Name: 양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: 학습하세요 양방향 레트로바이러스 통합 사이트 PCR 방법을 통해 숙주 게놈에서 벡터 통합 부위를 정확히 식별하고 클론 세포 집단의 빈도를 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 치료 안전성 평가와 개별 세포 행동 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

기금은 국립 보건원 R00-HL116234, U19 AI117941 및 R56 HL126544에 의해 제공되었다. 국립 과학 재단 보조금 DMS-1516675; 한국 연구 재단 (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); KRIBB 이니셔티브 프로그램.

1. 업스트림 (왼쪽) 및 다운 스트림 (오른쪽) - 접합 시퀀스 라이브러리 생성 <ol><li> DNA 링커 준비 : <ol><li> 100 μM LINKER_A oligos (최종 20 μM) 2 μL, 100 μM LINKER_B oligos (최종 20 μM) 2 μL, 5 M NaCl (최종 : 1M) 2 μL를 첨가하여 10 μL 링커 DNA 용액을 준비하고 PCR 튜브에 nuclease-free water 4 μL. 링커 시퀀스는 표 1 을 참조하십시오. </li><li> PCR 장비에서 95 ° C에서 5 분 링커 DNA 솔루션을 품어, 실행 프로그램을 중지하고 PCR 장비 전원을 끕니다. 링커 DNA를 30 분 동안 천천히 식힌다. 링커 DNA 용액은 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> LTR 특이 적 비오틴 - 프라이머 신장 : <ol><li> UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 생체 내 에서의 게놈 DNA의 260/280 nm 값 및 DNA 농도를 결정합니다또는 시험 관내 실험. 1 ~ 2 μg의 샘플 게놈 DNA를 nuclease-free water를 사용하여 170 μL의 게놈 DNA 용액으로 희석합니다. </li><li> 10 μM HIV-1 특이적인 biotin primers ( 표 1의 L - BP와 R - BP 각각 2.5 μL : 4 개의 lentivirus 특정 primers에 대한 총 10 μL), 10X 열 안정성 20 μL를 혼합하여 200 μL PCR 반응을 준비 DNA 중합 효소 완충액, 10 mM dNTP 4 μL (최종 : 각 dNTP 200 μM), 3 μL의 2.5 U / μL 열 안정성 DNA 중합 효소 및 163 μL의 게놈 DNA. 참고 : gammaretroviral 벡터 (pMX 벡터)의 경우 위의 4 가지 HIV-1 특이 적 비오틴 프라이머 대신 2 개의 10 μM pMX 특이 적 비오틴 프라이머 (L-BP 및 R-BP : 총 10 μL)를 각각 5 μL 사용하십시오. </li><li> 용액을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 μL)로 나누고 다음 조건 하에서 단일 확장 사이클을 수행하십시오 : 94 ° C 5 분, 56 ° C 3 분, 72 ° C 5 °분, 보관시 4 ℃. </li><li> 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀과 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용출 완충액 (키트에 제공된 5 배수 희석 용리 완충액) 50 μL로 용출시킨다. 즉시 1.3.1 단계로 진행하거나 용출 된 DNA를 -20 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> RsaI 및 CviQI 분해 <ol><li> 50 μL의 DNA (1.2.4 단계), 10 μL의 완충액 A 10 μL 및 RsaI 효소 2 μL (20 U)를 첨가하여 100 μL 소화 반응을 준비하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. </li><li> 반응에 CviQI 효소 1 μL (10 U)를 첨가하고 PCR 장비에서 30 분 동안 25 ° C에서 배양하십시오. 즉시 1.4.1 단계로 진행하십시오. </li></ol></li><li> 무딘 결말 : <ol><li> 2.5 μL의 DNA 중합 효소 I 대형 (클레 노우) 단편과 10 mM dNTP 2 μL가 들어있는 4.5 μL 혼합물을 준비하십시오. 전송 181; L 혼합물을 단계 1.3.2의 DNA 샘플에 첨가 하였다. 총 부피는 102 μL입니다. vortexing으로 잘 혼합하고 25 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양한다. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오. </li></ol></li><li> 스트렙 트 아비딘 비드의 제조 : <ol><li> 간단히 스트렙 타비 딘 비드 용액을 보텍스하고 새로운 2 mL 미세 원심 분리 튜브에 50 μL를 옮긴다. 자성 스탠드를 사용하여 뜨는을 제거하고 바인딩 솔루션 200 μL로 구슬을 씻으십시오. </li><li> 100 μL의 구속 용액에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 튜브를 놓으십시오. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오. </li></ol></li><li> 스트렙 타비 딘 비드 결합 : <ol><li> 100 μL의 샘플 DNA (단계 1.4.1)를 100 μL 재 현탁 비드 용액 (단계 1.5.2)으로 옮기고 용액의 거품이 발생하지 않도록 pipetting으로 조심스럽게 혼합하십시오. 튜브를 회전 바퀴 또는 롤러에서 3 시간 동안 상온에서 인큐하십시오. </li><li> 자성 스탠드를 사용하여 구슬을 캡처하고 뜨는을 폐기하십시오. 