신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여

이 절차의 전반적인 목표는 소뇌 과립 뉴런의 건강한 순수 집단을 생성하고, 이를 유전적으로 조작하고, 1차 체외 배양에서 다양한 뉴런 손상 메커니즘을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 신경 손상 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 급성 뇌 손상 및 신경 생성 질환에 따른 신경 손상의 기본 분자 메커니즘을 조사합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 배양 시스템을 사용하여 흥분 독성, 산화 스트레스, DNA 손상 및 발달 사건과 같은 다양한 세포 사멸 메커니즘을 모델링할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신경 세포 손상에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 쥐의 소뇌 뉴런과 함께 사용하여 성장 인자 및 부작용에 대한 반응으로 신경 활동 및 형태 형성을 연구할 수도 있습니다. 생후 6-7일 된 쥐의 뇌를 적출하려면 집게를 사용하여 머리를 잡고 미세 해부 가위로 머리를 향해 피부를 앞쪽으로 자릅니다.

피부를 뒤로 밀어 두개골을 드러냅니다. 그런 다음 가위 끝으로 두개골을 관통하고 전방과 측방으로 자릅니다. 소뇌가 손상되지 않도록 주의하고 수막의 식별 및 제거를 용이하게 한 다음 집게를 사용하여 뇌를 노출시키는 두개골을 벗겨냅니다.

한 쌍의 집게 또는 주걱으로 뇌를 부드럽게 풀어 시원한 해부 용액을 만듭니다. 소뇌를 분리하려면 황산마그네슘이 보충된 해부 용액에 뇌를 넣고 용액과 뇌를 얼음 위에 두십시오. 해부 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 수막을 제거한 다음 황산 마그네슘이 보충 된 해부 용액으로 뇌에서 소뇌를 해부합니다.

이것은 남아 있는 수막을 벗겨내는 데 도움이 되며 소뇌 주름을 청소하기 위해 층 사이로 들어갈 수 있습니다. 수막의 존재는 신경 세포 배양으로 인해 건강하지 않은 세포와 궁극적인 세포 사멸을 초래합니다. 따라서 배양을 진행하기 전에 수막을 완전히 제거하는 것이 중요합니다.

그런 다음 소뇌를 복부 쪽으로 돌리고 맥락막신경총을 제거한다. 다음으로, 황산마그네슘이 보충된 해부 용액 1ml가 들어 있는 35mm 접시에 소뇌를 당깁니다. 조직을 작은 조각으로 자르고 30ml의 황산마그네슘 완충 해부 용액이 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다.

이 단계에서 다진 뇌 조직이 들어있는 15 밀리리터 튜브를 644 배 g, 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리한다. 그 후 상층액을 제거하고 트립신 해부 용액 10ml를 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 고속으로 테이블을 흔듭니다.

트립신 억제제 용액 1리터 2ml를 튜브에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 644회 g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 5분 후, 상등액을 제거하고 15ml 튜브로 옮기기 전에 2ml의 트립신 억제제 용액 2를 추가합니다.

그런 다음 용액이 탁해질 때까지 15ml 튜브의 조직을 분쇄합니다. 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 투명한 상층액을 제거하고 1ml의 염화칼슘 보충 해부 용액이 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.

펠릿이 들어있는 튜브의 바닥에 2 밀리리터의 트립신 억제제 용액을 더 추가합니다. 다시 트라이얼하고 5분 동안 그대로 두십시오. 상층액을 제거하고 이전 단계에서 상층액이 들어있는 튜브에 추가합니다.

대부분의 조직이 기계적으로 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다. 0.3 밀리리터의 염화칼슘 보충 해부 용액을 상층액 1 밀리리터에 대한 상층액 수집품에 추가합니다. 튜브의 내용물을 혼합한 다음 실온에서 644배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거하십시오. 펠릿에 10ml의 새 배지를 넣고 섞습니다. 그런 다음 살아있는 세포를 세고 1.5 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 6개의 세포로 희석합니다.

이전에 준비된 폴리 D-라이신 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 4개의 웰 플레이트의 경우, 샘플의 플레이트 0.5 millimiters를 웰당 5번째 셀에 7.5 곱하기 10을 제공합니다. 35mm 접시의 경우 샘플을 4 밀리리터로 플레이트하고 플레이트당 6번째 셀에 10을 6 곱하기 제공합니다.

