쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

이 방법론의 전반적인 목표는 검출 가능한 조직 손상을 일으키지 않고 깊은 영역에서도 안정적인 전달을 보장하는 개인화되고 재사용 가능한 석영 바늘을 사용하여 뇌 미세주입 프로토콜을 개선하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행성 및 정신 질환의 병태 생리학, 바이러스 벡터 및 세포 이식을 통한 유전자 및 세포 치료의 효과와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 이러한 바늘이 감지할 수 있는 조직 손상을 일으키지 않아 뇌 깊은 영역에서 안정적인 전달을 보장한다는 것입니다.

청소하고 재사용할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 이 절차를 시작하려면 석영 모세관을 증류수에 5분 동안 넣어 세척하고 살균합니다. 99% 에탄올에서 5분, 디에틸 에테르에서 5분.

그런 다음 완전히 건조될 때까지 최소 1시간 동안 후드 아래에 모세혈관을 그대로 두십시오. 그 동안 레이저 풀러를 사용하여 길고 가는 바늘을 준비합니다. 그런 다음 70% 에탄올로 미리 청소한 페트리 접시에 바늘을 넣습니다.

플라스틱 파라핀 필름으로 접시를 덮으십시오. 다음으로, 마이크로 해부기에서 모세혈관을 자릅니다. 현미경 테이블에 바늘을 단단히 고정하고 바늘 끝을 컴퓨터 화면 중앙에 놓습니다.

메뉴 표시줄에서 연필 아이콘을 클릭하고 이를 사용하여 절단할 바늘에 대한 표시를 그립니다. 사이드 바 기능에서 Start Cut 버튼이 포함된 플래그를 선택하여 레이저가 이전에 표시된 지점을 절단할 수 있도록 합니다. 필요한 경우 바늘의 위치를 변경하지 않고 표시를 그리고 절단 절차를 반복하여 측면 구멍을 자릅니다.

바늘을 자른 후 플라스틱 튜브를 통해 보이드 펌프에 연결하십시오. 그런 다음 펌프를 켜고 순방향 유량을 분당 3마이크로리터로 수동으로 설정합니다. 그런 다음 99% 에탄올을 흡인하고 증류수를 흡입하여 절단으로 인한 불순물을 제거합니다.

그 후, 건조를 용이하게 하기 위해 99% 에탄올을 다시 흡입하십시오. 그런 다음 수술 당일까지 적절하게 덮인 페트리 접시에 바늘을 보관하십시오. 바늘을 재사용하려면 실험이 끝나면 적절한 세제와 70% 에탄올로 바늘을 세척하여 주입된 용액과 가능한 조직 잔여물을 제거합니다.

필요한 경우 이 바늘을 증류수로 채운 전용 유리병에서 끓일 수도 있습니다. 이 단계에서는 설정 메뉴를 선택하여 미세주입 주사기의 부피당 직경에 따라 펌프를 보정합니다. 그리고 유속을 분당 0.3마이크로리터로 설정합니다.

그런 다음 10ml 주사기에 멸균수를 채웁니다. 그리고 수동 미크론 주입 펌프용 미세 주입 주사기와 사출 조립 부품 키트를 채우는 데 사용하십시오. 그런 다음 바늘을 수동 마이크로 주입 펌프 키트에 연결합니다.

마이크로 주입 주사기에서 10ml 주사기를 분리하면서 피스톤을 천천히 밀어 마이크로 주입 주사기 상단에 물방울을 남깁니다. 그런 다음 피스톤을 마이크로 사출 주사기에 삽입합니다. 이제 마이크로 주입 주사기를 펌프에 연결하고 유속을 분당 0.3마이크로리터로 설정합니다.

그런 다음 유속을 분당 0.1마이크로리터로 변경하고 수술 절차를 시작합니다. 수술을 하려면 동물의 머리를 면도하고 알코올 물티슈로 닦아줍니다. 다음으로, 입위택시 프레임에 쥐를 배치합니다.

