Name: 복부 색소 침착 정량화 Drosophila melanogaster (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 복부 색소 침착을 디지털 이미지 분석으로 정량화하는 방법을. 비파괴 측정으로 진화생물학 및 형태학적 변이 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 National Science Foundation에서 IOS-1256565 및 IOS-1557638을 AWS에 기부하여 지원되었습니다. 우리는 Patricia Wittkopp과 3 명의 익명의 평론가들에게이 백서의 이전 버전에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다.

1. 시편 설치 참고 : 이미징하기 전에 죽은 파리를 물에 70 % 에탄올에 보관하십시오. <ol><li> 60 mm x 15 mm 페트리 접시에 끓는 물에 용해 된 1.25 % 한천 10 ML을 부어 그것을 설정할 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 젤의 표면에 ~ 20mm 옹이, 2mm 폭, 1mm 깊이 홈을 만들기 위해 미세 포인트 포셉 한 켤레를 사용합니다. 미세 포셉을 사용하여 성인 파리의 복부 측면을 그루브에 삽입하고 파리의 등쪽면을 젤 위에 돌출시킵니다. 참고 : 젤이 느슨하면 시편을 손상시키지 않고 쉽게 위치를 변경할 수 있습니다. 더럽고 부서지며 시간이 지나면 사용할 수 없지만 동일한 홈을 여러 표본에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 사용자는 동일한 젤에 다른 홈을 만들 수 있습니다. 각 접시는 200 파리를 이미지하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 물에서 70 % 에탄올로 표본을 완전히 덮어 왁스 같은 큐티클의 빛 반사를 줄이고 날개 손상을 방지하십시오.시험편 조작. </li></ol> 2. 현미경 설정 참고 : 이미지 수집 컨트롤 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 해부 범위, 전송 된 광원, 디지털 카메라 및 거위 목처럼 찬 광원을 사용하여 이미지를 수집합니다. 소프트웨어 지침은 ImageJ 45 를 통합 한 오픈 소스 소프트웨어 인 Micro-Manager v1.4.20 44 에만 해당됩니다. <ol><li> 현미경, 디지털 카메라, 이중 구즈넥 차가운 광원 및 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 이미지 캡처 소프트웨어를 실행하여 Micro-Manager 창과 ImageJ 창을 엽니 다. ImageJ 창에서 &quot;이미지&quot;&gt; &quot;유형&quot;&gt; &quot;8 비트&quot;를 클릭하여 모든 이미지를 8 비트로 설정하십시오. Micro-Manager 창에서 &quot;라이브&quot;를 클릭하면 카메라에서 실시간 미리보기를 보여주는 &quot;스냅 / 라이브&quot;창이 열립니다. <ol><li> &quot;스냅 / 라이브&quot;창의 크기를 최대화하십시오세서리. Micro-Manager 창의 &quot;Contrast&quot;탭에서 풀다운 &quot;Display mode&quot;메뉴에서 &quot;Grayscale&quot;을 선택하십시오. </li></ol></li><li> 차가운 광원을 최대 강도로 켜고 각 거위 목의 끝을 스테이지에서 약 120mm (왼쪽과 오른쪽에 각각 하나씩) 위치시킵니다. 참고 : 파리 복부 주위에 반사광이 울릴 수도 있지만 사용자는 환형 조명기를 사용할 수도 있습니다. </li><li> 수동으로 현미경 배율을 60X로 설정하여 시야에서 스테이지의 지름이 약 3mm 인 영역을 캡처합니다. </li><li> 스테이지에 2mm 무대 마이크로 미터를 놓습니다 (필요한 경우 배경을 흰색으로 전환). 실시간 미리보기를 보면서 무대 마이크로 미터에 초점을 맞추고 &quot;노출&quot;상자에 노출 시간을 ms 단위로 입력하여 마이크로 관리자 창에서 노출을 조정하십시오. </li><li> 공간적으로 카메라를 교정하려면 t에서 &quot;직선&quot;도구를 선택하십시오.그는 ImageJ 창을 열고 스테이지 마이크로 미터의 길이를 그립니다. ImageJ 윈도우에서 &quot;Analyze&quot;&gt; &quot;Set Scale&quot;을 클릭하여 &quot;Set Scale&quot;창을 열고 &quot;Known distance&quot;상자에 μm로 마이크로 미터의 길이를 입력 한 다음 &quot;Unit of length&quot; 상자. <ol><li> &quot;Set Scale&quot;창이 &quot;pixels / μm&quot;단위로 스케일을 표시하는지 확인하십시오. 눈금을 적어두고 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Snap / Live&quot;창에서 &quot;Stop&quot;을 클릭 한 다음 &quot;Snap&quot;을 클릭하여 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하십시오. </li><li> 필요한 경우 이미지를 다시 공간적으로 조정할 수 있도록 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 저장하십시오. ImageJ 윈도우에서 &quot;파일&quot;&gt; &quot;다른 이름으로 저장&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot;를 클릭하십시오. 