커버 슬립의 경우 0.5 밀리리터를 플레이트하여 웰 당 5 번째 셀에 7.5 곱하기 10을 제공합니다. 24시간 후 플레이트에 AraC를 첨가하여 신경교세포 오염을 줄입니다. 세포를 7-8일 동안 유지해야 하는 경우 3일째에 이 처리를 반복하고 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 배양을 유지합니다.

5일 이상 유지된 배양액의 경우 5일째부터 2일마다 배양액에 포도당을 공급합니다. NMDA로 신경 흥분 독성을 유도하려면 시험관 7일 후 100마이크로몰 NMDA와 10마이크로몰 글리신으로 소뇌 과립 뉴런을 1시간 동안 처리합니다. 그런 다음 배지를 처리하지 않은 병렬 배양의 컨디셔닝된 배지로 교체합니다.

이 농도는 처리 후 24 시간에 50 %의 세포 사멸을 초래합니다. ROS 유도 세포 사멸의 경우 5분 동안 75-100마이크로몰에서 과산화수소로 뉴런을 처리합니다. 5분 후 병렬 배양에서 컨디셔닝된 배지로 전환합니다.

과산화수소의 불안정성으로 인해 농도는 24시간 후에 50%에서 70% 사이의 세포 사멸을 유도하는 수준으로 최적화되어야 합니다. 이 농도는 일반적으로 75에서 100 마이크로 몰 사이입니다. DNA 손상으로 인한 세포 사멸을 유도하기 위해 소뇌 과립 뉴런을 10마이크로몰 캄프토테신으로 처리하여 24시간 이내에 50% 이상의 세포 사멸을 유도합니다.

소뇌 과립 뉴런에서 낮은 칼륨 유도 신경 세포 사멸의 경우, 시험관 내에서 7일 후에 25 밀리몰 칼륨을 함유한 배지를 5 밀리몰 칼륨이 함유된 저칼륨 배지로 변경합니다. 뉴런은 도금 시 3의 MOI에서 RFP에 대한 렌티바이러스로 형질주입되었습니다. 시험관 내에서 7일째에 고정 및 염색.

RFP 신호 MAP2와 Hoechst의 공동 국소화는 렌티바이러스에 의해 완전히 형질도입된 건강한 뉴런을 보여주는 것으로 나타났습니다. 여기에 표시된 이미지는 독성을 측정하기 위해 아데노바이러스의 다른 MOI에 감염된 뉴런의 살아있는 죽은 분석 분석을 나타냅니다. 25에서 50 사이의 MOI에서 LacZ를 발현하는 아데노바이러스에 감염된 소뇌 과립 뉴런은 독성을 최소화하면서 효율성을 극대화합니다.

이 MOI에서 감염될 때 대조군과 비교하여 세포 생존율의 차이가 1% 미만인 것으로 나타났습니다. 이 그림은 세포 사멸을 유도하기 위해 NMDA로 처리된 제어 소뇌 과립 뉴런과 소뇌 과립 뉴런의 Hoechst 염색을 보여줍니다. NMDA 처리로 pyknotic nuclei의 형성을 주목하십시오.

이는 세포 사멸의 징후이며 100 마이크로 몰 NMDA 및 10 마이크로 몰 글리신으로 처리 24 시간 후 배양액의 약 50 %에서 볼 수 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 여섯 번의 마우스 팝으로 2시간 30분 안에 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행할 때 배양 오염의 위험을 최소화하기 위해 필요에 따라 무균 기술과 체인 수술 기구를 사용하는 것이 중요합니다.

개발 후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 1차 마우스 뉴런의 신경 발달 및 신경 손상을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 소뇌 과립 뉴런을 배양하고 바이러스를 사용하여 유전적으로 조작하며 다양한 신경 손상 메커니즘을 유도할 수 있어야 합니다. 이 절차에 따라 면역형광 또는 세포 생존율 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 유전자가 흥분 독성, 산화 스트레스 또는 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 생존을 향상시키는지 여부와 같은 질문에 답할 수 있습니다.