Name: 쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 쥐 두뇌 깊은 영역에서 조직 손상 없이 정밀한 미세주입을 수행하는 개인화된 석영 바늘 기법을. 이 방법은 신경퇴행성 및 정신 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 유럽 공동체 [FP7-사람-2011-IAPP 프로젝트 285827 (EPIXCHANGE)]에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다.

모든 실험 프로토콜은 동물 실험에 대 한 페라라 대학 윤리 위원회 및 건강의 이탈리아 정부에 의해 승인 되었다. 도착 (동물 연구: Vivo 실험에서 보고11) 지침에 따라 되었습니다.
1입니다. 석 영 바늘의 준비
<ol><li>깨끗 하 고 증류수에 5 분, 에탄올 99%, 5 분 및 5 분 diethyl-에테르에서 그들을 배치 하 여 석 영 모 세관 ( 재료의 표참조)을 소독.</li>
	<li>그들이 말리 면 완전히에 적어도 1 시간에 대 한 후드 아래 모세 혈관을 남겨 주세요.</li>
	<li>개인의 요구에 따라 충분히, 충분히 얇은 바늘의 생산을 허용 하는 매개 변수에 따라 레이저 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘을 준비 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 레이저 끌어당기는 사람 ( 재료의 표참조). 당기기를 위한 두 줄 프로그램을 사용 합니다. 첫 번째 줄 (값에 해당 하 필 라 멘 트) 최대 스캔 길이 높은 전력과 아무 당기는 힘을 사용 합니다. 매개 변수이 조합의 내부/외부 대형으로 긴 바늘의 형성을 허용 가장 낮은 확장 속도와 모 세관의 큰 부분을의 용 해를 리드 하 고 정강이 감소. 이 방법에서는, 바늘 높은 기계적인 저항 및 막힘 없이 줄기 세포 또는 바이러스 성 입자의 통과 허용 하는 넓은 내부 직경을 유지 합니다. 팁 너무 작고 긴, 필요한 기계 및 모양 특성 누락 되기 전에 속도 및 지연이 프로그램 라인의 모 세관 확장을 중지 해야 합니다. 일단 석 영 식 당기 프로그램의 두 번째 줄 자동으로 실행 됩니다 (5 s). 전원, 필 라 멘 트 및 당기는 힘의 매개 변수는 가장 짧은 가능한 팁 길이와 두 바늘 팁 파열으로의 분리를 피하고 가파른 칼 팁을 잘라 작동. 정기적으로, 우리의 장비와 우리가 사용 하 여 다음과 같은: 1 (a) = 전력 990, 필 라 멘 트 5, 속도 130, 지연 110, 풀 0; (b) 선 2 전원 970, 필 라 멘 트 3, 속도 0, 70, 지연 = 0를 당겨.</li>
	<li>이전에 70% 에탄올으로 청소 페 트리 접시에 바늘을 넣어.<ol>
<li>커버 플라스틱 파라핀 영화와 요리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마이크로-것에는 모세 혈관을 잘라.<ol>
<li>시작, 레이저 파워를 확인 하는 autocalibration 프로세스 실행 및 에너지 전달 하자. 절삭 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 마이크로 것 ( 재료의 표참조) 및 다음 매개 변수: 레이저 펄스 에너지 (63 µJ), 최대 조리개의 20%의 레이저 빔 직경 (최대 조리개: 1.0 µ m), 및 최대 속도 (최대 10%의 절삭 속도 속도: 30 µ m/s).</li>
		<li>단단히 현미경 테이블에 바늘을 해결 하 고 컴퓨터 스크린의 센터에서 그것의 팁의 위치.</li>
		<li>메뉴 모음에서 연필 아이콘을 클릭 하 고 바늘의 레이저 절단에 대 한 마크를 그릴을 사용 합니다. 참고: 컷 바늘 표면에 관하여 약 45 °의 각도에서 해야 합니다.</li>
		<li>사이드 바 기능에 수 있도록 이전에 표시 된 자리를 잘라 레이저 "컷 시작" 버튼을 포함 하는 플래그를 선택 합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 1.5.2-3;에 설명 된 절차를 반복 하 여 측면 구멍을 잘라 있다 (그림 1) 바늘 위치를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>청소 잘라 후.<ol>
<li>플라스틱 튜브를 통해 무효 펌프에 바늘을 연결 합니다.</li>
		<li>펌프를 켜고 수동으로 중간 속도 (3 µ L/min)에서 앞으로 흐름 속도 설정.</li>
