Name: 신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 마우스 소뇌 과립층 신경원을 분리 배양하여 유전자 조작 및 흥분독성, 산화 스트레스, DNA 손상 등 다양한 신경 손상 메커니즘을 체외에서 모델링하는 방법을. 이 기술은 급성 뇌 손상 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다 지원 및 건강 연구의 캐나다 학회가 A로 부여

이 프로토콜에 따라 수정 된 절차의 설명 이전 18 , , 24 25 , 26 , 27.이 프로토콜 맥 길 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 됩니다.
 1. 실험 준비 참고: 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 사용할 때까지 유지 수.
<li>해 부 솔루션 <ol><li>디졸브 3.62 g 염화 나트륨 (NaCl), 염화 칼륨 (KCl), 0.069 g의 나트륨 인산 염의 0.2 g의 <ol>(NaH 2 포 4 &#8729; H 2 O), 1.306 g D-(+)-500 mL의 포도 당 증 류 된 H 2 o. 그런 다음 솔루션에 HEPES 버퍼, 페 놀 레드 솔루션의 450 µ L 및 BSA 분수 V의 20 mL의 12.5 mL를 추가 합니다. PH 7.4 1 N 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 조정.</li>
		<li>Sterilize 0.22 μ m 필터와 4 ° c.에 게 이 솔루션 10 일 최대 1 주일 동안 안정적으로 유지 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>Trypsin <ol><li>0.9% 염화 나트륨에에서 trypsin의 25 g/L의 농도에서 재고 솔루션을 준비. 저장 솔루션-20에 ° c.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제 물 <ol><li>닭고기 달걀 흰 트립 신 억제 물 100 ml의 1 m m HCl. 저장소의 1 g을 용 해 하 여-20에이 솔루션 10 mg/mL의 농도와 재고를 준비 ° c.</li>
	</ol></li> <li>DNase <ol><li>100mg DNase 1의 10 mg/mL 재고를 생성 하기 위해 살 균 물 10 mL에 녹. 저장 솔루션-20에 ° c.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>50 mL의 증류수 (H 2 O) 1 M 재고 생성 하에 6.02 g 황산 마그네슘 (MgSO 4)의 추가. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>0.735 g 염화 칼슘의 분해 (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) 50 ml 증류수 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>KCl <ol><li>50 mL에 KCl의 분해 3.7275 g H 2 O 4에 1 M. 저장소 솔루션의 재고 농도에 증류수 ° c.</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-포도 당 <ol><li>녹 1.802 g D-(+)-50 mL에 포도 증 류 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>셀 문화 미디어 <ol><li>세포 배양 기를 다음과 같이 준비: 열의 5 mL 비활성화 소 태아 혈 청을 dialyzed, 200 m m 1.0 M KCL의 L-글루타민, 50 mg/mL Gentamycin 및 1 mL의 100 µ L의 500 µ L 45 mL에 추가 되어야 한다 필터의 소독이 글 &#39; s 최소한의 필수 미디어 (전자-MEM) 1.125 g/l D 보충-소 뇌과 립 신경 문화 미디어의 50 mL를 생성 하는 포도 당. 저장 미디어 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>시 토 신 베타-D-Arabino Furanoside <ol><li>48 mg 10 ml 20 m m의 재고 농도에 성장 매체의 시 토 신 베타-D-arabino furanoside의 분해. 저장 솔루션-20 ° c.</li>
	</ol></li> <li>폴 리-D-리 신 <ol><li>2 mg/mL 폴 리 D-리 신 주식을 생성, 폴 D-리 리의 20 밀리 그램 살 균 H 2 O의 10 mL을 추가. 소재 폴 리 D-라이 신-80 ° c 100 µ L aliquots에서 저장 해야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>참고: 다음 솔루션을 해 부 하기 전에 준비 하 고 사용 때까지 4 ° C에서 유지 해야 합니다.</li>