400 μl의 세척 용액에서 두 번 구슬을 씻고 400 μl에서 1 x T4 DNA 리가 아제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)을 두 번 세척합니다. </li><li> 200 μl의 1x T4 DNA 리가 제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)에 비즈를 재현 탁하고 자성 스탠드에서 멀리 떨어 뜨려 놓으십시오. 즉시 1.7.1 단계로 진행하십시오. </li></ol></li><li> 링커 라이 게이션 : <ol><li> DNA 링커 (단계 1.1.2) 0.5 μL, 10X T4 DNA ligase 버퍼 10 μL, 5X T4 DNA 리가 아제 버퍼 20 μL (25 % 폴리에틸렌을 포함)의 혼합하여 2 ML microcentrifuge 튜브에 400 μL의 연결 반응 솔루션을 준비 글리콜), 5 μL의 T4 DNA 리가 제, 164.5 μL의 핵산 분해 효소가없는 물, 200 μL의 재현 완충액 (단계 1.6.3). 반응 튜브를 회전 바퀴에 놓고 RT (22 ° C)에서 3 시간 (또는 16 ° CO / N) 동안 배양합니다. </li&gt; <li> 비드를 세척 용액으로 두 번 씻고 자성 스탠드를 사용하여 1X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)으로 두 번 씻으십시오. </li><li> 1x 열 안정성 DNA 중합 효소 PCR 버퍼 50 μL에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 놓으십시오. 즉시 1.8.1 단계로 진행하거나 최대 4 일 동안 하루 동안 저장하십시오. </li></ol></li><li> 왼쪽과 오른쪽 접합 DNA 모두의 사전 증폭 : <ol><li> 10 μM 1L - 프라이머 10 μL, 10 μM 1R - 프라이머 10 μL, 10 μM 프라이머 Link1 (표 1) 20 μL, 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 버퍼 10 μL, 4 μL의 10 μL를 추가하여 200 μL PCR 반응을 준비합니다 단계 1.7.3에서 재현 된 구슬 (50 μL)에 10 mM dNTPs (최종 : 각 dNTP 200 μM), 8 μL (20 U) 열 안정성 DNA 중합 효소 및 88 μl의 nuclease없는 물을 넣었다. </li><li> 반응 혼합물을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 개1, L)로하고 다음 조건으로 PCR을 수행한다 : 94 ℃에서 2 분간 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분의 25 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다. </li><li> 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀링하고 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다. </li><li> UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 260 / 280nm 값을 결정합니다. DNA는 다음 단계를 준비 ​​할 때까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. 1.9.1 / 1.10.1 단계 (선택 사항)로 진행하거나 1.11.1 / 1.12.1 단계로 직접 진행하십시오. </li></ol></li><li> 왼쪽 내부 DNA amplicon 제거 (옵션) : <ol><li> 1.8.4 단계에서 100 ng의 PCR DNA 제품을 2 mL microcentrifuge tube에 옮기고 nuclease가없는 물을 사용하여 10 μL로 부피를 조정하십시오. </li><li> 좌측의 내부 D를 특이 적으로 표적으로하는 제한 효소 반응을 준비한다NA 증폭 물. 참고 : 반응 조건은 효소의 선택에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, NL4.3 기반 lentiviral 벡터에서 왼쪽 내부 DNA를 제거하면 1 μL의 pvuII , 2 μL 버퍼 B, 7 μL의 nuclease없는 물을 추가합니다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.11.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 오른쪽 내부 DNA amplicon 제거 (선택 사항) : <ol><li> 1.9.1 단계와 동일하게 진행하십시오. </li><li> 오른쪽 내부 DNA amplicon을 대상으로 제한 효소 반응을 준비하십시오. 참고 : 예를 들어, NL4.3 기반 렌티 바이러스 벡터에서 오른쪽 내부 DNA를 제거 할 때 1 μL의 sfoI , 2 μL의 완충액 B 및 7 μL의 핵산 분해 효소가없는 물을 첨가하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.12.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 왼쪽접합 관련 증폭 : <ol><li> 단계 1.8.4 (또는 선택 단계 1.9.2)에서 DNA 5 μL, 10 μM 2L - 프라이머 (최종 1 μM) 5 μL, 10 μM 프라이머 Link2의 5 μL를 혼합하여 50 μL PCR 반응을 준비 (최종 : 1 μM), 5 μL의 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액, 1 μL의 10 mM dNTP (최종 : 각 dNTP 200 μM), 2 μL (5 U)의 열 안정성 DNA 중합 효소 및 27 μL의 nuclease- 물. </li><li> 다음 조건으로 PCR을 실시하십시오 : 3 분 동안 94 ° C 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분간의 8-15 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다. 