		<li>99% 에탄올을 발음 먼저 고 다음 증류수는 절단으로 불순물을 제거.</li>
		<li>99% 에탄올을 다시 건조를 쉽게 발음 참고: 각 단계 3 분 이상 지속 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 날까지 제대로 커버 페 트리 접시에 바늘을 저장 합니다.</li>
	<li>바늘을 다시 사용할 수 있습니다; 실험의 끝에, 표 백제 및 솔루션 및 가능한 조직 잔류물을 제거 하는 에탄올 청소. 더 완전 한 청소, 아래쪽을 가리키는 팁 micropipette 저장 항아리에 바늘을 넣어 팁 커버 때까지 증류수로 항아리를 작성, 어떤 남은 조직을 제거 후 에탄올으로 씻어 1.5 분 동안 끓여 야.</li>
</ol>2입니다. 절차
<ol><li>펌프 사용 설명서에서 제공 하는 지침에 따라 직경/microinjection 주사기의 볼륨에 따라 펌프를 보정 하 여 0.3 µ L/min 흐름 속도 설정 설정 메뉴를 선택 합니다.</li>
	<li>멸 균 물 10 mL 주사기 (무딘 바늘 (예를 들어, 해밀턴 바늘, 30 G)와 짧은 소계 튜브 장착)를 (후에 아주 조심 스럽게 피스톤을 제거 하는 데) microinjection 주사기와 주입을 채우기 위해 그것을 사용 하 여 수동 microinjection 펌프 (MMP)에 대 한 어셈블리 부품 키트. 참고: MMP 키트 정위 적 프레임 (그림 2)에서 바늘을 안전 하 게 마운트 하는 데 사용 됩니다. 키트 포함: 소계 튜빙, 루어 대 튜브 커플러, 피 펫 홀더 및 다른 외부 직경을 가진 펫에 대 한 가스 켓.</li>
	<li>MMP 키트에 바늘을 연결 합니다.<ol>
<li>10 mL 주사기를 통해 시스템에 걸쳐 더 많은 물을 플러시 고 물 바늘 나오는 여부를 확인 합니다. 참고: 작성 단계를 반복 하 여 시스템 내부의 모든 기포를 제거 해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection 주사기의 상단에 물 한 방울을 남겨두기 위하여 피스톤을 천천히 추진 하는 동안 microinjection 주사기에서 10 mL 주사기를 분리 합니다. Microinjection 주사기에서 피스톤을 삽입 합니다.</li>
	<li>Microinjection 주사기 펌프에 연결 하 고 0.3 µ L/분 유량을 설정 합니다. 참고: 드롭 바늘의 팁에서 유출 될 때까지 대기 하 고 가자 또 다른 3 분.</li>
	<li>0.1 µ L/min에서 흐름을 설정 하 고 수술 절차를 시작 합니다. 펌프는 수술을 수행 하는 동안 진행 해야 합니다. 참고:이 문서에서 보고 하는 실험에 대 한 우리 300 g (3 개월의 나이)의 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 합니다. 그러나, 절차는 특히 다른 종, 마우스에 적용 됩니다.</li>
	<li>지역 규정에 의해 승인 하는 방법을 사용 하 여 전신 마 취를 유도. 참고: 우리는 마 취의 20-50 분 85 mg/kg 케 타 민 및 8 mg/kg xylazine의 복 주사 (i.p.)의 혼합을 사용합니다. 그것은 중요 한 꼬리 및 발가락 pinches 동물 진정 완벽 하 게 보장 하기 위해 사용 됩니다. 수술 시작 하 고 수술을 수행 하는 동안 10 분 마다 모니터링 하기 전에 마 취와 기본적인 생체의 수준 평가 됩니다. 중 고 물 다시 순환가 열 패드를 사용 하 여 수술 후 동물 체온 전에 일정 유지 됩니다. 동물에 게는 완전히 복구 될 때까지 모니터링 (예: 그들은 직 립 보 행). 또한, 동물 받을 진통제 (tramadol, 5-7 mg/kg i.p.) post-operatively 모든 24 시간 3 일 동안.<ol>
<li>동물의 머리를 면도 하 고 무 균 수술을 위한 외과 사이트를 적절 하 게 준비. 2 단계 스크럽 요오드 기반 솔루션 (Betadine) 70% 에탄올 다음을 수행 합니다. 또한, 무 균 상태를 유지 하려면 수술 드 레이프와 외과 사이트 랩 (비디오에서 생략 되었습니다 데모 목적을 위해).</li>
	</ol></li>
	<li>다시 난방 담요를 순환 하는 물 위에 stereotaxic 프레임에 쥐를 놓습니다. 수술의 사이트에 제공 하기 위해 추가 통증 완화, 0.5 %lidocaine 솔루션을 적용 (7 mg/kg을 초과 하지 않는). 미리 모든 수술 기구를 소독 살 균 물 또는 식 염 수와 린스 다음 immerging 장비 중 2%도 플러스 7.05% 페 놀 (Sporodicin 또는 Cidex)에 의해 비드 소독 기 또는 액체 냉 소독을 사용 하 여. 소독 절차 사이 수행 되어야 합니다. 멸 균된 메스를 사용 하 여 두개골에 경도 커트를 만드십시오. 과도 한 출혈을 방지 하려면 부드러운 수 있습니다. 편평한 주걱을 사용 하 여 두 피를 열고 뜨고 피부의 플랩에 수술 클립을 적용 합니다. 아주 부드럽게는 bregma와 두개골을 통해 바늘을 삽입 됩니다 영역을과 분리 합니다.</li>