	<li>MgSO 4 Supplemented 해 부 솔루션 <ol><li>재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 250 mL의 추가 300 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 해 부 솔루션 <ol><li>재고 trypsin 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 12 µ L의 추가 100 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제제 솔루션 1 <ol><li>재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 250 µ L 해 부 솔루션의 10 mL를 재고 MgSO 4의 12 µ L의 추가 164 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제제 솔루션 2 <ol><li>재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 750 µ L 해 부 솔루션의 10 mL을 MgSO4 주식의 12 µ L의 추가 1040 µ L.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 보충 해 부 솔루션 <ol><li>재고 CaCl 2 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 25 µ L의 추가 10 µ L.</li>
	</ol></li> <li>폴 리 D-리 신 코팅 문화 요리 <ol><li>코트 문화 요리, 살 균 H 2 o.의 40 mL에 재고 폴 리 D-리의 100 µ L를 희석 35 mm Nunc 문화 요리에 대 한 희석된 폴 리 D-리 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 4 잘 플레이트, 300 µ L 희석된 폴 리 D-리의 각 음을 추가할.</li>
		<li>게 발음 하 고 각각을 세척 하기 전에 폴 리 D-리 앉아 1 h 4 mL 또는 600 µ L (대 35 mm 요리 문화 또는 4 잘 플레이트, 각각) 잘 살 균 H 2 o. H 2 O 발음 그리고 요리 공기 1 헤 건조</li>
	</ol></li></ol> 2. 추출 및 격리의 소 뇌 뇌 <ol><li>Decapitate 6-7 일 오래 된 마우스 강아지 잘린이 위를 사용 하 여. 메 마른 조직 문화 후드에는 뇌의 해 부를 수행.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 머리를 잡고 두뇌를 제거 하 고 그림 1에서 같이 서가 위를 사용 하 여 머리의 앞쪽으로 피부를 통해 잘라. 그럼 오염 위험을 최소화 하기 위해가 위의 새로운 쌍을 사용 하 여 두개골 뼈를 통해 서 잘라. 집게를 사용 하 여 두뇌를 포함 하는 두개골을 제거 하 고 집게 또는 주걱을 사용 하 여 두뇌 애타게.
	<ol><li>전체적으로 뇌를 빼내 촉진을 시 신경을 통해 필요에 따라 잘라.</li>
	</ol></li> <li>뇌 해 부 솔루션 MgSO 4 보충 되는 장소. 솔루션 및 얼음에 두뇌</li>
	<li>다음 제거, 해 부 현미경 뇌, MgSO 4 보충 해 부 솔루션에서 뇌에서 뇌를 해 부하 고 meninges 미세 집게를 사용 하 여 제거. 그것의 복 부 측에 소 뇌 및 맥락 막 신경 총의 제거 확실히.</li>
	<li>MgSO 4 보충 해 부 솔루션의 ~ 1 mL를 포함 하는 35 mm 접시에는 cerebella 풀.</li>
	<li>조직의 작은 조각으로 잘라 고 MgSO 4 버퍼링 해 부 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브로 전송.</li>
</ol> 3. 마우스의 소 뇌과 립 신경은 고립과 Culturing <ol><li>g x 644 및 4에 5 분에 대 한 다진된 대뇌 조직을 포함 하는 50 mL 튜브 원심 ° c.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 트립 신 해 부 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 다음 37에서 15 분 동안 고속에 튜브를 흔들어 ° c.</li>
	<li>트립 신 억제제 솔루션 튜브를 2 분에 대 한 부드럽게 바위 1의 추가 10 mL</li>
	<li>G x 644 및 4에 5 분 동안 튜브 원심 ° c.</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고의 2 개 mL를 추가 트립 신 억제제 솔루션 2, 및 다음 이전 15 mL 튜브.</li>
	<li>Triturate 15 mL에 조직 관 솔루션 어두운 될 때까지. 다음 5 분에 대 한 정착 하자</li>
	<li>분명 상쾌한을 제거 하 고 새 튜브 CaCl 2 보충 해 부 솔루션의 1 mL를 포함 하는 상쾌한 전송.</li>
	<li>단계 3.6에서에서 펠 릿을 포함 하는 튜브의 하단에 트립 신 억제제 솔루션 2의 또 다른 mL를 추가 합니다. 다시 triturate 그리고 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 상쾌한 단계 3.7 (즉, 반복 단계 3.6-3.7)에서 포함 된 튜브에 추가 대 한 합의. 조직의 대부분 기계적으로 해리 될 때까지이 과정을 반복.</li>
	<li>추가 CaCl 2의 0.3 mL 보충 상쾌한의 모든 mL에 대 한 표면에 뜨는 컬렉션에 해 부 솔루션.</li>
	<li>튜브의 내용을 믹스 하 고 644 x g.에서 5 분 동안 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 10 mL 신선한 매체의 펠 릿을 추가 하 고 혼합.</li>
	<li>셀 다음 계산 하 고 1.5 x 10 6 셀/mL의 농도를 희석 수 있습니다. 일반적으로 10 백만 셀 trypsinization 시간 및 해 부의 효율성에 따라 각 해 부 두뇌에서 예상 된다 note 하시기 바랍니다. 이전 만든된 폴 리 D-리 신 판에 셀 플레이트. 4-잘 접시, 접시 0.5 mL, 잘 당 10 5 셀 x 7.5를 주는. 35 mm 요리 접시 4 mL 접시 당 6 x 10 6 세포 주는.</li>
