자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

이러한 분리 및 분화 프로토콜의 전반적인 목표는 혈관 주위 지방 조직에서 지방 세포 전구 세포를 얻고 성숙한 지방 세포로 분화를 유도하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 혈관 주위 지방 조직에서 특이적이고 정의된 지방 세포 전구 세포 집단을 분석할 수 있으며, 형태, 생존력 및 증식 및 분화 가능성에 미치는 영향을 최소화할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 활성화 세포 분류에 비해 지방 조직 1g당 항원 제시 세포의 격리를 증가시킬 수 있다는 것입니다.

발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 흉골을 따라 쥐의 회음부까지 수직 정중선을 절개하여 복강에 접근합니다. 상장간막 동맥(superior interenteric artery), 작은 장간막 저항 혈관(small interenteric resistance vessels), 흉부 대동맥(thoracic aorta)을 노출시키고 장간막과 대동맥에 대한 모든 연결을 끊습니다. 생식선 지방 조직을 수집하고 분리된 지방 패드를 10밀리몰 힙이 보충된 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액 또는 KRBB 용액의 새 용기로 옮깁니다.

KRBB 용액이 들어 있는 페트리 접시에 용기를 옮기고 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 작은 장간막 저항 혈관과 대동맥에서 혈관 주위 지방 조직을 제거합니다. 생물 안전 후드에서 약 50mg의 조직을 1.7ml의 콜라겐분해효소 I형 용액이 들어 있는 1ml 튜브로 옮기고 조직을 1-3mm 조각으로 다집니다.

콜라겐분해효소가 결합 조직에 완전히 침투할 수 있도록 지방 조직을 적절하게 다지는 것이 중요합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 조각을 배양합니다. 그런 다음 개별 100 및 40 미크론 셀 스트레이너를 통해 분해된 물질을 50ml 튜브로 순차적으로 여과합니다.

생성된 여과액을 원심분리로 수집하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 새로운 1.7ml 마이크로퓨지 튜브로 옮겨 빛으로부터 보호된 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 다른 원심분리로 기질 혈관 분획 세포를 수집하고 계수를 위해 기질 혈관 분획 기저 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

자기활성화세포분류(magnetic-activated cell sorting)에 의해 지방세포 전구세포를 분리하기 위해, 원심분리로 세포를 채취하고, 펠릿을 자기활성화세포 분류 차단 완충액에 1 곱하기 10 - 밀리리터당 6번째 세포농도로 재현탁하여 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 격리의 모든 단계는 얼음 위가 아닌 섭씨 4도에서 수행되는 것이 중요합니다. 다음으로, 5마이크로리터의 FITC-conjugated mouse anti-CD34로 세포를 30분 동안 배양합니다.

원심분리로 세포를 수집합니다. 그런 다음 어둠 속에서 5분 동안 96마이크로리터의 자기 활성화 세포 분류 버퍼에 4마이크로리터의 anti-FITC MicroBeads를 넣어 세포를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안 컬럼 아래에 5ml 폐기물 튜브가 있는 자기 분리기에 다중 분류 컬럼을 배치합니다.

500마이크로리터의 자기 활성화 세포 분류 버퍼로 컬럼을 헹구고 폐수와 폐기물 튜브를 폐기합니다. 그런 다음 컬럼 아래에 새 튜브를 배치하고 컬럼 상단에 세포를 로드하여 라벨링되지 않은 CD34 음성 세포를 새 수집 튜브에 수집합니다. 모든 세포가 컬럼 상단을 통과하면 탈기된 자기 활성화 세포 분류 버퍼 500마이크로리터로 컬럼을 3회 세척하고 수집 튜브에 용리액을 계속 모읍니다.

마지막 세척 후 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 컬럼 플런저를 사용하여 1ml의 자기 활성화 세포 분류 버퍼를 컬럼을 통해 튜브로 플러시하여 CD34 양성 세포를 수집합니다. 원심분리를 통해 지방세포 전구세포를 수집합니다. 그런 다음 CD34 양성 분획을 10마이크로리터의 토끼 항혈소판에서 유래 성장 인자 수용체 알파로 30분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 세포를 다시 원심분리하고, 방금 시연된 바와 같이 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 양성 세포의 자기 비드 분리를 위해 96마이크로리터의 자기 활성화 세포 분류 버퍼에 4마이크로리터의 항토끼 IgG MicroBeads에서 펠릿을 배양합니다. CD34 양성 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 양성 지방 세포 전구 세포를 배양하려면 기저 배지의 개별 6-well 조직 배양 플레이트에 세포를 파종하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 3번의 연속 계대 후, 표준 증식 분석 프로토콜에 따라 24웰 분석 플레이트에서 웰당 2개의 세포에 1 x 10에서 검은색 96웰 조직 배양 플레이트에 세포를 파종하고, 24웰 분석 플레이트에서 웰당 5배 10에서 4번째 세포로 8, 24, 48 및 96시간에 증식을 평가합니다.

지방 형성을 유도하기 위해 지방 세포 전구 세포 배양이 포화에 도달하면 48 시간 동안 지방세포 전구 기저 배지를 세포에 공급한 다음 다른 48 시간 동안 뼈 형태 생성 단백질 4로 배양물을 처리합니다. 3일째에는 14일 동안 IBMX와 examethasone이 없는 지방 세포 전구 세포 유도 배지로 배지를 교체합니다. 그런 다음 배양물에서의 지방 형성 정도는 표준 지방 형성 분석 프로토콜에 따라 48웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 10배에서 4번째 세포로 평가할 수 있습니다.

두 방법 모두 유사한 세포 집단 분포와 생존력을 보여주지만, 자기 활성화 세포 분류 분리는 형광 활성화 세포 분류에 비해 배양을 위한 세포 수를 더 많이 생성합니다. 본 대표적인 실험에서는 수컷 쥐의 흉부 대동맥, 작은 장간막 저항 혈관 및 생식선 지방 조직에서 분리된 자기 활성화 세포에 의하여 분류된 기질 혈관 분획 및 지방 세포 전구 세포의 in vitro 증식을 정량적 DNA assay를 이용하여 도금 후 8, 24, 48, 96시간에 평가하였다. 흉부 대동맥의 지방세포 전구세포(adipocyte progenitor cell)를 제외하고는 어떤 시점에서도 기질 혈관 분획 확장률의 부위 차이가 관찰되지 않았는데, 이는 동일한 부위의 기질 혈관 세포에 비해 96시간까지 증식이 적다는 것을 보여주었습니다.

48시간 동안 bone morphogenic protein 4를 가진 합류 지방 세포 전구 세포를 자극하면 지방 세포 분화가 유도되며, 이는 형광 지질 흡수 분석 및 Oil Red O 염색에 의해 평가된 바와 같이 방울에 더 큰 지질 축적에 의해 입증됩니다. 이 기술을 마스터하면 올바르게 수행하면 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 격리 단계에서 섭씨 4도의 온도를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 지방 세포 전구 세포를 분리하고 분화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.