	<li>(동안 흐름은 지속적인) 팔 stereotaxic 프레임에 탑재 고 주목 하지 팁 휴식 bregma 위에 정확히 바늘의 팁을 이동 합니다. bregma의 antero 후부 및 평점 옆 좌표에 주석을 추가 하 고 원하는 좌표에 번역. stereomicroscope에 의해 유도, 낮은 끝 거의 지는 두개골 때까지 바늘 표시 드릴링 자리 stereotaxic 팔을 약간 올리는 후.</li>
	<li>드릴 (드릴 팁 Ø: 0.8 m m, 드릴 속도: 1000 rpm) 표시 된 자리에서 두개골. 하지 드릴링 절차 동안 경질을 침투를 주의 해야 합니다. 드릴링, 하는 동안 뼈 손상과 괴 사를 방지 하려면 메 마른 염 분 드립.</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화의 작은 조각을 삭감 하 고 두개골에 배치. 10 µ L 피펫으로 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화에 삽입 하는 솔루션의 드롭을 확인 합니다. 펌프를 중지, 약간 펌프의 미는 사람을 검색 하 고 microinjection 주사기의 피스톤을 부드럽게 당겨서 작은 공기 방울이 모 세관에서 만들.</li>
	<li>낮은 정위 적 팔 때까지 바늘의 끝에 도달 하면 드롭. (아주 천천히) 어떤 거품 형성을 피하고 microinjection 주사기의 피스톤을 잡아 당겨 샘플을 그립니다. 피스톤 접촉 펌프 미 장착 하 고 단계로 진행 하기 전에 한 방울 (몇 분)의 형성까지 0.3 µ L/분 대기의 유량에 펌프를 켭니다. 참고: 현재 예제 실험에서 인공 척수 (실제)은 주입는 (AP: 1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) 등 해 마에 (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; mm dura)에서에서 2 µ L/사이트. 두 개의 사출 방법 간의 비교를 촉진 하기 위하여 각 뇌 영역 한 반구와 26 G 무뚝뚝한 끝에 석 영 바늘 이나 다른 30 G 베벨 팁 스테인리스 바늘을 사용 하 여 주입 했다.</li>
	<li>낮은 0.1 µ L/min 흐름, 경질 스테인리스 스틸 경사 팁 바늘으로 닉 및 천천히 뇌 조직 입력 dorso 복 부 도끼에 정위 적 팔. 원하는 위치에 도달 하면 추가 0.1 m m 아래로 펌프, 0.1 m m 여 정위 적 팔을 인상 멈추고 0.3 µ L/min 흐름에 펌프 다시 시작 이동 합니다. 참고: 바늘을 낮추고 있는 동안 느린 흐름을 유지 하는 이유는 바늘 자체에 직물의 작은 파편의 침투를 방지 하는 긍정적인 압력을 보장 하기 위해. 이러한 이벤트는 팁, 솔루션의 제공을 방해 방해 것 이라고. 이후 흐름 속도가 매우 느린 약 10 s/m m는 바늘과 저하의 속도 낮추는 동안,이 바늘 트랙을 따라 남아 있는 솔루션의 금액은 무시할 대상 사이트에 삽입 하는 그에 비해 의미 합니다. 측면 구멍으로 바늘을 사용 하 여이 경고를 피할 수 있습니다.</li>
	<li>타이머를 시작 하 고 (예를 들어 6 분 40 s 2 µ L를 주입 하는 경우) 주입을 원하는 볼륨에 따라 필요한 시간 기다립니다. 주입 하는 동안 거품 움직임을 모니터링 합니다. 끝에, 펌프를 중지 하 고 천천히 바늘을 검색 하기 전에 5 분 기다립니다. 석 영 바늘 완전히 추출 펌프를 다시 시작 하 고 바늘의 끝에 한 방울의 형성에 대 한 확인.</li>
	<li>뼈 왁 스로 두개골 표면에 개통을 밀봉, hemostatic 클립을 제거 하 고 두 피를 봉합, 항생제 크림 (예를 들어, neosporin) 상처 주변 코트 그리고 홈 케이지 동물 돌아갑니다. 참고:이 문서에서 설명 하는 실험에 대 한 기관 윤리 위원회에 의해 승인 안락사 프로토콜에 따라 동물 깊이 43 mg/kg 케 타 민 및 7 mg/kg xylazine의 i.p. 주사와 마 취 고 참. 48 h를 포함 하는 파라핀 포 르 말린에 postfixed 두뇌 제거 되었다. 두뇌의 코로나 섹션 (8 µ m)는 톰을 사용 하 여 얇게 했다.</li>
</ol>