	<li>후 24 h, glial 오염 줄이기 위해 접시를 시 토 신-β-arabino furanoside (아크)를 추가 합니다. 미디어의 각 mL 20 m m 아크의 0.5 µ L가 필요 합니다. 아크의 추가 미디어의 변화를 필요 하지 않습니다. 셀 하는 경우 7-8 일에 대 한 유지, 3 일에이 치료를 반복.</li>
	<li>37 ° C에서 5% CO 2 배양 기에서 문화를 유지 하 고 100 m m 포도 당 매 2 일 지난 5 일 미디어의 모든 2 mL에 대 한 문화에 추가의 100 µ L를 피드. 완전 한 미디어 변경 필요 하지 않습니다.</li>
</ol> 4. Lentivirus 포장, 정화와 적정 참고: 포장, 농도, 정화 및 lentivirus의 적정에 대 한 프로토콜 이전 키트의 사용 없이 자세히 기술 되었다 28, 교류 cytometry 29 등 적정에 대 한 대체 메서드를 포함 하 여. 여기에 우리가 짧게 제시 신경 부상 빠른 바이러스 정화 솔루션 및 정량 lentiviral 적정 키트를 사용 하 여 공부 하기 lentivirus의 생산에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 프로토콜.
<li>Dulbecco와 10 cm 문화 요리에서 접시 Hek293T 셀 <ol>&#39; s 수정이 글 &#39; s 최소 필수 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS. 높은 바이러스 titer를 얻기 위해 각 transfection에 대 한 Hek293T 셀의 적어도 5 접시를 성장. Transfection 셀 당일 확인은 70% 합칠. 변경 미디어 transfection 전에 3 시간.</li>
	<li>각 transfection에 대 한 두 개의 튜브를 준비. 튜브에 1 1.5 mL 혈 청 MEM 감소 미디어와 transfection 시 약의 41 µ L 섞어 잘 추가 합니다. 튜브 2, MEM 감소 혈 청 미디어의 1.5 mL 및 전송 플라스 미드의 6 µ g, pCMV-dR8.2 벡터 (포장 플라스 미드)의 6 µ g, 3 µ g pCMV VSV G 벡터 (봉투 플라스 미드), 그리고 p3000 증강 시 약 (lipofectamine 함께 제공 됨)의 35 µ L를 추가 합니다. 잘, 그리고 결합 튜브 1과 2, 소용돌이 혼합 하 고 15 분에 대 한 품 어</li>
	<li>는 Hek293T 격판덮개에서 미디어의 50%를 제거 하 고 세포에 DNA 지질 단지를 추가. 37 ° C, 5% CO 2에서 6 h에 품 어. 미디어를 제거 하 고 신선한 DMEM의 5 mL을 바꿉니다, 밤새 품 어.</li>
	<li>에서 24 h 후 transfection, 각 접시에서 바이러스 상쾌한의 첫 번째 일괄 처리를 수집 합니다. 4 ° C에서 바이러스 성 미디어를 유지 하 고 Hek293T 세포의 각 격판덮개에 신선한 미디어의 5 mL을 추가. 밤새 품 어.</li>
	<li>48 h 후 transfection 바이러스 상쾌한의 두 번째 배치를 수집 하 고 첫 번째 일괄 처리와 결합 하 고, 결합 된 바이러스 상쾌한 600 x g.에서 10 분 원심</li>
	<li>는 상쾌한 45 µ m 기 공 크기와 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>빠른 바이러스 정화 솔루션을 사용 하 여 바이러스를 정화. 바이러스 성 상쾌한의 모든 45 ml lentiviral 바인딩 솔루션, 믹스, 그리고 분리기에서 10 분의 5 mL을 추가 &#62; g 및 4 x 5000 ° c.</li>
	<li>상쾌한을 신중 하 게 제거는 펠 렛을 방해를 하지.</li>
	<li>매체의 20-40 µ L을 추가 하 고 다시는 펠 릿을 일시 중단. 약 수와 스토어-80 ° c.</li>
	<li>Lentiviral titer, 정량 lentiviral 적정 키트를 얻기 위해 사용 됩니다. PBS의 500 µ L에서 순화 된 바이러스의 2 µ L를 희석. 바이러스 세포의 용 해 버퍼 (키트에 제공 되는)의 18 µ L를 희석된 바이러스의 2 µ L을 추가.</li>
	<li>다른 3을 설정 RT-q-PCR 반응에 triplicates 그리고 그들, 바이러스 lysate, 긍정적인 컨트롤 1 (STD1), 및 긍정적인 컨트롤 2 (STD2). 각 반응에 대 한 추가, 2 x 정량 MasterMix의 2.5 µ L의 12.5 µ L 바이러스 성 lysate 또는 STD1 (키트에 제공) 또는 STD2 (키트에 제공), 그리고 시 약-믹스 (키트에 제공 되는) 0.2 mL PCR 튜브에 10 µ L.</li>
	<li>PCR 프로그램을 다음과 같이 설정: 반전 녹음 방송, 효소 활성화, 15의 40 주기를 위한 95 ° C에서 10 분에 대 한 42 ° C에서 20 분 변성 및 어 닐 링/확장을 위한 60 ° C에서 1 분 95 ° C에서 s.</li>
	<li>계산이 수식을 사용 하 여 바이러스 titer: 
	Lysate의 바이러스 titer = 5 × 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	Ctx = 알 수 없는 샘플, Ct1의 평균 Ct 값 = STD1, Ct2의 평균 값 = STD2의 평균 값. 