파일 브라우저에서 파일을 저장할 위치를 지정하고 파일 이름을 지정하고 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 무대를 검은 색과 장소로 전환하십시오.무대에서 한천 (단계 1.1-1.2)에 탑재 비행을 들고 페 트리 접시. </li><li> 현미경을 통해보고 염소 패턴을 가장 잘 볼 수 있도록 등쪽 중간 선이 곧게 펴지도록 파리를 배치하십시오. 날개와 부속 장치를 움직여 복부의 시야가 방해받지 않도록하십시오. 색소 표피 (a2-a5)가 보이지 않으면 복부를 옆으로 꽉 짜내십시오 (물의 70 % 에탄올에 저장된 파리의 복부가 팽창하기 때문에 일반적으로 필요하지 않습니다). 참고 : 플라이를 배치 할 때 사용자는 더 낮은 배율 (20X)을 사용해야 할 수도 있습니다. 진행하기 전에 배율을 60X로 돌려 주어야합니다. </li><li> 파리의 등 복부에 수동으로 초점을 맞 춥니 다. 수동으로 광원의 팁을 조정하여 등 복부의 그림자와 반사를 최소화합니다. </li><li> 컴퓨터 화면에서 실시간 미리보기를보고 Micro-Manager 창의 &quot;대비&quot;탭에서 픽셀 값 막대 그래프를 사용하는 동안,단계 2.4에서 설명한대로 노출을 조정하여 미리보기 이미지의 픽셀 값 범위를 최대화하십시오. </li><li> 파리와 페트리 접시를 제거하고 플라이와 같은 위치에서 시야를 중심으로 전압계에 연결된 LED (430-660 nm의 스펙트럼 출력)로 교체하십시오. LED와 전압계를 광도계로 사용하고 LED에 닿는 빛에 의해 생성 된 전압을 기록하십시오 (~ 125 mV). 참고 : LED 및 전압계는 단일 실험 내에서 여러 이미징 세션에서 조명 수준이 일정하도록 보장하는 데 사용됩니다. </li><li> 실험 기간 동안 광원의 위치 나 강도, 현미경의 배율 또는 카메라의 노출을 더 이상 변경하지 마십시오. </li></ol> 3. 시편 이미징 <ol><li> 한천 (단계 1.1-1.3)에 검은 색 현미경 stage.Ajust에 장착 된 비행 자세를 유지 페트리 접시를 놓으십시오 제 3과 fourt복부 세그먼트가 보이고 지느러미 정중선은 단계 2.9에서 설명한대로 곧게 펴집니다. 진행하기 전에 배율이 60 배인지 확인하십시오. </li><li> 수동으로 세 번째와 네 번째 등 쪽 복부 tergites 초점에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 단계 2.6에서 설명한대로 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 얻습니다. 참고 : 이미지를 컬러로 캡처 한 다음 분석을 위해 그레이 스케일로 변환 할 수 있습니다. </li><li> 단계 2.7에서 설명한대로 이미지를 &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;로 저장하십시오. 참고 : [SESH]는 상수이고, [000]은 세션 번호이며 변수이지만 3 자릿수 여야하며 [sampleID]는 사용자가 원하는 모든 것이지만 추가 밑줄 (_) 문자를 포함 할 수는 없으며 일정한 길이 여야합니다. [표본 ID]는 색소 침착 데이터 ( 예 : 온도 또는 혈통) 분석에 사용 된 요소에 대한 세부 정보를 포함해야하며 특유한 비 알파벳하이픈 (-)과 같은 대문자. 이렇게하면 표준 통계 소프트웨어를 사용하여 [sampleID]에서 이러한 요소를 쉽게 파싱 할 수 있습니다. </li><li> 무대에서 페트리 접시를 제거하고 다음 표본과 파리를 교체하십시오. 조명 수준, 배율 또는 노출을 추가 조정하지 않고 모든 표본이 이미 찍힐 때까지 3.1-3.3 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 여러 세션에서 이미징 <ol><li> 이미지를 여러 세션으로 가져와야하는 경우 세션 전반에 걸쳐 광도, 노출 및 배율을 유지하십시오. 각 세션이 시작될 때 카메라의 공간 보정 (2.4 단계)과 스테이지의 광도 (LED / 전압계로 측정, 단계 2.12)를 확인하십시오. </li><li> 필요한 경우, 이미지를 공간적으로 다시 보정하는 기능을 보장하기 위해 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하고 저장합니다 (2.5-2.7 단계). </li><li> 적어도 15 개의 대조 표본을 사용하고 각 세션에서 무작위로 이미지를 재사용하십시오w를 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 세션 사이의 중복 대조 표본이 동일한 [표본 ID]이지만 [SESH000]이 서로 다른지 확인하십시오. 참고 : 대조 표본은 수집되어 저장되며 실험 시료와 동일하게 장착되지만 반복적으로 촬영됩니다. 정확한 대조 표본 수는 사용자의 실험 설정에 따라 달라집니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. </li></ol> 5. 