<ol><li>Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li>
<li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li>
<li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+pay+attention%3A+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation%2C+diurnality%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li>
<li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+delivery+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li>
<li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+RevNeurol%22%5BJournal%5D)">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li>
<li>Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin%2C+Quinolinic+Acid%2C+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li>
<li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 설명 하는 기술은 microinjections 다양 한 목적으로12수행 되는 최적화에 대 한 소개 에 설명 된 요구 사항을 충족. 여기에 설명 된 바늘 최소, 본질적으로 감지할 수 없는 수준; 손상을 감소합니다 (구 부 경향이 있는) 유리 바늘으로 분산, 석 바늘은 딱딱한 고 깊은 좌표에도 원하는 뇌 영역의 신뢰할 수 있는 히트를 보장. 또한, 측면 구멍 팁 구멍 뇌 조직에 삽입 하는 동안 차단 되는 경우에 솔루션의 납품을 보장 합니다.
한계와 대안입니다. 높은 융해 점 때문에 석 영 모세는 기존의 끌어당기는 사람, 즉에 뽑아 수 없습니다, 그리고 그들은 비용이 많이 드는 장비에 액세스 해야. 유리 모 세관은 피해 조직으로, 주사 깊은 구조에 대 한 신뢰할 수 있고 더 연약한 덜 (즉, 디자인 측면에서 덜 유연)을 피하고 측면에서 동...