	참고: CGNs는 lentiviruses로 불리고 또는 공부 되 고 상해의 모드 adenoviruses 감염 최고의 될 수 있습니다. 도금 시에 2-3 셀 문화 솔루션의 나는 lentiviruses의 추가 NMDA 유도 신호 문화 제 7 일에 공부 하는 데 사용 됩니다. 80% 이상에서이 결과 변환 ( 그림 2) 이러한 뉴런의 생 화 확 적인 분석을 추구 하 고. (나 50)에서 문화와 NMDA 유도 하루 7-8에서 신호를 공부 하 고 5 일에 adenoviruses의 추가 영상 같은 다른 기술을 사용 됩니다. 10%가 하에이 치료 결과 신경 세포 이미징 및 단백질의 공동 지역화에 이상적의 감염. Adenoviruses 도금 시 DNA 손상 유도 된 세포 죽음을 공부를 과산화 수소의 추가 의해 하루 2-3 또는 산화 긴장에서 camptothecin의 추가 의해 사용할 수 있습니다. 관심사의 유전자에 형광 단백질 (GFP, RFP, CFP 또는 YFP)의 존재는 백분율 변환 및 잠재적인 독성 예측에 사용할 수 있습니다. 권장된 나 우리 볼 최소한의 독성과 최대 변환 ( 그림 3).</li>
</ol> 5. 신경 상해 모델링 <ol>NMDA 유도 <li>유도 신경 excitotoxicity, 체 외에 7 일, 1 헤 없이 병렬 문화에서 바른된 매체 바꿉니다 모든 매체에 대 한 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 CGNs 치료 치료입니다. 이 농도 24 h 게시물 치료 ( 그림 3C)에서 50% 세포 죽음에서 발생합니다. 미토 콘 드 리아 조각화는 분명 6-8 h 게시물 치료 (참조 Jahani Asl 외. 26 , 27).</li> <li>신경 치료 선생님-유도 된 세포 죽음 (산화 스트레스)을 유도 하는 것75-100 µ M 과산화 수소 (H 2 O 2)와 스위치를 ns H 2 O 2에 5 분 노출 다음 병렬 문화에서 미디어 조절. 참고, H 2 O 2의 불안정으로 인해 문화 치료의 24 h 다음에 50-70% 세포 죽음을 유도 하는 수준으로 농도 최적화.</li>
	<li>유도 DNA를 손상 유도 된 세포 죽음, 10 µ M camptothecin와 CGNs를 치료. 이 농도 24 h. 미토 콘 드 리아 조각화의 50% 세포 죽음 보다 더 유도 및이 농도 (참조 Jahani Asl 외에 camptothecin의 추가 후 2-3 h 발생 초기 apoptotic 신호 18)</li> <li>낮은 K + 유도 신경 apoptosis CGNs에서 유도, 25 m m K + + 5 m K m 낮은 칼륨 미디어 7 일에서 체 외에 다음을 포함 하는 미디어 변경.</li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 기본 마우스 소 뇌과 립 신경 (CGNs), 손실 및 기능 연구의 이득의 경작 그리고 세포 죽음의 다른 메커니즘을 모델링에 대 한 간단한 방법을 제공 합니다. 여러 가지 요인을 가까운 모니터링을 요구 하는이 절차를 사용 하 여 결과의 재현성을 영향을 줍니다. 문화 문화, 문화의 합류에에서 glial 세포의 제거를 포함 하 고 건강 한 세포를 유지의 순도 포함 됩니다. 이러한 요인에 변화를 도입 결과 바이어스 하 고 재현성을 도전 수 있습니다. 아래는 부정적인 결과 영향을 주는 요소를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.