이미지 분석 참고 : 이미지 분석은 ImageJ 45 에서 수행되며 &quot;Pigmentation.ijm 측정&quot;보조 매크로를 보조 파일로 사용합니다. <ol><li> 분석 할 모든 이미지를 같은 폴더에 놓습니다. </li><li> ImageJ를 시작하고 &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Run&quot;을 클릭하고 파일 브라우저에서 &quot;Pigmentation.ijm 측정&quot;을 선택한 다음 &quot;열다.&quot; 참고 : 모든 후속 단계는 매크로 내에 있습니다. 각 단계는 개별 매크로 명령입니다. </li><li> &quot;필요한 이미지를 저장할 폴더 선택&quot;이라는 &quot;작업 필요&quot;대화 상자가 열립니다. &quot;확인&quot;을 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 이미지가 들어있는 폴더를 선택한 다음 &quot;선택&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;필요한 작업을 저장할 폴더를 선택하십시오.&quot;라는 &quot;작업 필요&quot;대화 상자가 열립니다. &quot;OK&quot;를 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 염색 프로파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. &quot;선택&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 대화 상자가 열리면서 &quot;샘플 ID에 몇 개의 문자가 있습니까?&quot;라고 묻습니다. 데이터 입력 상자에 3.3에서 지정한대로 [SampleID]의 문자 수를 입력하고 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;ROI는 얼마나 넓습니까?&quot;라는 질문을하는 대화 상자가 열립니다. 데이터 입력 상자에 전방 십자형 커서의 픽셀 너비를 입력합니다.( 그림 1G , 그림 2A 및 2A &#39;의 녹색 직사각형)을 읽어야합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 기본값은 20 픽셀입니다. 참고 : 염색 프로파일은 머리카락과 털로 인한 노이즈를 줄이기 위해 줄보다는 큐티클 스트립을 통해 읽습니다. 이 스트립의 너비는 이미지의 해상도에 따라 다르지만 복부 폭의 1 / 20 ~ 1 픽셀이어야합니다. </li><li> 매크로가 첫 번째 파리의 이미지를 열고 대화 상자에 현재 파리를 측정할지 ( &quot;예&quot;클릭), 다음 파리로 이동 ( &quot;아니오&quot;클릭) 또는 매크로 ( &quot;취소&quot;를 클릭하십시오). </li><li> &quot;ANTERIOR에서 POSTERIOR로 지느러미 복부의 정중선을 정의하십시오.&quot;라는 대화 상자가 열립니다. &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽에서 뒤쪽까지 선 그리기등 쪽 복부의 정중선을 정의한다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39;, 황색 선을 참조하십시오. 참고 : 이것은 이미지의 방향을 변경하여 등 쪽 정중선이 화면에서 가로로 놓이고 왼쪽이 앞쪽에 오도록하여 후속 단계를 더 쉽게 만듭니다. </li><li> &quot;Tergite 4의 POSTERIOR 가장자리를 안료 밴드 바로 뒤에 정의하십시오.&quot;라는 대화 상자가 열립니다. &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 구형 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 안료 밴드 (표피 a5)의 후부 가장자리 바로 뒤쪽에 위치하도록합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39;, 마젠타 색 선을 참조하십시오. 참고 : R 스크립트는 색소 프로파일에서 안료 밴드의 후방 가장자리를 자동으로 감지합니다. </li><li> 대화 상자상자가 열리 며 &quot;착색 된 큐티클 (a2)의 앞쪽 가장자리에 Tergite 4의 원형 가장자리를 정의하십시오.&quot; &quot;직선&quot;도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 색소 표피 (표피 a2)의 앞쪽 가장자리에 놓 이도록합니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A &#39; , 시안 색 선을 참조하십시오. 참고 : R 스크립트는이 점을 표백제의 색소 표피의 앞쪽 가장자리로 정의합니다. 이미지에서 색소 침착 프로파일을 읽는 관심 영역 (ROI)이 매크로에 표시됩니다 (녹색 장방형, 그림 2A 및 2A &#39;, 그림 2B 및 2B &#39;에서 확대). 또한 매크로는 ROI에 대한 색소 침착 프로파일을 보여주는 두 번째 창을 엽니 다 ( Figur<html> e 2C 및 2C &#39;), 여기에서 x 축은 프로파일의 후방 모서리로부터의 픽셀 수로 표현되는 위치이고, y 축은 각 위치의 평균 픽셀 값입니다. </li><li> 매크로에 의해 열리는 착색 프로파일의 플롯을 봅니다. 필요한 경우 프로필 창에서 &quot;라이브&quot;를 클릭하여 색소 침착 프로파일에 영향을 줄 수있는 구조 ( 예 : 털)가 없도록 ROI 위치를 조정합니다. 프로필이 만족 스러우면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> Tergite 3에 대해 5.8-5.11 단계를 반복하십시오. 