Microinjections는 특정 뇌 영역에 신경 활동을 조절 하 약리학 활성 화합물의 배달에 대 한 오랜 동안 사용 되어 왔습니다. 그들은 또한, 신경 이벤트 특정 질병, 예를 들면 6-hydroxy-도파민 nigrostriatal 도파민 시스템을 모방 하는 파 킨 슨 병에서의 특성을 모방 하기 위해 특정 신경 인구 근처 독 소를 주입 하 사용 되었습니다. 1 , 2 또는 병 해 시스템3변 하 immunotoxin 192 IgG saporin. 더 최근에, microinjection 절차 실험적인 뇌 장애4,5의 유전자 또는 세포 치료에 대 한 바이러스 성 벡터 또는 세포 이식 제공 하 사용 되었습니다.
이러한 연구에 사용 하는 바늘의 고전적인 유형의 스테인레스 스틸로 이루어집니다. 비록 간단 하 고 실용적인 사용을, 강철 바늘 문제6의 번호가: 그들은 비교적 큰 하 고 손상을 줄 수 있습니다 조직의 혈액-뇌 장벽의 누설 및 이다;의 활성화 또한, 그들은 심지어 완전히 원하는 솔루션의 흐름을 피 하거나 장애물을 만드는 바늘에 되 면 뇌 조직의 유선을 생산할 수 있습니다. 더 최근에, 유리 바늘 준비 임시 모세 혈관에서에 도입 되었습니다7,8을 사용. 이러한 중요 한 조직 손상도 사이토 활성화를 발생 하지 않습니다 하지만 상대적으로 유연 하 고 깊은 구조, 지역화 (개인적인 관측)의 정확도 감소에서 소개 될 때 구 부 수 있습니다.
따라서 만큼 손상 (특히 손상을 치료 하는 실험을 수행할) 때 정확성과 재현성을 증가 하면서 줄일 필요가 있다 (즉, 모든 솔루션 전달 하 고 올바른 지역화를 확인). 또한, 다양 한 형상의 뇌 영역에 주입 된 솔루션의 최적의 배포를 보장 하기 위해 다른 바늘 디자인을 사용 하는 것이 좋습니다 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 준비 하 고 설치류 두뇌에 있는 microinjections에 대 한 석 영 바늘을 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 높은 융해 점 때문에 석 영 모 세관 기존의 끌어당기는 사람에 뽑아 수 없습니다와 따라서 사용 되지 않은 과거에 바늘을 생성 하. 그러나 석 영,, 유리, 특히 높은 강성 및 브레이크 저항9몇 가지 중요 한 이점을 제공합니다. 그들의 강성 때문에 석 영 바늘은 이상적으로 복 부 뇌 영역으로 주사에 적합 합니다. 파손을 그들의 높은 저항 때문에 그들은 여러 구멍, 복잡 한 형상의10뇌 영역을 대상으로 하는 경우에 가장 효과적인 증명할 수 있습니다. 있는 디자인을 얻기를 포함 하도록 모델링할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>석영 모세관</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>필라멘트</td></tr><tr><td>풀러</td><td>없음 Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 보관 용기</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>레이저 마이크로 디스섹터</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>해밀턴 ILS 혁신적인 노동 시스템 GmbH, St&Yuml; tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>모델 864</td><td></td></tr><tr><td>수동 microinjection 펌프 키트</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>키트를 stereotactic 프레임에 안전하게 장착할 수 있도록</td></tr> 정밀 <tr><td>드릴</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>볼 베어링 구동축, 가변 속도</td></tr><tr><td>인공 대뇌 척수 액</td><td>토크 리스</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>바늘 26g 둔기/30g 베벨</td><td>해밀턴</td><td>26g 무딘 : 19138-U 30G 베벨: 20757</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 톰</td><td>라이카, 독일</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 두뇌에 있는 microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections 약물 또는 특정 뇌 영역 내에서 독 소의 배달에 대 한 오랜 시간 동안 사용 되었습니다 그리고 더 최근에, 그들은 유전자 또는 세포 치료 제품에 사용 되었습니다. 불행히도, 현재 microinjection 기술 사용 여러 이유로 차선은 강철 또는 유리 바늘: 특히, 철강 바늘 조직 손상이 발생할 수 있습니다 및 대상 지역 누락, 두뇌에 깊이 인하 유리 바늘 구 부 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리가 준비 하 고 유용한 기능의 번호를 결합 하는 석 영 바늘을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 바늘 감지 조직 손상 생성 하지 않는다 그리고, 깊은 좌표를 사용 하는 경우에 원하는 뇌 영역에서 신뢰할 수 있는 전달 되도록 매우 엄격한 되 고. 또한, 원하는 직경의 여러 구멍을 만들어서 바늘의 디자인 맞춤 가능 하다. 여러 구멍 큰 구멍 세포의 주입을 용이 하 게 하는 반면 더 큰 영역 내에서 솔루션의 대용량의 주입을 촉진 한다. 또한, 이러한 석 영 바늘 청소 하 고 절차 비용 효과적 되는 다시 사용 될 수 있습니다.