CGNs 문화에서 glial 세포를 제거 하 고 순수한 신경 모집단 확립, 시 토 신-β-arabino furanoside (아크), DNA 합성을 억제 함으로써 증식 세포를 죽이고 pyrimidine antimetabolite의 10 µ M을 사용 합니다. 여전히 인구 glial 세포 존재의 경우에, 아크의 농도 15 µ M를 늘릴 수 있습니다. 이것은...

소 뇌과 립 신경 (CGNs) 문화에서 잘 성격을 나타낸다 고 신경 죽음 및 개발 1,2,3,,45, 연구는 효과적인 모델 역임 6. CGN 문화에서 체 외에 있는 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체의 초기 식 게 NMDA 유도 신호를 공부 하는 매력적인 모델. 함께 막 도발은 NMDA와 함께 이러한 수용 체의 활성화 생리 적 신경 활동 자극, 모델링 하는 데 사용 되 고 시 냅 스가 소성 7,8의 메커니즘으로 연구에 대 한 허용 했다. 그와 반대로, NMDA ligand에 의해 이러한 수용 체의 과잉 자극 excitotoxicity, 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행 성 질환 9신경 손실의 주요 메커니즘을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 신경 상해 본 excitotoxicity의 유도 대 한 메커니즘 중 하나 감소 산소와 ATP 기아 통해 이다. 그러면 막 도발은 고 조미료의 높은 수준의 시 냅 스에서 출시. 과도 한 Ca2 + 유입이 수용이 체를 통해 여러 경로 포함 하 여 캘리포니아2 +차례 차례로 활성화에 높은 조미료 결과 NMDA 수용 체의 후속 overstimulation-phospholipases, 프로 테아 제 활성화 및 endonucleases, 중요 한 세포 구성 요소와 세포 죽음의 통제 저하 발생 또한, 높은 세포내 캘리포니아2 + 리드 생성 산소 자유 래 디 칼 및 미토 콘 드리 아 손상 10,11.
NMDA 유발 신경 excitotoxicity 다음 신경 손실의 대부분은 칼슘 유입 때문 이며 Bax/박 독립,이 모델에서 세포 죽음의 다른 메커니즘을 제외할 수 없습니다. 회 저 성 둘 다의 외관 그리고 apoptotic 세포 죽음 excitotoxicity 때문 반응성 산소 종 (선생님)와 높은 세포내 캘리포니아2 + 레벨 12로 인 한 DNA 손상의 발생으로 인해 부분적으로 같은. DNA 손상 신경 죽음 apoptotic 세포 죽음, chromatin 대중과 apoptotic 시체의 모습 등의 연관 되는 apoptotic 메커니즘을 통해 결과. Apoptosis의 감 응 작용은 미토 콘 드리 아에서 시 토 크롬 c의 출시를 통해 중재 그리고 Bax/박 oligomerization 13에 종속 되도록 표시 되었습니다. Bax/박 oligomerization 시 토 크롬 c 출시 및 프로 apoptotic 레 귤 레이 터로 가벼운 허 혈 성 부상 14본의 활성화의 결과로 외부 미토 콘 드리 아 막의 기 공 형성을 촉진 합니다.
선생님의 세대 신경 기능 15큰 산소 요구와 결합 하는 항 산화 물질의 낮은 생 수준 때문에 뇌에서 중요 한 문제입니다. 허 혈 성 이벤트에 노출 되 면 산화 질소 synthase upregulated, 질소 산화물을 생성 하 고 반응성 산소 종 14증가입니다. 산소 래 디 칼의 농도 증가 DNA 손상 하 고 간접적으로 에너지 부족을 일으킬 수 있습니다. 높은 수준의 DNA 이중 가닥 나누기의 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-1 (PARP-1), 진 핵 chromatin-바인딩 단백질 catalyzing 나드+, 통합 하는 과정에서에서 ADP ribose 단위 전송에 대 한 책임의 활성화에 의해 조치를 취했고합니다 DNA 수리 16. 그러나, 산화 스트레스로 인해 과도 한 손상, PARP 1 활성화 하면 증가 드레인으로 인해 에너지 기아 나드+, 산화 인 산화를 통해 ATP 생산을 위한 필요한 기판에. 궁극적으로, 산화 스트레스는 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 출시로 이어지는 Bax/박 종속 방식으로 apoptosis를 일으킬 것 이다 그리고 유도 미토 콘 드 리아 CGNs 17개장을 보여줘 왔다.