참고 : 매크로는 색소 프로파일을 두 개의 CSV 파일 (각각 &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;)로 내 보냅니다. 여기서 [SESH000_samplename]은 이미지 이름이고 [TX]는 세 번째 및 네 번째 표준의 경우 T3 또는 T4입니다. </li><li> 매크로는 다음 이미지를 엽니 다. 모든 이미지가 분석 될 때까지 5.7-5.13 단계를 반복하십시오. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 6. 데이터 전처리, 분석 및 세션 수정 참고 : 모든 데이터 분석은 R 47 에서 수행되며 제공된 &quot;Pigmentation.R&quot;분석 스크립트를 사용합니다. 아래에서 &quot;L ...&quot;은 분석의 각 부분에 대해 실행할 스크립트의 줄을 나타냅니다. 분석 수행 방법에 대한 추가 정보는 보충 정보를 참조하십시오. <ol><li> R 스크립트를 편집하여 작업 디렉토리 (L6)를 설정하고 .csv 프로파일이 들어있는 폴더 (L11)에 대한 파일 경로를 정의하십시오. </li><li> L13-15를 실행하여 프로필 폴더에 저장된 착색 프로필 목록을 생성하십시오. </li><li> 프로파일을 단일 데이터 프레임으로 읽으려면 &quot;reader&quot;및 &quot;addPrimaryKey&quot;기능 (L17-41)을로드하고 실행하십시오. </li><li> L43에서 스크립트를 편집하여 2.5 단계에서 결정한대로 μm / 픽셀 단위로 이미지의 공간 보정을 지정합니다. </li><li> &quot;adjus&quot;를로드하고 실행하십시오.그림 2C 와 2C &#39;의 프로파일 위치를 ROI의 픽셀 - 투 - 후 - 에지 (ROI)에서 ROI의 μm 전치로 변환하는 &quot;tments&quot;기능 (L46-58)과 (0 = 검정, 255 = 흰색)에서 색소 값 (0 = 색소 없음, 255 = 최대 색소)까지의 프로파일 값 (y 축, 그림 2C 및 2C &#39; </li><li> &quot;spline.der.er&quot;함수 (L60-71)를로드하고 실행하여 착색 프로파일과 그 첫 번째 및 두 번째 미분 ( 그림 2D -2F 및 2D &#39;- 2F &#39;)의 3 차 스플라인을 생성합니다. </li><li> 먼저 &quot;coord&quot;와 &quot;assmbly.coord&quot;함수 (L74-163)를 실행하여 안료 밴드의 후방 (T 3 )과 전방 (T 2 ) 모서리의 위치를 ​​추출합니다 ( 그림 2D 및 2D &#39;)와 a2 큐티클의 후단 모서리 (T1, 도 2D 및 2D &#39;)를 추출한 다음 T 3 및 T 1 에서 각각 취한 최대 (P max ) 및 최소 (P min ) 색소 값을 추출한다. 참고 : a2 큐티클의 앞쪽 가장자리는 이미 5.9 단계에서 정의되었습니다. </li><li> 옵션 : &quot;chek&quot;기능 (L165-175)을로드하고 실행하여 &quot;coord&quot;기능이 무작위로 선택된 착색 프로파일에 대해 T 1-3 위치 를 정확히 식별하는지 확인하십시오. </li><li> &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot;(Sample 및 Tergite의 연결), &quot;P max &quot;라는 제목의 데이터 테이블을 생성하려면 인덱스 및 메트릭 함수 (L178-193) &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot;(안료 밴드 폭 = T3 - T2) 및 &quot;W tergite &quot;(색소 c의 폭uticles a2-a5, = T3). </li><li> &quot;수정&quot;기능 (L196-234)을로드하고 실행하여 세션 효과로 인해 발생하는 불필요한 요소에 대해 P max 와 P min 을 수정하는 데이터 테이블을 생성하십시오. 일시적으로 인접한 세션에서 다시 촬영 한 대조군 표본의 P max 또는 P min 의 평균 증가 (또는 감소)를 사용합니다. </li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 방법론은 다중 하류 분석에 적합한 양적 형태로 색소 침착 데이터를 정확하고 신속하며 반복적으로 수집 할 수있게합니다. 이 방법은 파리의 등선에서 복부 색소 침착에 대한 온도 효과에 대한 자료를 수집하는 데 사용되었습니다. 그러나 전향 적 유전학 연구에서 개인, 개체군 또는 종 사이의 색소의 차이를 결정하는 유전자를 식별하거나 특정 유전자의 색소 침착 패턴에 미치는 영향을 조사하기위한 역 유전 연구에 사용할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이, D. melanogaster 색소 침착의 개발 및 진화를 연구 한 수많은 연구가 있었지만,이 방법론이 색소 침착 데이터를 정량적 형태로 포착하는 정밀도는보다 강력한 통계적 접근법을 가능하게한다. 이것은 차례로 연구원이 착색 패턴을 분석 할 때 샘플을 적게 사용하거나 더 미세하게 해명 할 수있게 해줍니다.착색의 양상. 또한이 방법은 파리의 절개를 필요로하지 않으므로 형태 학적 측정이나 유전자형 분석과 같은 추가 분석을 위해 샘플을 연속적으로 사용할 수 있습니다. 실제로,이...