우리 쥐 지 마에가 두 클래식, 26 G 무뚝뚝한 끝 및 30 G 베벨 가장자리와 비교 석 바늘 (60 µ M 외부 직경 팁; 한 20 µ M 직경 옆 구멍 유형 C, 그림 1)를 사용 하 여 직접 microinjection에 의해 유도 된 손상 비교 스테인레스 스틸의 바늘 이 목표를 우리는 오른쪽에 실제의 2 µ L를 주입 하 고 얼룩이 지는 Hematoxylin 오신 (그)를 사용 하 여 조직 손상 평가 했습니다 왼쪽 등 쪽 해 마가 각각 사용 하 여 석 영 강철 바늘과, 48 h 주입 후. 우리는 더 나은 주입 감사 다른 바늘에 의해 생산 하는 심각한 기계적 손상 후 초기 시간 포인트를 선택 (시간, 조직 복구 메커니즘 수 무명 초기 손상)7.
위에서 설명한 프로...

우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

본 방법론의 전반적인 목표는 검출 가능한 조직 손상을 일으키지 않고 심부 영역에서도 신뢰할 수 있는 전달을 보장하는 개인 맞춤형 재사용 가능 석영 바늘을 이용하여 뇌 미세주입 프로토콜을 개선하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 및 정신 질환의 병태생리와 바이러스 벡터 및 세포 이식을 통한 유전자 및 세포 치료의 효과와 같은 신경과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주요 장점은 이러한 바늘이 검출 가능한 조직 손상을 전혀 일으키지 않아 뇌 심부 영역에서의 신뢰할 수 있는 전달을 보장한다는 점입니다.이들은 세척 후 재사용이 가능하여 비용 효율적입니다. 이 절차를 시작하려면, 쿼츠 모세관을 증류수에 5분 동안 담가 세척 및 멸균합니다. 이어서 99% ethanol에 5분, 그리고 diethyl ether에 5분 동안 담급니다.그 다음, 모세관을 후드 안에 최소 1시간 동안 두어 완전히 건조시킵니다. 그동안 레이저 풀러(laser puller)를 사용하여 길고 가는 니들을 준비합니다. 그런 다음 70% ethanol로 미리 세척한 페트리 접시에 니들을 놓습니다.디쉬를 플라스틱 파라핀 필름으로 덮습니다. 다음으로, 마이크로 디섹터로 모세관을 절단합니다. 바늘을 현미경 테이블에 단단히 고정하고 그 끝을 컴퓨터 화면의 중앙에 위치시킵니다.메뉴 바에서 연필 아이콘을 클릭하고 이를 사용하여 바늘을 절단할 지점에 표시를 그립니다. 사이드 바 기능에서 Start Cut 버튼이 포함된 탭을 선택하여 레이저가 이전에 표시한 지점을 절단하도록 합니다. 필요한 경우, 바늘의 위치를 변경하지 않은 상태에서 표시를 그리고 절단 절차를 반복하여 측면 구멍을 절단합니다.바늘을 절단한 후, 플라스틱 튜브를 통해 진공 펌프에 연결합니다. 다음으로 펌프 전원을 켜고 전방 유량을 분당 3 µL로 수동 설정합니다. 그 후 99% ethanol과 증류수를 차례로 흡입하여 절단으로 인해 발생한 불순물을 제거합니다.그 후, 건조를 돕기 위해 99%ethanol을 다시 흡입하여 제거합니다. 이어서 수술 당일까지 적절하게 덮인 페트리 접시에 바늘을 보관합니다. 바늘을 재사용하려면 실험 종료 후 적절한 세제와 70%ethanol로 세척하여 주입된 용액과 남아 있을 수 있는 조직 잔해를 제거하십시오.필요한 경우, 이 바늘들을 증류수가 채워진 전용 유리병에 넣고 끓일 수 있습니다. 이 단계에서는 설정 메뉴를 선택하여 미세주입 시린지의 부피당 직경에 따라 펌프를 보정하십시오. 그리고 유속을 0.3 µL/min으로 설정하십시오.그런 다음 10 milliliter 주사기에 멸균수를 채웁니다. 이를 사용하여 미세주입 주사기와 수동 미세주입 펌프용 주입 조립 부품 키트를 채웁니다. 그 후, 바늘을 수동 미세주입 펌프 키트에 연결합니다.미세주입용 주사기 상단에 물 한 방울이 남도록 피스톤을 천천히 밀면서 10 milliliter 주사기를 미세주입용 주사기에서 분리하십시오. 그다음, 피스톤을 미세주입용 주사기에 삽입하십시오. 이제 미세주입용 주사기를 펌프에 연결하고 유량을 0.3 microliters per minute로 설정하십시오.이어서 유량을 0.1 µL/min으로 변경하고 수술 절차를 시작합니다. 수술을 수행하기 위해 동물의 머리를 삭모하고 알코올 솜으로 닦아냅니다. 다음으로, 쥐를 정위 고정틀에 배치합니다.