참고 : 증폭 된 DNA는 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. * 사이클 번호 최적화가 제안됩니다. </li><li> PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다. DNA 농도와 260/280 nm 값을 결정하십시오. </li></ol></li><li><strong&gt; 오른쪽 접합 특정 증폭 : <ol><li> 모든 절차는 다른 프라이머의 사용을 제외하고는 &quot;왼쪽 접합 특이 적 증폭&quot;(단계 1.11.1-1.11.3)과 동일합니다. 이 단계에서 오른쪽 접합 특이적인 프라이머 (2R 프라이머, 표 1 참조)를 사용하십시오. </li></ol></li><li> PCR amplicon 길이 변이 검정 : <ol><li> 2 % 아가 로스 겔 전기 영동 또는 모세관 전기 영동 ( 그림 2 )을 수행하여 PCR amplicon 길이 변화를 분석하십시오. 참고 : 이것은 분석 절차의 완료를 확인하고 PCR 밴드 패턴을 기반으로 한 IS 패턴을 대략적으로 평가하는 데 필수적인 단계입니다. 1.11.3 및 1.12.3 단계의 정제 PCR 증폭 물은 다양한 DNA 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 고전 체인 - 터미네이션 (Sanger) 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을위한 적절한 샘플 준비 절차를 진행하십시오. DNA는 -20 °에서 보관할 수 있습니다.;기음. </li></ol></li></ol> 2. 전산 IS 시퀀스 분석 <ol><li> 데이터 파일 준비 : <ol><li> fasta 형식 시퀀스 데이터 파일 (보충 데이터의 Test_data.fa), 벡터 및 링커 시퀀스 검색 용 모티프 (보충 데이터의 Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) 및 제한 효소 정보 용 tsv 파일의 세 가지 입력 데이터 파일 준비 (보충 데이터의 Enzyme.tsv). 참고 :이 파일은 디 멀티플렉싱, 벡터 및 링커 시퀀스 트리밍 및 내부 벡터 시퀀스 제거에 필요합니다 ( 그림 3A ). 계산 워크 플로를 구현하기위한 자세한 단계별 지침은 추가 데이터의 README.txt 파일에 나와 있습니다. </li></ol></li><li> 전산 분석 : <ol><li> demultiplexing 및 트리밍 스크립트를 실행하십시오. 참고 : 원시 시퀀스는 역 다중화 및 트리밍을 위해 처리됩니다g의 벡터, 링커 및 프라이머 시퀀스 (추가 README.txt 파일의 STEP-1 참조). </li><li> BLAST와 같은 정렬 도구 (BLAT; www.genome.ucsc.edu)를 사용하여 처리 명령을 참조 게놈에 매핑하려면 매핑 명령을 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-2 참조). </li><li> 정량적 IS 분석 스크립트를 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-3 참조). 참고 : 두 개의 출력 파일 (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt 및 Final_count.txt)이 생성됩니다. 매핑 및 시퀀스 열거 전략에 대한 자세한 내용은 보충 자료의 README.txt 파일과 이전 발행물 2 , 15 에 나와 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sites+of+Retroviral+DNA+Integration%3A+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li>
<li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+integration+and+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li>
<li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+stem+cells%3A+methodological+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li>
<li>Schröder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li>
<li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150(1990).</li>
<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+%28LAM-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li>
<li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li>
<li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li>
<li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li>
<li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+Amplification+Mediated+PCR%3B+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543(2014).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li>
<li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+ASLV%2C+HIV%2C+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).</li>
<li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284(2013).</li>
<li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

