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 길이 20mm, 너비 2mm, 깊이 1mm의 트렌치를 젤 안으로 파냅니다. 한 접시에 여러 개의 트렌치를 만들 수 있습니다.

그런 다음 분석을 위한 표면이 겔 표면 바로 위에 놓이도록 파리를 트렌치에 삽입합니다. 이 경우 등쪽이 중요합니다. 이제 파리가 완전히 잠길 때까지 접시에 70% 에탄올을 채웁니다.

이렇게 하면 색소 침착 패턴을 가릴 수 있는 큐티클의 반사를 줄일 수 있습니다. 이제 현미경에 연결된 이미징 소프트웨어와 디지털 카메라를 시작합니다. 광원의 경우 더블 구즈넥 장치의 차가운 빛으로 충분합니다.

이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 유형을 8비트로 설정합니다. 그런 다음 이미지 캡처 소프트웨어에서 라이브 설정을 토글하여 카메라의 보기 창을 엽니다. 이미지 유형을 회색조로 설정합니다.

이제 광원을 최대 강도로 설정하고 무대에서 약 120mm 떨어진 곳에 조명을 배치합니다. 현미경을 60배 배율로 설정하여 시야각의 너비가 3mm가 되도록 합니다. 그런 다음 2mm 스테이지 마이크로미터를 시야에 놓고 초점을 맞춥니다.

소프트웨어로 돌아가서 노출 시간을 조정하여 view 노출 상자에 있는 필드를 사용하여 마이크로미터. 그런 다음 스케일을 설정합니다. 직선 도구를 열고 스테이지 마이크로미터를 따라 2mm 길이를 그립니다.

그런 다음 Set Scale 옵션 아래에 해당 길이를 입력합니다. 그러면 창에 스케일이 미크론당 픽셀 단위로 표시되어야 합니다. 스케일을 기록하고 조정을 확인합니다.

이제 이미지 캡처 소프트웨어로 돌아가서 중지 및 스냅 명령을 사용하여 스테이지 마이크로미터의 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어로 돌아가서 이미지를 Tiff 파일로 저장합니다. 이제 장착된 파리의 등쪽 정중선에 초점을 맞춥니다.

최상의 이미징 결과를 위해 정중선은 똑바로 위치해야 합니다. 날개와 다른 돌출된 구조를 옆으로 밀어내고 큐티클을 가장 잘 비추도록 조명을 조정합니다. 다음으로, 픽셀 값 히스토그램을 가이드로 사용하여 이미지 캡처 소프트웨어에서 노출을 설정하여 채도 없이 이미지의 전체 픽셀 범위를 캡처하여 대비를 최대화합니다.

실험 내내 이 노출과 조명을 유지합니다. 이제 이미지를 캡처하기 전에 관심 있는 복부 부분이 보이는지 확인하십시오. 그런 다음 이미지를 캡처하고 파일 이름에 샘플 ID 번호와 함께 이미지를 저장합니다.

서면 프로토콜에 설명된 형식을 사용합니다. 이 분석은 저자가 제공한 매크로를 사용합니다. 분석할 이미지 시리즈는 모두 동일한 파일 폴더 내에 포함되어야 합니다.

이제 매크로를 시작하고 프롬프트된 명령을 따릅니다. 먼저 저장된 파일의 위치를 식별합니다. 그런 다음 분석 데이터를 저장해야 하는 위치를 식별합니다.

그런 다음 소프트웨어가 이미지 시리즈를 올바르게 읽을 수 있도록 파일 이름에 사용된 문자 수를 입력합니다. 다음 프롬프트는 관심 영역의 너비에 대한 프롬프트입니다. 여기에서 분석해야 하는 전후 스트립을 따라 픽셀 수를 입력합니다.

이제 프롬프트에서 시리즈의 첫 번째 이미지를 분석하도록 선택합니다. 다른 옵션은 계열의 다음 이미지를 분석하거나 분석을 종료하는 것입니다. 선 도구가 자동으로 선택됩니다.

이를 사용하여 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 선을 따라 선을 그려 이미지의 중심선을 식별할 수 있습니다. 다음으로, 매크로 프롬프트에 따라 선 도구를 사용하여 Tergite4의 뒤쪽 가장자리를 식별합니다. 선 도구를 사용하여 뒤쪽 정중선 가장자리에서 오른쪽 측면 가장자리까지 선을 그려 선의 중심이 색소 밴드의 뒤쪽 가장자리 바로 뒤에 오도록 할 수 있습니다.

그런 다음 선 도구를 사용하여 Tergite4의 앞쪽 가장자리를 정의합니다. 앞쪽 정중선 가장자리에서 오른쪽 측면 가장자리까지 선을 그립니다. 흰색 사각형으로 정의된 선의 중앙은 옅게 착색된 큐티클의 앞쪽 가장자리에 위치해야 합니다.

이 정보를 사용하여 매크로는 이제 색소 침착 프로파일을 생성합니다. 그러나 강모 또는 기타 흠집이 프로파일이 측정되는 스트립을 교차하는 경우 프로파일이 정확하지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 히스토그램 창에서 라이브 미리보기를 선택하고 프로필이 매끄럽게 되도록 선을 조정합니다.

이미지 분석 스트립이 착색의 다양한 측면을 정확하게 캡처하려면 이미지 또는 표본의 불규칙성으로 인한 노이즈가 최소화된 분석 영역을 식별하는 것이 중요합니다. 이제 동일한 이미지에서 Tergite3를 분석한 후 다음 이미지로 이동합니다. 설명된 절차는 양육 온도로 인한 복부 색소 침착의 알려진 변화를 조사하는 데 사용되었습니다.

세 번째와 네 번째 tergites는 다양한 조명과 노출 하에서 여러 번 검사되었습니다. 색소 침착의 다양한 측면을 조사했습니다. 그리고 구체적으로, 파리가 더 시원한 온도에서 사육될 때 색소 띠가 더 넓다는 것이 밝혀졌습니다.

그런 다음 계산된 값을 5명의 다른 관찰자가 동일한 파리에 대해 수행한 일반적인 주관적 측정과 비교했습니다. 45마리의 암컷 파리에 대한 평가에서, 네 번째 복부 색소 침착 밴드의 너비에 대한 관찰된 평균 순위는 매크로의 자동 측정과 밀접한 상관관계가 있었습니다. 동일한 색소 밴드도 이미징 소프트웨어를 사용하여 수동으로 측정했습니다.

이러한 결과는 매크로를 사용하여 생성된 측정과도 밀접한 상관관계가 있었습니다. 그런 다음 이 소프트웨어를 테스트하여 세 번째 및 네 번째 색소 밴드에서 색소 침착이 증가한 것으로 잘 알려진 암컷 흑단 돌연변이의 색소 침착을 측정했습니다. 이 방법은 또한 야생형 암컷의 다섯 번째와 여섯 번째 복부 밴드를 측정하는 데 사용되었습니다.

자동화된 기술은 항상 안료 밀도와 밴드 크기에 대한 유용한 측정을 제공했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리의 복부 색소 침착을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하려면 대부분 집게를 깊이 사용해야 합니다.

이 기술의 이미징 부분은 시간당 50개의 표본을 처리하는 속도로 수행할 수 있습니다. 이러한 이미지에서 색소 침착 측정을 추출하는 것은 시간당 70개 이미지의 속도로 수행할 수 있습니다.