멸균된 메스를 사용하여 두개골 위로 세로 절개를 합니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 조심스럽게 진행하십시오. 그 다음, 평평한 스패튤라를 사용하여 두피를 열고, 피부 플랩에 수술용 클립을 고정하여 열린 상태를 유지합니다.골막을 매우 조심스럽게 분리하여 브레그마(bregma)와 바늘이 삽입될 두개골 부위를 노출시킵니다. 이어서 암(arm)을 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 장착하고, 바늘 끝이 부러지지 않도록 주의하며 바늘 끝을 브레그마 바로 위로 이동시킵니다. 브레그마의 전후 및 내외측 좌표를 기록한 후, 바늘을 원하는 좌표로 이동시킵니다.그런 다음, 바늘의 끝이 두개골에 거의 닿을 때까지 내린 후, 정위 고정 장치의 암(arm)을 약간 들어 올려 천공 위치를 표시합니다. 뇌막과 뇌가 손상되지 않도록 주의하며 표시된 지점의 두개골을 천공합니다. 다음으로, 작은 조각의 플라스틱 파라핀 필름을 잘라 두개골 위에 놓습니다.10 µL 파이펫을 사용하여 용액 한 방울을 만든 후 플라스틱 파라핀 필름 위에 도포합니다. 펌프를 멈추고, 펌프의 푸셔를 약간 뒤로 당긴 다음 마이크로인젝션 시린지의 피스톤을 부드럽게 당겨 모세관 내에 작은 공기 방울을 생성합니다. 바늘 끝이 용액 방울에 닿을 때까지 내립니다.기포가 생성되지 않도록 마이크로인젝션 시린지의 피스톤을 매우 천천히 당겨 시료를 흡입합니다. 펌프 푸셔를 피스톤에 접촉시킨 후, 유량을 0.3 microliters per minute로 설정하여 펌프를 작동시킵니다. 그다음, 액적(drop)이 형성될 때까지 기다린 후 다음 단계로 진행합니다.그 후, 유량을 0.1 µL/min으로 낮춥니다. 스테인리스강 베벨 팁 바늘을 사용하여 경막에 작은 구멍을 내고, 바늘을 천천히 내려 뇌 조직으로 진입시킵니다. 원하는 위치에 도달하면 0.1 mm 더 내려간 다음 펌프를 중단합니다.스테레오택식 암(stereostatic arm)을 0.1 mm 올리고 펌프를 분당 0.3 µL의 속도로 다시 작동시킵니다. 그 후, 타이머와 주입을 시작하십시오. 주입하는 동안 기포의 움직임을 모니터링하십시오.마지막으로 펌프를 멈추고 5분간 기다린 후 바늘을 천천히 회수합니다. 석영 바늘이 완전히 추출되면 펌프를 다시 작동시켜 바늘 끝에 방울이 형성되는지 확인합니다. 다음으로, 두개골 표면의 개구부를 본 왁스로 밀봉합니다.지혈 클립을 제거하고 두피를 봉합합니다. 상처 부위 주변에 항생제 연고를 바르고 동물을 홈 케이지로 돌려보냅니다. 이것들은 선조체 수준에서 절단한 8 µm 두께의 쥐 뇌 관상 절편입니다.이 이미지는 26-gauge 둔단 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 2 µL의 ACSF를 주입했을 때 발생한 손상을 보여줍니다. 반대로, 쿼츠 바늘로 주입한 선조체에서는 감지 가능한 손상이 나타나지 않았습니다. 다른 이미지들은 등쪽 해마 수준에서 두 바늘에 의해 유도된 손상을 보여줍니다.하지만 석영 바늘은 감지 가능한 손상을 일으키지 않았습니다. 두 바늘 모두를 이용한 성공적인 주입은 Trypan blue의 분포를 통해 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이러한 절차 이후에는 약물 유도 효과와 같은 다양한 질문에 답하기 위해 추가 수술과 같이 필요한 모든 작업을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 독소 및 약물의 효과, 그리고 최근에는 유전자 및 세포 치료제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 개인 맞춤형 석영 바늘을 사용하여 검출 가능한 손상 없이 뇌의 깊은 영역에 미세 주입을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.레이저 절단된 시약 및/또는 병원균을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 본 절차를 수행할 때는 항상 레이저 안전 수칙 준수 및 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