양방향 분석은 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 벡터 - 숙주 DNA 결합 서열 모두의 동시 분석을 가능하게하며 다수의 유전자 치료, 줄기 세포 및 암 연구 응용에 유용하다. GTAC- 모티프 효소 (RsaI 및 CviQI) 및 양방향 PCR 접근법을 사용하면 이전의 TCGA- 모티프 ( TaqαI ) 효소 ( 2 , 15 및 기타)와 비교할 때 인테그랄 (또는 클론 개체군)을 검출 할 가능성이 상당히 향상된다 단방향 LM-PCR 접근 5 . 양방향 분석은 특히 임상 또는 소 동물 모델 연구에서 종종 발생하는 제한된 DNA 샘플에서 IS의 분석을 향상시킵니다. 1.1-1.7 단계는 중요한 단계이므로 불필요한 지연없이 수행해야합니다. 이 단계는 대개 하루 안에 수행됩니다. 이 단계 이전에 효소를 검사하...

레트로 바이러스는 게놈 DNA를 다양한 위치의 숙주 게놈에 삽입합니다. 암과 다른 형태의 바이러스 발병 기전의 발달에 기여할 수있는이 고유 한 특성은 유전자 치료 및 기초 생물학 연구를 위해이 바이러스를 세포 공학에 매우 적합하게 만드는 아이러니 한 이점이 있습니다. 외래 DNA (바이러스)가 통합 된 숙주 게놈의 위치 인 바이러스 통합 사이트 (IS)는 통합 바이러스와 숙주 세포의 운명에 중요한 영향을 미칩니다. IS 분석은 다양한 생물학적 및 임상 연구 환경에서 레트로 바이러스 통합 사이트 선택 및 병인, 암 발달, 줄기 세포 생물학 및 발달 생물학 1 , 2 , 3 , 4 를 연구하는 데 사용되었습니다. 낮은 검출 감도, 낮은 데이터 재현성 및 빈번한 교차 오염현재 및 계획된 연구에 IS 분석법의 적용을 제한하는 핵심 요인. 많은 IS 분석 기술이 개발되었습니다. 링커 매개 (LM) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 5 , 역 PCR 6 및 선형 증폭 (Linear-Amplification-Mediated) PCR 7을 포함한 제한 효소 기반 통합 사이트 분석이 가장 널리 사용됩니다. 그러나 현장 특이적인 제한 효소의 사용은 IS 검색 중에 편향을 일으키고, 제한 효소 근처에서 통합 될 하위 집합 (숙주 게놈에 통합 된 외래 DNA) 만 회수 할 수 있습니다 4 . 최근에 벡터 IS를보다 종합적으로 평가하는 분석 기술이 도입되었습니다. 이러한 분석법은 Mu transposon-mediated PCR 8 , 비 제한적 (nr) -LAM PCR 9 , type-II 제한 효소 -mediated digestion 10 , mechanical shearing 11 , random hexamer-based PCR (Re-free PCR) 12 를 사용하여 게놈 DNA를 단편화하고 IS를 증폭합니다. 현재의 기술은 다양한 수준의 검출 감도, 게놈 범위, 표적 특이성, 높은 처리량, 분석 절차의 복잡성 및 표적 부위의 상대적 빈도를 검출하는 편향을 가지고 있습니다. 기존의 분석법의 다양한 특성과 이들이 사용될 수있는 다양한 목적을 고려할 때 최적의 분석법을 신중하게 선택해야합니다. 이 작업은 통합 표적 DNA의 IS 업스트림 및 다운 스트림을 동시에 분석함으로써 검출 속도 및 서열 정량 정확도를 크게 향상시키는 양방향 분석을위한 자세한 실험 절차 및 컴퓨터 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다 (그림 1의 분석 절차 개요도 참조). ). 이 방법은 또한레트로 바이러스 통합 과정을 특성화하는 수단 (예 : 표적 부위 복제의 정확도 및 상류 및 하류 삽입의 게놈 서열 변화). 다른 양방향 방법은 표적 DNA 11 , 13 , 14 의 양 끝을 복제하고 시퀀싱하기 위해 주로 사용되었습니다. 이 분석법은 잘 확립 된 LM-PCR 방법 및 전산 해석 매핑을 사용하고 상류 및 하류 접합을 정량화하기 위해 벡터 표시 클론의 고효율 및 재현성 정량을 위해 광범위하게 최적화되어 있습니다. TaqαI 효소의 양방향 분석은 줄기 세포 유전자 치료 전임상 연구에서 높은 처리량 클론 정량화에 유용함이 입증되었다. 이 논문은 t를 두 배로하는 더 빈번한 커터 (RsaI / CviQI - motif : GTAC)를 사용하는 수정 된 방법을 기술한다그는 TaqαI에 기반한 분석에 비해 integromes를 검출 할 가능성이 있다. 렌티 바이러스 (NL4.3 및 그 유도체) 및 감마 - 레트로 바이러스 (pMX 벡터) 벡터 IS 분석을위한 GTAC 모티프 효소를 사용하는 상세한 실험 및 데이터 분석 절차가 기술되어있다. 분석에 사용 된 올리고 뉴클레오타이드는 표 1 에 열거되어있다. 