멸균된 메스를 사용하여 두개골을 세로로 자릅니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 부드럽게 하십시오. 그런 다음 편평한 주걱을 사용하여 두피를 열고 피부 덮개에 수술 클립을 적용하여 열린 상태를 유지합니다.

매우 부드럽게 골막을 분리하여 브레그마와 바늘이 삽입될 두개골 부위를 노출시킵니다. 그런 다음 입체 프레임에 암을 장착하고 바늘 끝을 브레그마 바로 위로 이동하여 끝이 부러지지 않도록주의하십시오. 브레그마의 전후 및 내측 측면 좌표에 주석을 달고 바늘을 원하는 좌표로 이동합니다.

그런 다음 바늘 끝이 두개골에 거의 닿을 때까지 바늘을 내리고 입위 팔을 약간 올린 후 드릴 지점을 표시합니다. 표시된 지점에 두개골을 뚫고 수막과 뇌가 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 작은 플라스틱 파라핀 필름 조각을 잘라 두개골에 놓습니다.

10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 플라스틱 파라핀 필름에 적용 할 용액을 한 방울 떨어 뜨립니다. 펌프를 멈추고 펌프의 푸셔를 약간 회수한 다음 미세 주입 주사기의 피스톤을 부드럽게 당겨 모세관에 약간의 기포를 만듭니다. 바늘 끝이 방울에 닿을 때까지 내립니다.

기포 형성을 피하면서 미세주입 주사기의 피스톤을 매우 천천히 당겨 샘플을 추출합니다. 피스톤과 접촉하는 펌프 푸셔를 교체하고 분당 0.3마이크로리터의 유속으로 펌프를 켭니다. 그런 다음 다음 단계로 진행하기 전에 드롭이 형성될 때까지 기다립니다.

그런 다음 유량을 분당 0.1마이크로리터로 낮추십시오. 스테인리스 스틸 베벨 팁 바늘로 경막을 긁고 바늘을 천천히 내려 뇌 조직에 들어갑니다. 원하는 위치에 도달하면 0.1mm 더 내려간 다음 펌프를 정지하십시오.

스테레오스태틱 암을 0.1mm 올리고 분당 0.3마이크로리터로 펌프를 다시 시작합니다. 그런 다음 타이머와 주입을 시작하십시오. 주입하는 동안 기포의 움직임을 모니터링합니다.

마지막에 펌프를 멈추고 5분 정도 기다렸다가 천천히 바늘을 빼냅니다. 석영 바늘이 완전히 추출되면 펌프를 다시 시작하고 바늘 끝에 방울이 형성되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 두개골 표면의 개구부를 뼈 왁스로 밀봉합니다.

항상성 클립을 제거하고 두피를 봉합합니다. 상처 주위를 항생제 크림으로 바르고 동물을 가정용 우리로 되돌려 놓는다. 이것들은 선조체 수준에서 쥐 뇌의 8 마이크로 미터 관상 절편입니다.

이 이미지는 26게이지 뭉툭한 끝 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 2마이크로리터의 ACSF를 주입하여 생성된 손상을 보여줍니다. 반대로, 석영 바늘을 주입한 선조체는 감지할 수 있는 손상을 보이지 않았습니다. 이 다른 이미지들은 등쪽 해마 수준에서 두 개의 바늘에 의해 유발된 손상을 보여줍니다.

그러나 석영 바늘은 감지할 수 있는 손상을 일으키지 않았습니다. 두 바늘을 모두 사용한 성공적인 주사는 Trypan blue의 분포에 의해 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이러한 절차에 따라 약물 유도 효과와 같은 다양한 질문에 답하기 위해 추가 수술과 같은 중요한 모든 것을 수행할 수 있습니다. 이 개발 이후, 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 독소와 약물의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었으며, 최근에는 동물 모델에서 유전자 및 세포 치료 제품을 탐구했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 개인화된 석영 바늘을 사용하여 감지할 수 있는 병변 없이 더 깊은 뇌 영역에 미세 주입을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

레이저 해부 시약 및/또는 병원체를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행할 때는 항상 레이저 안전 절차 및 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.