색소 침착은 종, 개체군, 개개인간에, 심지어 개체 발생 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 동안 개인 내에서도 거대한 표현형의 변화를 보여줍니다. 다양한 동물에서 색소 침착에 대한 수많은 연구가 있지만 염색은 Drosophila melanogaster에서 가장 잘 연구되었을 것입니다. 분자 유전학의 모든 힘이 색소 침착을 조절하는 발달 및 생리적 메커니즘을 밝혀 내고 이러한 메커니즘이 어떻게 발전하는지 1 , 6 . D. melanogaster 7 과 8 에서 색소의 생화학 적 합성을 조절하는 유전자와 시간 및 공간적 di를 조절하는 유전자에 대해 많이 알려져있다 .이 생합성에 대한 스트라이핑 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . 또한, 유전지도 작성은 D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 에서 착색의 내부 및 내부 특이적인 차이점을 나타내는 유전자 좌의 위치를 ​​확인했다. 행동 18 , 19 , 면역 19 , 20 과 같은 착색과 pleiotropic 특성 사이의 관계도 착색 패턴 15 , 21 , 22 의 적응 의미를 가지고 탐험되었습니다. 이와 같이, D. melanogaster의 색소 침착 은 강력하면서도 단순한 m복잡한 표현형의 개발과 진화를위한 odel. 성인에서 색소 침착 D. melanogaster 는 특히 날개와 지느러미 흉부와 복부에서 몸 전체에 뚜렷한 무늬가 특징입니다. 그러나 대부분의 연구 관심을받은 것은 배 쪽 복부에있는 각 큐티 큘라 플레이트 (tergite)의 착색입니다. 유전 적 17 , 23 및 환경 24 , 25 요인 때문에이 색소 침착 ( 그림 1A- F )에 상당한 차이가 있습니다. 복강 각질의 큐티클은 전방 및 후방 발달 구획으로 구성되며 ( 그림 1G ), 각 구별은 색소 침착 및 장식에 따라 더 세분화 될 수 있습니다. 전방 구획에는 6 개의 큐티클유형 (a1-a6)을 포함하고 후방 구획은 세 가지 (p1-p3)를 포함한다 ( 그림 1G ). 이 중 p1, p2 및 a1 표피는 일반적으로 미연 신 (un-stretched abdomens)의 표층 아래에 ​​접혀있어 숨겨져 있습니다. 확실하게 눈에 보이는 표피는 큐티클 유형 a4 (중간 정도의 털이있는 털이)와 a5 (털이 큰 털이있는)로 구성되어 있고 밴드의 뒷부분 가장자리로 구성된 무거운 색소의 밴드를 특징으로합니다. ( 그림 1G )보다 강하게 색소 침착되었다. 이 밴드의 앞부분은 가볍게 착색 된 털이 많은 큐티클의 영역으로, 뒤쪽으로 (a3) ​​딱딱하고 앞쪽으로는 (a2)가 없습니다. 파리 사이의 색소 침착의 변이는 색소의 강도와 색소의 폭 모두에서 관찰된다. 일반적으로, 변이는 대부분의 후부 분절 (복부 분절 5, 6 및 7)에서 가장 크며, 더 많은 전 안부 분절에서 더 낮다 (복부3과 4 장) 24 . 또한, D. melanogaster 색소 침착에 성적 이형성이 있으며, 남성은 일반적으로 5 번째 및 6 번째 복부 tergites를 완전히 색칠합니다 ( 그림 4C ). D. melanogaster 의 복부 색소 침착에 대한 대부분의 연구에서, 색소 침착은 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 의 척도에서 정 성적으로 27 , 28 , 29 또는 semi-quantitatively로 측정 된 패턴을 가진 범주 형 또는 서수 형으로 처리되었습니다. , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . 이러한 방법은 필연적으로 정밀도 부족으로 고통 받고 있으며 색소 침착의 주관적인 평가에 의존하기 때문에 여러 연구에서 데이터를 비교하기가 어렵습니다. 몇몇 저자들은 착색 38,39의 공간적 차원, 특정 큐티클 유형 23 , 25 , 39 , 40 의 착색 강도 또는 복부 용제 전체의 착색 강도 평균을 41 , 42 , 43 로 계량화했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 정량화 방법은 복부 색소 침착의 강도와 공간 분포를 동시에 측정하지 않으므로 색소 침착이 abd에서 어떻게 변하는 지에 대한 뉘앙스를 포착하지 않습니다ominal tergite. 또한, 이러한 정량화 방법들 (38 , 41 , 42 , 43) 중 몇 가지는 복부 표피의 해부 및 장착을 필요로한다. 이것은 시간이 많이 걸리고 샘플을 파괴하므로 추가적인 형태 학적 분석에 사용할 수 없습니다. 복부 색소 침착의 발달과 진화에 대한 이해가 심화됨에 따라 공간 분포와 색소 침착을 신속하고 정확하게 측정 할 수있는보다 정교한 도구가 필요합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 D. melanogaster 에서 복부 색소 침착에 대한 복제 가능하고 정확한 측정을 얻기 위해 디지털 이미지 분석을 이용하는 것 입니다. 이 방법론은 세 단계로 구성됩니다. 첫째, 성충은 비파괴 적으로 장착되고 등 쪽 복부의 디지털 이미지가 촬영됩니다. 둘째, ImageJ 매크로를 사용하여 사용자는 a2 큐티클의 앞쪽에서 세 번째 및 네 번째 복부 세그먼트의 a5 큐티클 (녹색 상자, 그림 1G )의 후방까지 연장되는 픽셀의 앞 / 뒤쪽 스트립을 정의합니다. 이 스트립의 너비에 걸친 평균 픽셀 값은 장축을 따라 추출되어 테르가 트의 전방에서 후방으로 변화함에 따라 색소의 공간 분포와 강도를 포착하는 프로파일을 생성합니다. 셋째, R 스크립트는 큐빅 스플라인을 사용하여 수학적으로 착색 프로파일을 설명하는 데 사용됩니다. 그런 다음 R 스크립트는 스플라인과 첫 번째 및 두 번째 미분을 사용하여 a2-a5 표피의 너비, 안료 밴드의 너비 및 염색의 최대 및 최소 레벨을 추출합니다. 따라서이 방법은 복부 색소 침착의 깊이와 공간 특성을 정량화합니다. 이 방법론은 세 번째 및 네 번째 복부 tergites의 착색을 정량화,이들은 이전의 많은 연구 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42의 초점이었으며, 오직 더 많은 후부 표적과 배타적으로 또는 조합으로 사용되었다. 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites보다 덜 변하지 만, 세 번째 및 네 번째 tergites은 남성에서 완전히 색칠되지 않습니다, 그래서이 프로토콜은 남성과 여성 모두에 적용 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된대로, 프로토콜은 여성의 다섯 번째와 여섯 번째 복부 tergites의 색소를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 염색 프로파일의 특성을 추출하는 데 사용되는 스크립트의 사소한 수정을 통해 다양한 방법으로 색소 침착의 변이를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다유기체.

