표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링 ²⁺ 센서 캐쳐 ⁺

이 실험의 전반적인 목표는 CatchER plus를 사용한 HEK293 및 C2C12 세포의 배양 및 transfection을 위한 프로토콜과 NC2KD 측정에서 ERSR 수용체 매개 칼슘 과도 현상을 모니터링하기 위한 응용 프로그램을 표시하는 것입니다. 이 방법은 칼슘 신호 전달 및 이미징의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 기초 칼슘 농도 및 확정 세포의 ERSR의 급격한 변화, 이러한 측정에 바이오센서 CatchER plus를 적용하는 방법 등을 확인할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포의 형광 반응을 빠른 동역학으로 실시간으로 기록할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 ERSR 칼슘 관련 질병의 진단으로 확장되는데, 그 이유는 CatchER plus가 기능 장애 칼슘 신호 전달 요소로 인해 발생하는 이러한 소기관에서 비정상적인 칼슘 과도 현상을 모니터링할 수 있기 때문입니다. 세포 배양 및 현미경 검사에는 여러 가지 오류가 발생하기 때문에 세포 형질 주입 및 형광 이미징 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 박사후 연구원인 Florence Reddish입니다.

이 실험을 시작하려면 HEK293 세포를 6cm 접시에 있는 멸균된 유리 현미경 슬라이드에 파종하고 transfection 당일 약 70%가 합류할 때까지 하루에서 이틀 동안 배양합니다. 다음으로, 접시에서 DMEM을 비우고 환원된 혈청 배지 3ml를 추가합니다. 그런 다음 DNA transfection 시약 혼합물을 접시에 넣고 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 배양합니다.

HEK293 세포의 transfection은 일반적으로 다른 세포주보다 쉽지만, 세포는 가혹한 조건에 대한 탄력성이 떨어집니다. 따라서 세포사멸을 방지하기 위해 4-6시간 동안만 transfection 시약에 노출시키는 것이 중요합니다. 4-6시간 후, 5-6ml의 HBSS로 세포를 세척한다.

접시에서 HBSS를 버리고 3ml의 새 DMEM으로 교체하십시오. 그 후, GECI가 발현될 수 있도록 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. C2C12 근아세포 세포의 경우, 접시 바닥을 덮기 위해 1-2밀리리터의 트립신을 첨가하여 세포를 트립신화합니다.

다음으로, 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 2-6분 동안 넣어 트립신이 접시 바닥에서 세포를 느슨하게 할 수 있도록 합니다. 배양이 완료되면 트립신을 제거하고 8ml의 DMEM에서 세포를 흡인합니다. DMEM으로 세포를 철저히 피펫팅하여 세포를 고르게 분산시키고 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 6cm 배양 접시의 멸균 커버슬립에 파종한 다음 3ml의 DMEM을 첨가하여 60%의 최종 합류점을 달성한 후 같은 날 세포를 transfection합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 5-6ml의 HBSS로 세포를 세척합니다.

접시에서 HBSS를 버리고 3ml의 새 DMEM으로 교체하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양하여 GECI가 발현될 수 있도록 합니다. 이 절차에서 현미경과 광원을 켠 다음 간단한 PCI 프로그램을 엽니다.

면봉을 사용하여 로우 프로파일 오픈 다이아몬드 수조 이미징 챔버의 바닥을 얇은 밀봉제 층으로 덮습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 형질주입된 세포가 들어있는 슬라이드를 꺼내 10밀리몰의 포도당과 1.8밀리몰의 칼슘이 함유된 약 1밀리리터의 링거 버퍼로 3회 부드럽게 헹굽니다. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 접시에 약 1ml의 Ringer 완충액을 남겨두고 집게를 사용하여 접시에서 슬라이드를 꺼냅니다.

슬라이드 가장자리를 실험실 조직에 접촉하여 여분의 용액을 흡수합니다. 그런 다음 셀이 그리스를 향하도록 챔버 측면에 놓습니다. 그런 다음 드라이버를 사용하여 챔버를 무대 마운트에 고정합니다.

약 1ml의 Ringer 버퍼를 챔버에 추가하여 세포가 건조되는 것을 방지하고 스테이지에 장착하고 현미경 설정을 완료합니다. 현미경 대물렌즈를 40배 오일 이멀젼 대물렌즈로 전환합니다. 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 추가합니다.

그런 다음 마운트를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 진공 팁을 챔버에 놓아 용액의 수평을 유지하고 과도하게 채워지는 것을 방지합니다. 다음으로, 대물렌즈의 오일이 슬라이드 바닥에 닿을 때까지 코스 조정을 사용하여 대물렌즈를 올립니다.

