양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

이 절차의 전반적인 목표는 숙주 게놈에서 레트로바이러스 벡터 통합 부위를 식별하고 각각 동일한 통합 부위를 공유하는 클론 세포 집단의 상대적 빈도를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 숙주 게놈 벡터의 어느 부분이 통합되었는지, 이식 후 유전자 조작 세포가 어떻게 다시 증식하는지, 기능적으로 어떻게 다른지와 같은 레트로바이러스 유전자 치료의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 업스트림 및 다운스트림 벡터 숙주 DNA 접합을 동시에 염기서열분석하여 역통합 부위 염기서열분석을 더 높은 정확도와 민감도로 분석할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 유전자 치료 연구에서 벡터 및 유전자 공학 세포의 안전성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 생체 내에서 개별 세포의 행동을 조사하기 위한 다른 기초 생물학 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 분석할 게놈 DNA의 260 및 280 나노미터에서 DNA 농도와 흡광도 비율을 결정하는 것입니다. 그 후, 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 1-2마이크로그램의 샘플 게놈 DNA를 170마이크로리터의 게놈 DNA 용액의 최종 부피로 희석합니다.

마이크로 원심분리 튜브에서 다음을 혼합하여 200 마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다. HIV-1 특이적 비오틴 프라이머 각각 2.5 마이크로리터, 또는 렌티바이러스 특이적 프라이머 4개, 10X 내열성 DNA 중합효소 완충액 20 마이크로리터, 10 밀리몰 dNTP 4 마이크로리터, 열안정성 DNA 중합효소 3 마이크로리터 및 게놈 DNA DNA 163 마이크로리터. 용액을 4개의 PCR 튜브로 균등하게 나누고 다음 조건에서 단일 확장 주기를 수행합니다.

94°C에서 5분, 56°C에서 3분, 72°C에서 5분, 4°C에서 보관합니다. 4가지 PCR 반응을 모두 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다. PCR 정제 키트에 대한 제조업체의 절차를 따르고 50마이크로리터의 용리 완충액으로 용리합니다.

마이크로 원심분리기 튜브에 다음을 추가하여 100마이크로리터 분해를 준비합니다. DNA 50마이크로리터, 10X 버퍼 A 10마이크로리터, RSAI 효소 2마이크로리터 및 뉴클레아제가 없는 물 38마이크로리터. 섭씨 37도에서 열 순환기에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 1마이크로리터의 CviQI 효소를 반응에 첨가하고 섭씨 25도에서 30분 동안 배양합니다. RSAI 및 CviQI 분해가 완료되면 즉시 무딘 엔딩으로 진행합니다. 2.5마이크로리터의 DNA 중합효소 I, 대형 단편과 2마이크로리터의 10밀리몰 dNTP를 포함하는 4.5마이크로리터 혼합물을 준비합니다.

혼합물 1마이크로리터를 DNA 샘플로 옮깁니다. 총 부피는 102 마이크로 리터입니다. 볼텍싱으로 잘 섞어 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 즉시 streptavidin bead binding을 진행합니다. 비드 용액을 잠시 와류로 가열하고 50마이크로리터를 새로운 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 스트렙타비딘 비드를 준비합니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 상층액을 제거하고 200마이크로리터의 결합 용액으로 콩을 씻습니다.

100마이크로리터의 결합 용액에 비드를 다시 현탁시키고 튜브를 마그네틱 스탠드에서 멀리 놓습니다. 100 마이크로리터의 샘플 DNA를 100 마이크로리터의 재현탁 비드 용액으로 옮기고 용액의 거품을 방지하기 위해 피펫팅으로 조심스럽게 혼합합니다. 튜브를 실온에서 회전하는 바퀴에서 3시간 동안 배양합니다.

마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 잡고 상층액을 버립니다. 400마이크로리터의 세척 용액에서 비드를 두 번, 400마이크로리터의 1X T4 DNA 리가제 완충액에서 두 번 세척합니다. 200마이크로리터의 1X T4 DNA 리가제 완충액에 비드를 재현탁하고 마그네틱 스탠드에서 멀리 떨어뜨립니다.

링커 결찰은 스트렙타비딘 비드 결합 직후에 수행해야 합니다. 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 다음을 혼합하여 400마이크로리터 결찰 반응 용액을 준비합니다. DNA 링커 0.5 마이크로리터, 10X T4 DNA 리가제 완충액 10 마이크로리터, 5X T4 DNA 리가제 완충액 20 마이크로리터, T4 DNA 리가제 5 마이크로리터, 뉴클레아제 자유 정제수 164.5 마이크로리터, 및 재현탁 비드 200 마이크로리터.

반응 튜브를 실온에서 3시간 동안 회전하는 휠에 놓습니다. 세척액으로 비드를 두 번 세척하고 1X 내열성 DNA 중합효소 완충액으로 두 번 세척합니다. 50마이크로리터의 1X 내열성 DNA 중합효소 PCR 완충액에 비드를 재현탁시키고 마그네틱 스탠드에서 멀리 떨어뜨립니다.