<table><tbody><tr><td>Dumont # 5 생물학 겸자</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>기본</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>구즈넥 콜드 라이트 소스</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 제어 소프트웨어</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>멀티미터</td><td>Fluke</td><td>75 시리즈 II</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Celltreat Scientific 제품</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>재질 보기 KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

복부 색소 침착 정량화<em&gt; drosophila melanogaster</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

색소 침착은 형태 적으로 간단하지만 매우 가변적 인 특성으로 종종 적응의 중요성이 있습니다. 그것은 형태 학적 표현형의 발달과 진화를 이해하기위한 모델로서 광범위하게 사용되어왔다. Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 은 특히 ​​유용하여 연구원은 형태학의 내부 및 내부 특이성 변이의 기초가되는 좌위를 확인할 수있었습니다. 그러나, D. melanogaster 복부 색소 침착은 색소 침착 데이터에 적용 할 수있는 통계 분석의 형태를 제한하는 정량적 인 것이 아니라 정량적으로 정량적으로 분석되어왔다. 이 작품은 성인 D. melanogaster 의 복부 색소 침착 패턴의 다양한 측면을 정량화 할 수있는 새로운 방법론을 설명 합니다. 이 프로토콜에는 표본 장착, 이미지 캡처, 데이터 추출 및 분석이 포함됩니다. 이미지 캡처 및 분석 기능 매크로에 사용되는 모든 소프트웨어오픈 소스 이미지 분석을 위해 작성되었습니다. 이 방법의 장점은 다른 이미징 시스템에서 재현성이 높은 방법론을 사용하여 색소 특성을 정확하게 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 기법은 성인 D. melanogaster 의 tergal pigmentation 패턴의 변이를 측정하는 데 사용 되었지만 ,이 방법은 무수히 많은 유기체에서 색소 침착 패턴에 유연하고 광범위하게 적용될 수 있습니다.

프로토콜은 복부 색소 침착에 온도를 키우는 효과를 탐색하는 데 사용되었습니다. 이전 연구에 의하면 발달 온도의 증가는 D. melanogaster 30 , 32를 포함 하여 여러 종의 초파리 에서 복부 색소 침착의 확산을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 특히, 복부 tergites 3과 4, 착색의 범위 (안료 밴드의 폭) 17 ° C에서 25 ° C로 감소하고 25 ° C에서 28 ° C 24,36 동일하게 유지됩니다. 이 연구는 1-10 등급 (0 : 안료 밴드 없음, tergite 완전 황색, 5 : 색소 밴드는 tergite의 50 %, 10 : tergite는 완전히 어둡다)의 색소 침착 정도를 기록했다. 정량적 방법론이 이러한 표현형 소성을 포착 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 착색은 th17 번 (일곱 개의 파리),...