마지막으로, 염화 칼륨 (KCl) CGN 문화에서의 농도에 변화 낮은 칼륨/도발은 중재 apoptosis 18,,1920를 사용할 수 있습니다. K+의 낮은 수준에 드러낼 때, CGNs 받아야 뚜렷한 생리 적 변화, 미토 콘 드리 아 호흡의 분해, 세포질 수요 감소 21에 감소 레벨의 감소에 있는 결과 핵 요인-κB (NFκB) 염증, 시 냅 스 전송 22등의 활동을 조절. 이 모형은 신경 발달 동안에 세포 죽음의 연구에 대 한 특정 관심의 이다. 낮은 K+ 환경 더 밀접 하 게 유사한 생리 적 조건, 고 신경 개발 23중 세포 죽음의.
요약 하자면, CGNs 신경 죽음 및 변성의 기본 분자 메커니즘을 조사 하는 오랜 모델을 제공 합니다. 다음 프로토콜 고립과 CGNs, 식 또는 바이러스 및 신경 상해 및 변성을 대표 하는 다른 메커니즘을 통해 신경 죽음의 유도 사용 하 여 특정 유전 통로의 억압의 경작을 허용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>qPCR 렌티비트랄 적정 키트&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>신속한 바이러스 정제 솔루션&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>증류수&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td><td></td></tr><tr><td>35mm Nunc 배양 접시</td><td>Gibco</td><td>#174913</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자 트립신 억제제&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>사이토신 베타-D-아라비노 후라노사이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-minimal essential medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 투석 Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>헤페스 버퍼&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/mL Gentamycin&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸-D-아스파르트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 솔루션&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>p3000 강화제 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 감소 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9258</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9286</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9298</td><td></td></tr><tr><td>폴리 D-라이신&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 소 뇌에 풍부한 균질 인구를 형성 일반적으로 사용 되 신경 모델입니다. 그들의 출생 개발, 풍부, 및 접근에 비추어 CGNs는 신경 프로세스, 신경 개발, 생리 적 신경 활동 자극, 신경 마이그레이션 등을 공부 하는 이상적인 모델입니다. 또한, CGN 문화 excitotoxicity 등 apoptosis는 세포 죽음의 다른 모드를 공부에 대 한 훌륭한 모델을 제공 합니다. 문화에 주, CGNs N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체, 신경 건강 및 질병에 많은 중요 한 기능을 가진 특정 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체를 표현 한다. 함께 설치류 기본 CGN 문화에 막 도발은 NMDA의 낮은 농도의 추가 동안 NMDA의 높은 농도의 추가 모델을 채택 될 수 있다 생리 적 신경 활동 자극을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. excitotoxic 신경 부상입니다. 여기, 격리의 방법 및 6 주 오래 된 강아지 adenoviruses와 lentiviruses CGNs의 유전자 조작에서 CGNs의 배양 설명 되어 있습니다. 우리는 또한 NMDA 유도 excitotoxicity, 낮은 칼륨-유도 된 apoptosis, 산화 스트레스와 DNA 손상 이러한 뉴런의 변환에 따라 자극 하는 방법에 현재 최적화 된 프로토콜.

그림 1A-B에서 보듯이 조심 해 부와 그대로 뇌 최소한의 손상으로 제거 한다. 노력 제거 하는 동안 두뇌에 손상을 최소화, 특히 소 뇌 손상에 취해야 한다. 더 어려운 식별 하 고 meninges의 완전 한 제거에 대 한 소 뇌 손상 그리고 신경 문화의 오염의 가능성을 증가. Meninges 제거 되었습니다 일단 소 뇌 그림 1C 에서 보듯이 나머지 조직에서 해 부 고 분리에 대 한 준비.
도금, 이전 CGNs lentivirus로 불리고 하거나 그림 2에 설명 된 대로 아 데 노 바이러스에 감염 될 수 있습니다. 우리 lentivirus (<strong class="xfi...

