쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

본 방법론의 전반적인 목표는 검출 가능한 조직 손상을 일으키지 않고 심부 영역에서도 신뢰할 수 있는 전달을 보장하는 개인 맞춤형 재사용 가능 석영 바늘을 이용하여 뇌 미세주입 프로토콜을 개선하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 및 정신 질환의 병태생리와 바이러스 벡터 및 세포 이식을 통한 유전자 및 세포 치료의 효과와 같은 신경과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주요 장점은 이러한 바늘이 검출 가능한 조직 손상을 전혀 일으키지 않아 뇌 심부 영역에서의 신뢰할 수 있는 전달을 보장한다는 점입니다.

이들은 세척 후 재사용이 가능하여 비용 효율적입니다. 이 절차를 시작하려면, 쿼츠 모세관을 증류수에 5분 동안 담가 세척 및 멸균합니다. 이어서 99% ethanol에 5분, 그리고 diethyl ether에 5분 동안 담급니다.

그 다음, 모세관을 후드 안에 최소 1시간 동안 두어 완전히 건조시킵니다. 그동안 레이저 풀러(laser puller)를 사용하여 길고 가는 니들을 준비합니다. 그런 다음 70% ethanol로 미리 세척한 페트리 접시에 니들을 놓습니다.

디쉬를 플라스틱 파라핀 필름으로 덮습니다. 다음으로, 마이크로 디섹터로 모세관을 절단합니다. 바늘을 현미경 테이블에 단단히 고정하고 그 끝을 컴퓨터 화면의 중앙에 위치시킵니다.

메뉴 바에서 연필 아이콘을 클릭하고 이를 사용하여 바늘을 절단할 지점에 표시를 그립니다. 사이드 바 기능에서 Start Cut 버튼이 포함된 탭을 선택하여 레이저가 이전에 표시한 지점을 절단하도록 합니다. 필요한 경우, 바늘의 위치를 변경하지 않은 상태에서 표시를 그리고 절단 절차를 반복하여 측면 구멍을 절단합니다.

바늘을 절단한 후, 플라스틱 튜브를 통해 진공 펌프에 연결합니다. 다음으로 펌프 전원을 켜고 전방 유량을 분당 3 µL로 수동 설정합니다. 그 후 99% ethanol과 증류수를 차례로 흡입하여 절단으로 인해 발생한 불순물을 제거합니다.

그 후, 건조를 돕기 위해 99%ethanol을 다시 흡입하여 제거합니다. 이어서 수술 당일까지 적절하게 덮인 페트리 접시에 바늘을 보관합니다. 바늘을 재사용하려면 실험 종료 후 적절한 세제와 70%ethanol로 세척하여 주입된 용액과 남아 있을 수 있는 조직 잔해를 제거하십시오.

필요한 경우, 이 바늘들을 증류수가 채워진 전용 유리병에 넣고 끓일 수 있습니다. 이 단계에서는 설정 메뉴를 선택하여 미세주입 시린지의 부피당 직경에 따라 펌프를 보정하십시오. 그리고 유속을 0.3 µL/min으로 설정하십시오.

그런 다음 10 milliliter 주사기에 멸균수를 채웁니다. 이를 사용하여 미세주입 주사기와 수동 미세주입 펌프용 주입 조립 부품 키트를 채웁니다. 그 후, 바늘을 수동 미세주입 펌프 키트에 연결합니다.

미세주입용 주사기 상단에 물 한 방울이 남도록 피스톤을 천천히 밀면서 10 milliliter 주사기를 미세주입용 주사기에서 분리하십시오. 그다음, 피스톤을 미세주입용 주사기에 삽입하십시오. 이제 미세주입용 주사기를 펌프에 연결하고 유량을 0.3 microliters per minute로 설정하십시오.

이어서 유량을 0.1 µL/min으로 변경하고 수술 절차를 시작합니다. 수술을 수행하기 위해 동물의 머리를 삭모하고 알코올 솜으로 닦아냅니다. 다음으로, 쥐를 정위 고정틀에 배치합니다.

멸균된 메스를 사용하여 두개골 위로 세로 절개를 합니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 조심스럽게 진행하십시오. 그 다음, 평평한 스패튤라를 사용하여 두피를 열고, 피부 플랩에 수술용 클립을 고정하여 열린 상태를 유지합니다.