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

이 방법론의 전반적인 목표는 초파리 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착을 신속하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 형질 특이적 변이 형태의 기초가 되는 유전자 궤적을 식별하고 형태학적 표현형의 발달과 진화를 이해하는 것과 같이 진화 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 색소 침착의 범위와 깊이를 포함하여 복부 색소 침착의 다양한 측면을 비파괴적으로 측정할 수 있다는 점입니다.이 방법은 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 Drosophila 종에도 적용할 수 있으며 다른 곤충 및 동물 분류군의 색소 침착 패턴을 측정하도록 쉽게 조정될 수 있습니다. 이미징 전에 초파리를 70% ethanol에 보관하여 색소 침착 상태를 유지할 수 있습니다. 시각화를 위해서는 마운팅 패드가 필요합니다.60 mm 페트리 접시에 1.25% 수성 한천(agar) 약 10 mL를 채웁니다. 현미경 하에서 미세 핀셋을 사용하여 겔에 길이 20 mm, 너비 2 mm, 깊이 1 mm의 도랑을 팝니다. 하나의 접시에 여러 개의 도랑을 만들 수 있습니다.그 다음, 분석 대상 표면이 겔 표면 바로 위에 오도록 초파리를 트렌치에 매립합니다. 이 경우, 등 쪽 면이 분석 대상입니다. 이제 초파리가 완전히 잠길 때까지 접시에 70% ethanol을 채웁니다.이렇게 하면 큐티클의 반사를 줄여 색소 침착 패턴이 가려지는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 현미경에 연결된 이미징 소프트웨어와 디지털 카메라를 시작하십시오. 광원의 경우, 더블 구스넥 장치의 냉광원으로도 충분합니다.이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 유형을 8-bit로 설정하십시오. 그런 다음 이미지 캡처 소프트웨어에서 Live 설정을 토글하여 카메라 뷰 창을 엽니다. 이미지 유형을 Grayscale로 설정하십시오.이제 광원의 강도를 최대로 설정하고, 조명을 스테이지에서 약 120 millimeters 떨어진 곳에 배치하십시오. 시야 너비가 3 millimeters가 되도록 현미경 배율을 60배로 설정하십시오. 그런 다음 2 millimeter 스테이지 마이크로미터를 시야 내에 놓고 초점을 맞추십시오.소프트웨어로 돌아가 노출 박스에 있는 필드를 사용하여 마이크로미터가 보이도록 노출 시간을 조정하십시오. 그런 다음 스케일을 설정하십시오. 직선 도구를 열고 스테이지 마이크로미터를 따라 2 mm 길이의 선을 그리십시오.그런 다음 Set Scale 옵션에 해당 길이를 입력하십시오. 그러면 창에 마이크론당 픽셀 단위의 배율이 표시됩니다. 해당 배율을 기록하고 설정을 확인(OK)하십시오.이제 이미지 캡처 소프트웨어로 돌아가 Stop 및 Snap 명령을 사용하여 스테이지 마이크로미터의 이미지를 캡처하십시오. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어로 돌아가 이미지를 Tiff 파일로 저장하십시오. 이제 고정된 초파리의 등쪽 정중선에 초점을 맞추십시오.최상의 이미징 결과를 얻으려면 정중선이 수직으로 위치해야 합니다. 날개와 기타 돌출된 구조물을 옆으로 밀어내고, 큐티클이 가장 잘 조명되도록 조명을 조정하십시오. 다음으로, 이미지 캡처 소프트웨어에서 픽셀 값 히스토그램을 가이드로 사용하여 노출을 설정함으로써 포화 없이 이미지의 전체 픽셀 범위를 캡처하여 대비를 최대화하십시오.실험 전반에 걸쳐 이 노출과 조명 설정을 유지하십시오. 이제 이미지를 캡처하기 전에, 관심 있는 복부 마디가 시야에 들어오는지 확인하십시오. 그런 다음 이미지를 캡처하고 파일 이름에 샘플 ID 번호를 포함하여 이미지를 저장하십시오.서면 프로토콜에 설명된 형식을 사용하십시오. 이 분석에는 저자가 제공한 매크로가 사용됩니다. 분석할 이미지 시리즈는 모두 동일한 파일 폴더 내에 포함되어 있어야 합니다.이제 매크로를 시작하고 안내되는 명령어를 따르십시오. 먼저, 저장된 파일의 위치를 지정하십시오. 그런 다음 분석 데이터가 저장될 위치를 지정하십시오.다음으로, 소프트웨어가 이미지 시리즈를 올바르게 읽을 수 있도록 파일 이름에 사용된 문자 수를 입력하십시오. 다음 프롬프트는 관심 영역(region of interest)의 너비를 설정하는 단계입니다. 여기에는 분석이 필요한 전후방 스트립(anterior-posterior strip)을 따라 측정된 픽셀 수를 입력하십시오.이제 프롬프트에서 시리즈의 첫 번째 이미지를 분석하도록 선택하십시오. 다른 옵션으로는 시리즈의 다음 이미지를 분석하거나 분석을 종료하는 것이 있습니다. 선 도구가 자동으로 선택됩니다.이를 사용하여 이미지 상의 전방에서 후방 방향으로 선을 그려 정중선을 식별하십시오. 다음으로, 매크로 프롬프트에 따라 라인 도구를 사용하여 Tergite4의 후방 가장자리를 식별하십시오. 라인 도구를 사용하여 후방 정중선 가장자리에서 우측 외측 가장자리까지 선을 그리며, 이때 선의 중심이 색소 띠의 후방 가장자리 바로 뒤에 위치하도록 합니다.그 다음, 라인 도구를 사용하여 Tergite4의 앞쪽 가장자리를 정의합니다. 앞쪽 중앙선 가장자리에서 오른쪽 외측 가장자리까지 선을 긋습니다. 흰색 사각형으로 표시되는 선의 중앙은 옅은 색의 큐티클 앞쪽 가장자리에 위치해야 합니다.이 정보를 바탕으로 매크로는 이제 색소 침착 프로필을 생성합니다. 하지만 강모나 기타 결점이 프로필 측정 라인을 가로지르는 경우 프로필이 부정확할 수 있습니다. 이를 수정하려면 히스토그램 창에서 Live preview를 선택하고 프로필이 매끄럽게 나타나도록 라인을 조정하십시오.이미지 분석 스트립이 색소 침착의 다양한 측면을 정확하게 포착하려면, 이미지 또는 표본의 불규칙성으로 인한 노이즈가 최소화되는 분석 영역을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이제 동일한 이미지에서 Tergite3를 분석한 다음 다음 이미지로 이동하십시오. 설명된 절차는 사육 온도로 인해 발생하는 복부 색소 침착의 알려진 변화를 탐구하는 데 사용되었습니다.세 번째와 네 번째 등판을 다양한 조명과 노출 조건 하에서 여러 차례 관찰하였습니다. 색소 침착의 다양한 측면을 탐구하였습니다. 특히, 초파리를 더 낮은 온도에서 사육했을 때 색소 침착 띠가 더 넓어진다는 것을 발견하였습니다.계산된 값들을 동일한 파리들을 대상으로 다섯 명의 서로 다른 관찰자가 수행한 일반적인 주관적 측정치와 비교하였습니다. 암컷 파리 45마리를 평가한 결과, 네 번째 복부 색소 띠 너비에 대한 평균 관찰 순위는 매크로의 자동 측정값과 밀접하게 상관관계가 있었습니다. 동일한 색소 띠를 영상 소프트웨어를 사용하여 수동으로 측정하기도 하였습니다.이러한 결과는 매크로를 사용하여 생성된 측정값과도 강한 상관관계를 보였습니다. 이후 세 번째와 네 번째 색소 띠의 색소 침착이 증가하는 것으로 잘 알려진 암컷 ebony 돌연변이체의 색소 침착을 측정하여 소프트웨어를 테스트했습니다. 또한, 이 방법은 야생형 암컷의 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 띠를 측정하는 데에도 사용되었습니다.자동화된 기법은 색소 밀도와 밴드 크기에 대한 유용한 측정값을 항상 제공하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 Drosophila의 복부 색소 침착을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기법을 숙달하려면 주로 핀셋을 능숙하게 사용하는 능력이 필요합니다.이 기술의 이미징 단계를 숙달하면 시간당 50개의 시료를 처리할 수 있습니다. 이러한 이미지에서 색소 침착 측정값을 추출하는 작업은 시간당 70장의 이미지 속도로 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는​​ 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.