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 건강한 순수 소뇌 과립세포군을 생산하고, 이를 유전적으로 조작하여 인비트로(in vitro) 일차 배양에서 신경 손상의 다양한 기전을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 신경 손상 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 우리는 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행성 질환 이후의 신경 손상에 대한 근본적인 분자적 기전을 조사하기 위해 이 프로토콜을 사용합니다.이 프로토콜의 주요 장점은 배양 시스템을 사용하여 흥분독성, 산화적 스트레스, DNA 손상 및 발달 사건과 같은 다양한 세포 사멸 기전을 모델링할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신경 세포 손상에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 쥐의 소뇌 신경 세포에 적용하여 성장 인자 및 부수적 사건에 반응하는 신경 활동과 형태 발생을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 6~7일 된 생쥐의 뇌를 추출하려면, 핀셋으로 머리를 잡고 미세 해부 가위로 머리 방향 앞쪽의 피부를 절개하십시오.피부를 뒤로 밀어 두개골을 드러냅니다. 다음으로, 가위 끝으로 두개골을 뚫고 앞쪽과 가쪽으로 절개합니다. 소뇌가 손상되지 않도록 주의하며 뇌수막의 식별과 제거를 용이하게 한 후, 핀셋을 사용하여 두개골을 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다.포셉이나 스파튤라를 사용하여 뇌를 차가운 해부 용액 속으로 조심스럽게 꺼냅니다. 소뇌를 분리하려면, 황산마그네슘이 첨가된 해부 용액에 뇌를 넣고 용액과 뇌를 얼음 위에 둡니다. 해부 현미경 하에서 미세 포셉을 사용하여 뇌막을 제거한 후, 황산마그네슘이 첨가된 해부 용액 내에서 뇌로부터 소뇌를 분리합니다.이는 남아있는 뇌막을 벗겨내는 데 도움이 되며, 층 사이로 들어가 소뇌 주름을 세척할 수 있게 합니다. 뉴런 배양 시 뇌막이 남아 있으면 세포 상태가 나빠지고 결국 세포 사멸로 이어집니다. 따라서 배양을 진행하기 전에 뇌막을 완전히 제거하는 것이 중요합니다.그 후, 소뇌를 복측으로 돌려 맥락총이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 다음으로, 소뇌를 1 mL의 황산마그네슘이 첨가된 해부 용액이 들어 있는 35 mm 접시로 옮깁니다. 조직을 작은 조각으로 자른 후, 30 mL의 황산마그네슘 완충 해부 용액이 들어 있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.이 단계에서는 잘게 다진 뇌 조직이 담긴 15 mL 튜브를 4°C에서 644 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 10 mL의 trypsin 해리 용액을 첨가합니다. 그런 다음 37°C에서 15분 동안 고속으로 셰이커를 작동시킵니다.트립신 억제제 솔루션 1 2 mL를 튜브에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 이어서 튜브를 4°C에서 644 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 5분 후 상층액을 제거하고 트립신 억제제 솔루션 2 2 mL를 추가한 다음 15 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음, 용액이 탁해질 때까지 15 milliliter 튜브 내의 조직을 마쇄합니다. 5분 동안 침전시킵니다. 그런 다음 투명한 상층액을 제거하여 1 milliliter의 calcium chloride가 첨가된 해부 용액이 들어있는 새 튜브로 옮깁니다.펠렛이 들어 있는 튜브 바닥에 trypsin inhibitor solution two 2 mL를 추가로 넣습니다. 다시 한번 파이펫팅하여 혼합한 후 5분 동안 침전시킵니다. 상층액을 제거하여 이전 단계의 상층액이 담긴 튜브에 추가합니다.대부분의 조직이 기계적으로 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다. 상층액 1 mL당 0.3 mL의 염화칼슘 보충 해부 용액을 상층액 수집액에 추가합니다. 튜브의 내용물을 혼합한 후 상온에서 644 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 상층액을 제거하십시오. 펠릿에 10밀리리터의 신선한 배지를 추가하고 혼합하십시오. 그런 다음 생존 세포 수를 측정하고, 세포 농도가 밀리리터당 1.5 x 10^6 세포가 되도록 희석하십시오.이전에 준비한 poly D-lysine 플레이트에 세포를 분주합니다. 4-well 플레이트의 경우, well당 7.5 $\times$ 10⁵ cells가 되도록 샘플 0.5 mL를 분주합니다. 35 mm 디쉬의 경우, 플레이트당 6 $\times$ 10⁶ cells가 되도록 샘플 4 mL를 분주합니다.커버슬립의 경우, 웰당 7.5 × 10⁵ cells가 되도록 0.5 milliliters를 분주합니다. 24시간 후, 글리아(glial) 오염을 줄이기 위해 플레이트에 AraC를 첨가합니다. 