골막을 매우 조심스럽게 분리하여 브레그마(bregma)와 바늘이 삽입될 두개골 부위를 노출시킵니다. 이어서 암(arm)을 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 장착하고, 바늘 끝이 부러지지 않도록 주의하며 바늘 끝을 브레그마 바로 위로 이동시킵니다. 브레그마의 전후 및 내외측 좌표를 기록한 후, 바늘을 원하는 좌표로 이동시킵니다.

그런 다음, 바늘의 끝이 두개골에 거의 닿을 때까지 내린 후, 정위 고정 장치의 암(arm)을 약간 들어 올려 천공 위치를 표시합니다. 뇌막과 뇌가 손상되지 않도록 주의하며 표시된 지점의 두개골을 천공합니다. 다음으로, 작은 조각의 플라스틱 파라핀 필름을 잘라 두개골 위에 놓습니다.

10 µL 파이펫을 사용하여 용액 한 방울을 만든 후 플라스틱 파라핀 필름 위에 도포합니다. 펌프를 멈추고, 펌프의 푸셔를 약간 뒤로 당긴 다음 마이크로인젝션 시린지의 피스톤을 부드럽게 당겨 모세관 내에 작은 공기 방울을 생성합니다. 바늘 끝이 용액 방울에 닿을 때까지 내립니다.

기포가 생성되지 않도록 마이크로인젝션 시린지의 피스톤을 매우 천천히 당겨 시료를 흡입합니다. 펌프 푸셔를 피스톤에 접촉시킨 후, 유량을 0.3 microliters per minute로 설정하여 펌프를 작동시킵니다. 그다음, 액적(drop)이 형성될 때까지 기다린 후 다음 단계로 진행합니다.

그 후, 유량을 0.1 µL/min으로 낮춥니다. 스테인리스강 베벨 팁 바늘을 사용하여 경막에 작은 구멍을 내고, 바늘을 천천히 내려 뇌 조직으로 진입시킵니다. 원하는 위치에 도달하면 0.1 mm 더 내려간 다음 펌프를 중단합니다.

스테레오택식 암(stereostatic arm)을 0.1 mm 올리고 펌프를 분당 0.3 µL의 속도로 다시 작동시킵니다. 그 후, 타이머와 주입을 시작하십시오. 주입하는 동안 기포의 움직임을 모니터링하십시오.

마지막으로 펌프를 멈추고 5분간 기다린 후 바늘을 천천히 회수합니다. 석영 바늘이 완전히 추출되면 펌프를 다시 작동시켜 바늘 끝에 방울이 형성되는지 확인합니다. 다음으로, 두개골 표면의 개구부를 본 왁스로 밀봉합니다.

지혈 클립을 제거하고 두피를 봉합합니다. 상처 부위 주변에 항생제 연고를 바르고 동물을 홈 케이지로 돌려보냅니다. 이것들은 선조체 수준에서 절단한 8 µm 두께의 쥐 뇌 관상 절편입니다.

이 이미지는 26-gauge 둔단 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 2 µL의 ACSF를 주입했을 때 발생한 손상을 보여줍니다. 반대로, 쿼츠 바늘로 주입한 선조체에서는 감지 가능한 손상이 나타나지 않았습니다. 다른 이미지들은 등쪽 해마 수준에서 두 바늘에 의해 유도된 손상을 보여줍니다.

하지만 석영 바늘은 감지 가능한 손상을 일으키지 않았습니다. 두 바늘 모두를 이용한 성공적인 주입은 Trypan blue의 분포를 통해 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이러한 절차 이후에는 약물 유도 효과와 같은 다양한 질문에 답하기 위해 추가 수술과 같이 필요한 모든 작업을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 독소 및 약물의 효과, 그리고 최근에는 유전자 및 세포 치료제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 개인 맞춤형 석영 바늘을 사용하여 검출 가능한 손상 없이 뇌의 깊은 영역에 미세 주입을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

레이저 절단된 시약 및/또는 병원균을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 본 절차를 수행할 때는 항상 레이저 안전 수칙 준수 및 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.