이 문서에서는, 우리는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 크게, 뇌 손상을 감소 약물의 수동적 확산을 최소화하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수 있습니다.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

이 프로토콜은 마취된 쥐의 표적 뇌 부위에 약물을 정확하게 전달하기 위한 주입체의 조립 및 사용을 개략적으로 설명한 다음 기록된 전기 신호를 통해 신경 세포 활동을 모니터링합니다.

쥐의 뇌에서 전기생리학적 기록을 통한 약물 미세주입

출처: Paolone, G., et al. 설치류 뇌의 미세 주사를 위한 맞춤형 바늘. J. Vis. 경험. (2018).이 비디오는 구멍이 있는 석영 마이크로니들을 사용하여 설치류 뇌 마이크로니들 주사를 보여줍니다. 마이크로니들은 분사 속도를 제어하기 위해 주사기와 마이크로펌프에 부착됩니다. 주사액이 담긴 바늘을 전달 속도를 낮게 설정한 상태에서 뇌에 삽입합니다. 일단 배치되면 배송 속도가 빨라집니다. 잠시 멈춘 후 바늘을 빼냅니다.

석영 마이크로니들을 사용한 설치류 뇌 미세주사

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

메쉬 전자 프로브는 완벽 하 게 통합 하 고 뇌 내에서 기록 하는 안정, 장기, 단일 신경 수준 제공 합니다. 이 프로토콜 메쉬 전자를 사용 하 여 실험에 대 한 vivo에서 , 바늘, stereotaxic 주입, 입/출력 인터페이스, 녹음 실험, 및 조직의 메쉬를 포함 하는 조직학에 로드 메쉬 제품의 제조와 관련 된 조사 합니다.

안정적인 만성 설치류 전기 생리학에 대 한 주사기-주 사용 메쉬 전자

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

이 프로토콜은 단일 신경 줄기 세포와 뇌 슬라이스의 뉴런으로 미세 주입을위한 로봇 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 이 기술은 다재다능하며 높은 공간 해상도로 조직에서 세포를 추적하는 방법을 제공합니다.

로봇 미세 주입을 사용하여 뇌 조각의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작

여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

배우세요 쥐 두뇌 깊은 영역에서 조직 손상 없이 정밀한 미세주입을 수행하는 개인화된 석영 바늘 기법을. 이 방법은 신경퇴행성 및 정신 질환 연구에 활용됩니다.

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

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