명시야 모드를 사용하여 게인을 175로 조정하고 노출 시간을 0.03초로 조정하여 세포에 초점을 맞춥니다. 세포에 초점이 맞춰지면 488나노미터 여기를 사용하여 형광 모드로 전환하고 노출 시간을 0.07초로 변경합니다. 이미징을 위한 적절한 형광으로 건강한 세포가 충분히 있는 시야를 찾습니다.

그런 다음 형광 및 명시야 모드로 사진을 촬영합니다. 세포의 관심 영역에 원을 그리거나 전체 세포에 원을 그리며 선택한 영역의 강도를 기록합니다. 이제 프레임 속도를 5초마다 1로 설정하여 강도 측정을 시작합니다.

기준선 강도가 20-30프레임 동안 안정화되도록 합니다. 다음으로, 200마이크로몰의 최종 농도를 만들기 위해 450마이크로리터의 최종 챔버 부피를 기준으로 20밀리몰 스톡에서 필요한 4-CMC의 양을 계산합니다. 그런 다음 60마이크로리터의 Ringer 버퍼를 챔버에서 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

이 용액으로 계산된 양의 4-CMC를 희석하고 챔버에 다시 추가하여 이미징되는 세포에서 의도한 반응을 불러일으킵니다. 약물이 수용체에 결합하고 후속 신호가 감소할 때까지 시간을 허용합니다. 그런 다음 3-6ml의 Ringer's buffer로 세포를 세척하는 동시에 이벤트 마커를 추가합니다.

각 분석에 대해 형질 주입된 세포의 새 슬라이드를 사용하여 100마이크로몰 ATP 및 15마이크로몰 CPA에 대한 절차를 반복합니다. 측정이 완료되면 간단한 PCI 프로그램의 강도 측정 창에서 데이터 수집을 종료합니다. 그런 다음 세포의 형광 및 명시야 사진을 찍습니다.

그런 다음 실험에 대한 데이터 파일을 엽니다. 필요한 경우 관심 있는 셀 또는 영역을 다시 원을 그리며 강도 값을 다시 계산합니다. NC2KD 및 C2C12 근아세포 세포를 측정하려면 transfection 절차를 반복하고 챔버에 1ml의 칼슘이 없는 Ringer's buffer를 추가합니다.

0.002 - 0.005%의 사포닌과 세포 내 완충액으로 세포를 15 - 30초 동안 투과시켜 세포질에 있을 수 있는 CatchER plus의 세포를 비웁니다. 그런 다음 EGTA와 10마이크로몰 이오노마이신이 함유된 3-6ml의 KCL 완충액으로 세포를 세척합니다. 고원에 도달할 때까지 강도를 낮추십시오.

그런 다음 10마이크로몰 이오노마이신이 함유된 3-6ml의 KCL 완충액으로 세포를 헹구고 강도를 안정화합니다. 그런 다음 다른 칼슘 용액을 추가하여 강도가 각 첨가 사이에 안정기에 도달하도록 합니다. 기초 칼슘 농도 정량화를 위해 센서를 보정하려면 EGTA 및 100 밀리몰 칼슘 버퍼를 사용하여 최소 및 최대 형광 강도를 얻으십시오.

여기에 표시된 것은 CatchER plus로 transfection된 투과화된 C2C12 근아세포 세포에서 수집된 정규화된 강도에 대한 대표적인 형질입니다. 세포는 15 내지 30초 동안 세포내 완충액에서 0.005%사포닌으로 투과화되었다. EGTA 및 칼슘 용액은 KCL 완충액에서 제조되었으며 N은 이미징된 세포의 수를 나타냅니다.

이러한 삽입 형광 이미지는 처리 전후의 세포를 대표합니다. 0.2, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 및 100 밀리몰 칼슘을 10 마이크로몰 이오노마이신의 존재 하에 투과화된 C2C12 근아세포 세포에 첨가하여 3.1 플러스 또는 마이너스 1.4 밀리몰의 KD를 얻었습니다. 이 그림은 1밀리몰 EGTA 및 100밀리몰 칼슘과 각각 10마이크로몰 이오노마이신을 첨가한 후 최소 및 최대값에서 CatchER과 형질주입된 세포의 대표적인 강도 측정을 보여줍니다.

이 기법을 완전히 익히면 이미징의 경우 30-60분 이내에 완료할 수 있으며, 형질주입을 포함하는 경우 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 멸균 환경에서 세포를 취급하고, 실험 전에 시약을 준비하고, 챔버에 균일한 그리스 층을 바르고, 시작하기 전에 진공 청소기를 부착하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 CatchER plus의 발현 수준과 같은 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 칼슘 신호 전달 및 이미징 분야의 연구자들이 포유류 세포에서 ERSR 칼슘 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CatchER plus를 사용하여 세포를 transfection하고 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.