보충 문서에는 IS 서열 분석을위한 사내 프로그래밍 스크립트가 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>내열성 DNA 중합효소</td><td>애질런트</td><td>600424</td><td>PicoMaxx 중합효소</td></tr><tr><td>내열성 DNA 중합효소 완충액</td><td>애질런트</td><td>600424</td><td>PicoMaxx 중합효소 완충액</td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTP 용액 혼합물(각 10mM)</td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>VWR International</td><td>53509-304</td><td>PCR 스트립 튜브 개별 첨부된 캡</td></tr><tr><td>2 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>3453</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RsaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>CviQI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0639L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>버퍼 A</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>NEB CutSmart 버퍼</td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I 대형 (klenow) 단편&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>블런팅</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 비즈 솔루션</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>60101</td><td>Dynabeads kilobaseBINDER 키트</td></tr><tr><td>바인딩 솔루션</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>60101</td><td>Dynabeads kilobaseBINDER 키트</td></tr><tr><td>세척 솔루션</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>60101</td><td>Dynabeads kilobaseBINDER 키트</td></tr><tr><td>자기 스탠드</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>DynaMag&trade;-2 자석</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td>T4 DNA 리가제</td></tr><tr><td>10X T4 DNA 리가제 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td></tr><tr><td>5X T4 DNA 리가제 버퍼</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>46300-018</td><td>폴리에틸렌 글리콜-8000</td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td>가 있는 T4 DNA 리가제 완충액 <td>Fisher Scientific</td><td>S06497</td><td>Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>pvuII</td><td>new England Biolabs</td><td>R0151L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>sfoI</td><td>new England Biolabs</td><td>R0606L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>완충액 B</td><td>new England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>NEB 완충기 3.1</td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유수</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-05-01-14</td><td></td></tr><tr><td>모세관 전기영동</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td>QIAxcel 모세관 전기영동</td></tr><tr><td>Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375305</td><td>PCR Instrument</td></tr><tr><td>Rotating Wheel (or Roller)</td><td>Eppendorf</td><td>M10534004</td><td>Cell Culture Roller Drums</td></tr><tr><td>DNA size marker</td><td>Qiagen</td><td>929559</td><td>QX size marker (100 - 2,500 bp)</td></tr><tr><td>DNA 크기 marker</td><td>Qiagen</td><td>929554</td><td>QX size marker (50 - 1,500 bp)</td></tr><tr><td>DNA 정렬 마커</td><td>Qiagen</td><td>929524</td><td>QX DNA Alignment marker</td></tr><tr><td>genomc DNA</td><td>Not Available</td><td>in</td><td>vivo or in vitro experiments의 genomc DNA Sample genomc DNA</td></tr></tbody></table>