준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법

초파리는 암 치료를 위한 잠재적인 적용을 가진 약물을 선별하기 위하여 적당히 널리 이용되는 실험적인 모형입니다. 여기에서, 우리는 헤테로크로마틴 형성을 촉진하는 소분자 화합물을 스크리닝하는 방법으로 서 드로소필라 의 사용 바리게이트 눈 색 표현형을 기술한다.

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상처 유발 다중계화는 세포가 세포 손실을 보상하기 위해 분할하는 대신 크기로 성장하는 보존된 조직 수리 전략입니다. 여기에 상피 상처 수리에서 ploidy 및 유전 적 조절을 측정하는 모델로 과일 비행을 사용하는 방법에 대한 자세한 프로토콜입니다.

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멜라닌 세포 기능의 조절제는 색소 침착 결과의 눈에 보이는 차이를 지배합니다. 후보 색소 침착 유전자의 분자 기능을 해독하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서 우리는 제브라피쉬 모델 시스템을 사용하여 후보를 식별하고 멜라닌 함량과 멜라닌 세포 수의 조절자로 분류하는 방법을 보여줍니다.

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우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

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초파리 안구 시스템은 다양한 생물학적 과정, 특히 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 거친 눈 표현형의 수동 정량화는 편향되어 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 여기에서는 ilastik과 Flynotyper를 사용하여 편견 없는 방식으로 눈 표현형을 정량화하는 방법을 설명합니다.

Drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 Flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식

여기에서는 패터닝 및 성장 결함을 정량화하기 위해 성인 초파리 눈의 고해상도 이미징을 위한 빠르고 저렴한 워크플로우를 제시합니다. 포인트 마운팅(point-mounting), 고해상도 이미지 획득(high-resolution image acquisition) 및 이미지 분석을 통한 시료 전처리를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

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학습하세요 Drosophila melanogaster 복부 색소 침착을 디지털 이미지 분석으로 정량화하는 방법을. 비파괴 측정으로 진화생물학 및 형태학적 변이 연구에 활용할 수 있습니다.

복부 색소 침착 정량화

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