이 절차를 시작하려면 재현탁된 비드에 다음을 추가하여 200마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다. 1개의 1L-프라이머 10마이크로리터, 1R-프라이머 10마이크로리터, 프라이머 Link1 20마이크로리터, 10X 내열성 DNA 중합효소 완충액 10마이크로리터, 10밀리몰 dNTP 4마이크로리터, 열안정성 DNA 중합효소 8마이크로리터 및 뉴클레아제가 없는 물 88마이크로리터. 반응 혼합물을 4개의 PCR 튜브에 분주하고 다음 조건으로 PCR을 수행합니다.

섭씨 94도에서 2분, 섭씨 94도에서 20초, 섭씨 56도에서 25초, 섭씨 72도에서 2분, 최종 연장에서 72분, 5분 동안 섭씨 72도에서 최종 연장. 4가지 PCR 반응을 모두 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다. PCR 정제 키트의 절차를 따르고 50마이크로리터의 용리 완충액으로 용리합니다.

UV 가시광선 분광 광도계를 사용하여 260 및 280 나노미터에서 DNA 농도와 흡광도 비율을 측정합니다. DNA는 이제 다음 단계를 위해 준비될 때까지 섭씨 영하 20도에서 저장될 수 있다. 좌접합 및 우측 접합 특정 증폭에 대한 절차는 PCR에 사용된 프라이머를 제외하고는 동일하기 때문에 좌측 접합 증폭만 시연됩니다.

PCR 튜브에 다음을 혼합하여 50 마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다. DNA 5마이크로리터, 10마이크로몰 2L 프라이머 5마이크로리터, 10마이크로몰 프라이머 Link2 5마이크로리터, 10X 내열성 DNA 중합효소 완충액 5마이크로리터, 10밀리몰 dNTP 1마이크로리터, 내열성 DNA 중합효소 2마이크로리터 및 뉴클레아제가 없는 물 27마이크로리터. 다음 조건으로 PCR을 수행하십시오.

섭씨 94도에서 3분, 섭씨 94도에서 20초, 섭씨 56도에서 25초, 섭씨 72도에서 2분, 마지막으로 섭씨 72도에서 5분 동안 연장합니다. PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하고 50마이크로리터의 용리 완충액으로 용출합니다. 260 및 280 나노미터에서 DNA 농도와 흡광도 비율을 측정합니다.

좌우 접합 염기서열 라이브러리를 생성하는 마지막 단계는 모세관 전기영동을 수행하여 PCR 앰플리콘 길이 변화를 분석하는 것입니다. 이 대표적인 결과는 업스트림 및 다운스트림 벡터 숙주 접합 모두에 대한 렌티바이러스 벡터 통합 부위에서 다양한 길이의 PCR Amplicon을 보여줍니다. DNA 크기 마커는 M 레인에 있습니다.

PCR Amplicons를 염기서열분석한 후 사내 프로그래밍 스크립트를 사용하여 컴퓨터 통합 부위 염기서열 분석을 수행합니다. 양방향 통합 부위 분석은 모세관 전기영동으로 시각화된 업스트림 및 다운스트림 벡터 숙주 접합 모두에 대해 다양한 크기의 PCR Amplicon을 생성합니다. 인실리코(silico) 내에서 재파송하는 세포에서 렌티바이러스 벡터의 L1 반복 유전자 Alu 및 L1 반복의 통합 비율을 비교한 결과, 무작위 통합 이벤트가 발생했으며, 유전자 통합 부위가 상당히 풍부하다는 사실이 밝혀졌습니다.

벡터 인테그롬의 상대적 검출 빈도는 500bp PCR 앰플리콘보다 작게 생성되는 통합 부위 접합의 염기서열 수만 사용하여 계산되었습니다. 벡터의 약 77%는 양방향 접근 방식으로 정량적으로 분석할 수 있습니다. 클론 정량화 전략에서는 각 개별 클론이 동일한 벡터 인테그롬을 공유한다고 가정합니다.

좌측 및 우측 접합부의 상대 빈도는 클론 집단 또는 QVI의 상대적 수량을 나타내기 위해 결합됩니다. 이 색 구성표는 인간화 마우스 보충 세포에서 44개의 QVI 클론의 상대 빈도를 보여줍니다. 인실리코 10, 000 무작위 통합 분석에 따르면 GTAC 모티프 효소를 사용할 경우 클론 빈도의 1.25배 과대 추정이 예상되며, TCGA 모티프 효소를 사용할 경우 2.56 배 과대 추정이 예상됩니다.

일단 숙달되면 이 기술을 여러 부분으로 나누어 제대로 수행한다면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 PCR 단계는 매우 민감하며 오염을 방지하기 위해 예방 조치를 취해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 치료용 레트로바이러스 벡터의 안전성을 조사하고 붉은털 원숭이에 이식한 후 조혈모세포 클론의 장기 재증식 패턴을 탐구하는 길을 열었습니다.