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 pcr 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

통합 사이트 (IS) 분석은 레트로 바이러스 통합 사이트 및 그 생물학적 중요성에 대한 연구에서 중요한 요소입니다. 최근의 레트로 바이러스 유전자 치료 연구에서, IS 분석은 차세대 시퀀싱과 함께 동일한 IS를 공유하는 줄기 세포 집단을 특성화하기위한 세포 추적 도구로 사용되었습니다. 서로 다른 샘플 내에서 그리고 다른 샘플 간에서 재 축적 된 줄기 세포 클론을 정확하게 비교하기 위해 분석의 검출 감도, 데이터 재현성 및 처리량이 가장 중요한 분석 품질 중 하나입니다. 이 작업은 양방향 IS 분석을위한 상세한 프로토콜 및 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다. 양방향 분석은 상류 및 하류 벡터 - 숙주 접합을 동시에 서열화할 수있다. 기존의 단방향 IS 시퀀싱 접근 방식과 비교할 때 양방향 접근 방식은 IS 탐지 속도와 t 양 끝에서 통합 이벤트의 특성을 크게 향상시킵니다.DNA를 목표로합니다. 여기에 설명 된 데이터 분석 파이프 라인은 IS 시퀀스를 참조 게놈에 매핑하고 시퀀싱 오류를 결정하는 여러 단계의 비교를 통해 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 열거합니다. 최적화 된 분석법을 사용하여 히말라포마 원숭이에 이식 한 후 수천 개의 조혈 줄기 세포 (HSC) 클론의 상세한 모집단 패턴을 최근에 발표하여 HSC 재조합의 정확한 시점과 HSC의 기능적 이질성을 처음으로 입증했습니다. 영장류 시스템. 다음 프로토콜은 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 정량화하는 단계별 실험 절차 및 데이터 분석 워크 플로를 설명합니다.

양방향 IS 분석은 상류 (왼쪽)와 하류 (오른쪽) 벡터 호스트 접합 ( 그림 2 ) 모두에 대해 서로 다른 크기의 PCR 증폭 물을 생성했습니다. PCR 증폭 물의 크기는 인테그람에서 상류와 하류에 가장 가까운 GTAC 모티프의 위치에 의존한다. 이 분석법은 또한 내부 DNA PCR 증폭 물을 생산 하였다 : 폴리펩티드 관 근처의 레트로 바이러스 서열 및 프라이머 결합 부위는 각각 좌 및 우 교차 PCR 동안 동시에 증폭되었다. PCR amplicon 밴드는 모세관 또는 아가로 오스 (2 %) 전기 영동으로 시각화 할 수 있습니다. 시퀀싱 후, 왼쪽 및 오른쪽 접합 서열 모두는 원시 서열 전처리 (벡터 및 링커 DNA의 역 다중화 및 트리밍 포함), 게놈 상에 IS 서열 매핑, 동일한 IS의 식별 및 카운...

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

이 절차의 전반적인 목표는 숙주 게놈 내의 레트로바이러스 벡터 통합 부위를 식별하고, 동일한 통합 부위를 공유하는 클론 세포 집단의 상대적 빈도를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 벡터가 숙주 게놈의 어느 부분에 통합되었는지, 유전적으로 조작된 세포가 이식 후 어떻게 재집락화되는지, 그리고 이들이 기능적으로 어떻게 다른지와 같은 레트로바이러스 유전자 치료의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 벡터와 숙주 DNA 접합부의 상류 및 하류 서열을 동시에 시퀀싱함으로써 레트로-통합 부위 서열을 더 높은 정확도와 민감도로 분석할 수 있다는 점입니다.이 방법은 유전자 치료 연구에서 벡터 및 유전자 조작 세포의 안전성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo) 개별 세포 행동을 조사하는 다른 기초 생물학 연구에도 적용될 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 분석할 게놈 DNA의 DNA 농도와 260 및 280 나노미터에서의 흡광도 비율을 결정하는 것입니다. 그 후, nuclease free water를 사용하여 1~2 µg의 샘플 게놈 DNA를 최종 부피 170 µL의 게놈 DNA 용액으로 희석합니다.마이크로원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 200 µL의 PCR 반응액을 준비합니다. HIV-1 특이적 비오틴 프라이머 각각 2.5 µL, 또는 렌티바이러스 특이적 프라이머 4종의 합계 10 µL, 10X 내열성 DNA 중합효소 완충액 20 µL, 10 mM dNTPs 4 µL, 내열성 DNA 중합효소 3 µL, 그리고 게놈 DNA 163 µL를 넣습니다. 용액을 4개의 PCR 튜브에 동일하게 나누어 담고, 다음 조건 하에 단일 신장 사이클을 수행합니다.94 °C에서 5분, 56 °C에서 3분, 72 °C에서 5분간 처리하고, 보관은 4 °C에서 수행합니다. 4개의 PCR 반응물을 모두 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 모읍니다. PCR 정제 키트 제조사의 절차에 따라 정제하고, 50 µL의 용출 버퍼로 용출합니다.마이크로원심분리기 튜브에 50 µL의 DNA, 10 µL의 10X buffer A, 2 µL의 RSAI 효소 및 38 µL의 nuclease-free water를 첨가하여 100 µL 규모의 제한효소 절단을 준비합니다. 써멀 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 반응액에 1 µL의 CviQI 효소를 첨가하고 25 °C에서 30분 동안 배양합니다. RSAI 및 CviQI 소화가 완료되면 즉시 blunt ending 단계를 진행합니다. 2.5 µL의 DNA polymerase I, Large Fragment와 2 µL의 10 mM dNTP를 포함하는 4.5 µL 혼합액을 준비합니다.혼합물 1 µL를 DNA 샘플에 옮깁니다. 총 부피는 102 µL가 됩니다. 볼텍싱하여 잘 섞어준 후 25 °C에서 1시간 동안 배양합니다.배양이 완료되면 즉시 스트렙타비딘 비드 결합을 진행하십시오. 비드 용액을 짧게 볼텍싱한 후 50 µL를 새로운 2 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 스트렙타비딘 비드를 준비합니다. 자석 스탠드를 사용하여 상층액을 제거하고 200 µL의 결합 용액으로 비드를 세척하십시오.비드(bead)를 100 µL의 결합 용액에 재현탁하고 튜브를 마그네틱 스탠드에서 멀리 둡니다. 시료 DNA 100 µL를 재현탁된 비드 용액 100 µL에 옮기고, 용액에 거품이 생기지 않도록 파이펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 튜브를 회전 휠에 올리고 실온에서 3시간 동안 배양합니다.자석 스탠드를 사용하여 비드를 포집하고 상층액을 제거합니다. 세척액 400 µL로 비드를 2회 세척하고, 1X T4 DNA ligase buffer 400 µL로 2회 더 세척합니다. 비드를 1X T4 DNA ligase buffer 200 µL에 재현탁한 후 자석 스탠드에서 떨어뜨려 놓습니다.링커 결합은 streptavidin 비드 결합 직후에 수행해야 합니다. 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 400 µL의 결합 반응 용액을 준비하십시오: DNA 링커 0.5 µL, 10X T4 DNA ligase 버퍼 10 µL, 5X T4 DNA ligase 버퍼 20 µL, T4 DNA ligase 5 µL, nuclease free water 164.5 µL, 그리고 재현탁된 비드 200 µL.반응 튜브를 실온의 회전 휠에 3시간 동안 둡니다. 세척액으로 비드를 2회 세척하고, 1X thermostable DNA polymerase 버퍼로 2회 세척합니다. 비드를 50 µL의 1X thermostable DNA polymerase PCR 버퍼에 다시 현탁하고, 마그네틱 스탠드에서 멀리 둡니다.본 절차를 시작하기 위해, 재현탁된 비드에 다음과 같은 성분들을 첨가하여 200 µL PCR 반응액을 준비합니다: 1L-프라이머 10 µL, 1R-프라이머 10 µL, 프라이머 Link1 20 µL, 10X 내열성 DNA 중합효소 완충액 10 µL, 10 mM dNTPs 4 µL, 내열성 DNA 중합효소 8 µL, 그리고 nuclease-free water 88 µL. 반응 혼합물을 4개의 PCR 튜브에 분주하고 다음 조건으로 PCR을 수행합니다.94 °C에서 2분간 처리하고, 94 °C에서 20초, 56 °C에서 25초, 72 °C에서 2분간 처리하는 과정을 25회 반복한 후, 72 °C에서 5분간 최종 신장 단계를 거칩니다. 4개의 PCR 반응물을 모두 2 ml 마이크로원심분리 튜브에 모읍니다. PCR 정제 키트의 절차에 따라 정제한 후, 50 µL의 용출 버퍼로 용출합니다.UV-Vis 분광광도계를 사용하여 DNA 농도와 260 및 280 나노미터에서의 흡광도 비율을 측정합니다. 추출한 DNA는 다음 단계를 진행할 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 왼쪽 접합부와 오른쪽 접합부 특이적 증폭 과정은 PCR에 사용되는 프라이머를 제외하고는 동일하므로, 왼쪽 접합부 증폭 과정만으로 시연하겠습니다.PCR 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 50 µL PCR 반응액을 준비합니다. DNA 5 µL, 10 µM 2L-primer 5 µL, 10 µM primer Link2 5 µL, 10X thermostable DNA polymerase buffer 5 µL, 10 mM dNTPs 1 µL, thermostable DNA polymerase 2 µL, 그리고 nuclease-free water 27 µL를 넣습니다. 다음 조건으로 PCR을 수행합니다.94°C에서 3분 동안 가열하고, 94°C에서 20초, 56°C에서 25초, 72°C에서 2분 동안의 과정을 8~15회 반복한 후, 마지막으로 72°C에서 5분 동안 신장시킵니다. PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하고 50 µL의 용출 버퍼로 용출합니다. DNA 농도와 260 및 280 nm에서의 흡광도 비율을 측정합니다.좌우 접합부 서열 라이브러리를 생성하는 마지막 단계는 모세관 전기영동을 수행하여 PCR 증폭산물의 길이 변이를 분석하는 것입니다. 이 대표 결과는 상위 및 하위 벡터-호스트 접합부 모두에서 렌티바이러스 벡터 통합 부위의 PCR 증폭산물 길이가 다양하게 나타남을 보여줍니다. DNA 크기 마커는 M 레인에 표시되어 있습니다.PCR 증폭 산물의 서열 분석 후, 자체 개발한 프로그래밍 스크립트를 사용하여 통합 부위 서열의 컴퓨터 분석을 수행합니다. 양방향 통합 부위 분석을 통해 벡터-숙주 접합부의 상류 및 하류 모두에서 다양한 크기의 PCR 증폭 산물이 생성되며, 이는 모세관 전기영동으로 시각화됩니다. 인실리코(in silico)로 생성된 무작위 통합 이벤트 내의 인간화 마우스 재정착 세포 내 렌티바이러스 벡터의 유전자, Alu 및 L1 반복 서열의 통합 비율을 비교한 결과, 통합 부위가 유전자에 유의미하게 농축되어 있음이 밝혀졌습니다.벡터 인테그롬(integrome)의 상대적 검출 빈도는 500bp 미만의 PCR 증폭 산물을 생성하는 삽입 부위 접합부의 서열 수만을 사용하여 계산되었습니다. 약 77%의 벡터가 양방향 접근법을 통해 정량적으로 분석될 수 있었습니다. 클론 정량화 전략에서 우리는 각각의 개별 클론이 동일한 벡터 인테그롬을 공유한다고 가정합니다.왼쪽과 오른쪽 접합부의 상대적 빈도를 결합하여 클론 집단의 상대적 양, 즉 QVI를 나타냅니다. 이 색상 구성표는 인간화 마우스 재정착 세포 내 44개 QVI 클론의 상대적 빈도를 보여줍니다. in silico 10,000회 무작위 통합 분석 결과, GTAC 모티프 효소를 사용할 때는 클론 빈도가 1.25배 과대평가될 것으로 예상되며, TCGA 모티프 효소를 사용할 때는 2.56배 과대평가될 것으로 예상됩니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행할 경우 과정을 나누어 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 PCR 단계는 매우 민감하므로 오염을 방지하기 위해 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 기술은 치료용 레트로바이러스 벡터의 안전성을 검토하고, 레서스 원숭이의 이식 후 조혈모세포 클론의 장기 재정착 패턴을 탐구하는 길을 열어주었습니다.

bidirectional-retroviral-integration-site-pcr-methodology

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 보고서는 급성 감염 세포의 세포질 추출물에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 사전 통합 복합체(PIC) 관련 통합 활성을 측정하기 위한 체외 분석에 대해 설명합니다. PIC 관련 HIV-1 DNA를 이종 표적 DNA에 통합하는 것은 중첩된 실시간 중합효소 연쇄 반응 전략을 사용하여 정량화됩니다.

측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

탠덤 접합 이벤트는 뉴클레오티드가 12개 미만으로 떨어져 있는 부위에서 발생합니다. 이러한 스플라이스 변형체의 비율을 정량화하는 것은 절대 정량적 PCR 접근법을 사용하여 가능합니다. 이 원고는 두 개의 스플라이싱 이벤트로 인해 Serine-701 포함/배제 및 α/β C-말단이 발생하는 STAT3 유전자의 스플라이스 변이체를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

학습하세요 양방향 레트로바이러스 통합 사이트 PCR 방법을 통해 숙주 게놈에서 벡터 통합 부위를 정확히 식별하고 클론 세포 집단의 빈도를 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 치료 안전성 평가와 개별 세포 행동 연구에 활용됩니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

더 많은 동영상 탐색