세포를 7~8일 동안 유지해야 하는 경우, 3일째에 이 처리를 반복하고 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 유지합니다.5일보다 오래 유지하는 배양액의 경우, 5일째부터 이틀마다 포도당을 공급하십시오. NMDA로 신경 흥분성 독성을 유도하려면, 인비트로(in vitro) 배양 7일 후 소뇌 과립 뉴런을 100 micromolar NMDA와 10 micromolar glycine으로 1시간 동안 처리하십시오. 그 다음, 배지를 처리를 하지 않은 병행 배양액의 조건 배지로 교체하십시오.이 농도는 처리 후 24시간 시점에 50%의 세포 사멸을 유도합니다. ROS 유도 세포 사멸을 위해서는 뉴런을 75 내지 100 µM의 과산화수소로 5분 동안 처리하십시오. 5분 후, 이를 평행 배양된 조건화 배지로 교체하십시오.과산화수소의 불안정성으로 인해, 24시간 후 50에서 70% 사이의 세포 사멸을 유도하는 수준으로 농도를 최적화해야 합니다. 이 농도는 보통 75에서 100 micromolar 사이입니다. DNA 손상을 통해 세포 사멸을 유도하려면, 소뇌 과립 뉴런을 10 micromolar camptothecin으로 처리하여 24시간 이내에 50% 이상의 세포 사멸을 유도하십시오.소뇌 과립 뉴런에서 저칼륨 유도 신경세포 사멸을 위해, 체외 배양 7일 후 25 millimolar 칼륨이 포함된 배지를 5 millimolar 칼륨의 저칼륨 배지로 교체합니다. 뉴런은 세포 도말 시 MOI 3의 렌티바이러스를 이용하여 RFP로 형질전환되었습니다. 체외 배양 7일째에 고정 및 염색을 수행하였습니다.RFP 신호, MAP2 및 Hoechst의 공동 국소화(co-localization)는 렌티바이러스에 의해 완전히 형질전환된 건강한 뉴런을 보여줍니다. 여기에 제시된 이미지는 독성을 측정하기 위해 서로 다른 MOI의 아데노바이러스로 감염시킨 뉴런의 생사 분석(live-dead assay) 결과입니다. LacZ를 발현하는 아데노바이러스로 25에서 50 사이의 MOI로 감염시킨 소뇌 과립 뉴런은 최소한의 독성을 유지하면서 최대 효율을 나타냅니다.이 MOI에서 감염시켰을 때 대조군과 비교하여 세포 생존율의 차이가 1% 미만으로 나타납니다. 이 수치들은 대조군 소뇌 과립 뉴런과 세포 사멸을 유도하기 위해 NMDA를 처리한 소뇌 과립 뉴런의 Hoechst 염색 결과를 보여줍니다. NMDA 처리 시 응축핵이 형성되는 것에 주목하십시오.이는 세포 사멸의 징후이며, 100 µM NMDA 및 10 µM glycine으로 처리한 24시간 후 배양액의 약 50%에서 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 마우스 6마리를 사용하여 2시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 본 기술을 수행할 때는 배양 오염 위험을 최소화하기 위해 무균 조작법을 사용하고 필요에 따라 멸균된 수술 기구를 사용하는 것이 중요합니다.개발 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 일차 마우스 뉴런에서 뉴런의 발달과 뉴런 손상을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 소뇌 과립 뉴런을 배양하고, 바이러스를 이용하여 유전적으로 조작하며, 다양한 기전의 신경 손상을 유도할 수 있게 될 것입니다. 이 절차에 따라 면역형광법이나 세포 생존능 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여, 특정 관심 유전자가 흥분성 독성, 산화적 스트레스 또는 DNA 손상에 대응하여 세포 생존을 향상시키는지와 같은 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

이 비디오는 1차 마우스 소뇌 과립 뉴런을 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 세포는 증식하는 신경교세포를 제거하고 소뇌 과립 뉴런의 순수한 배양을 생성하기 위해 항대사 산물로 처리됩니다.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 분리 및 배양)

이 비디오는 마우스의 일차 소뇌 과립 뉴런에서 뉴런 손상 모델의 생성을 보여줍니다. 흥분성 신경전달물질 수용체 작용제인 NMDA와 공동 작용제인 글리신을 사용하여 신경 손상을 유도하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NMDA와 글리신은 특정 신경 수용체에 결합하여 과도한 자극을 유발하고 세포 내 칼슘을 대량으로 유입시켜 신경 세포 손상과 사멸을 초래합니다.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링)

이 비디오는 마우스의 1차 소뇌 과립 뉴런에서 ROS(Reactive Oxygen Species)를 사용하여 뉴런 손상 모델을 생성하는 방법을 간략하게 설명합니다. 고농도의 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 유발하는 과정을 자세히 설명합니다. ROS 노출은 DNA 가닥 단절과 게놈 불안정성을 유발합니다. 또한 세포 단백질의 산화는 기능을 손상시키고 지질 과산화는 멤브레인 무결성을 손상시킵니다. 이 연쇄 반응은 사이토크롬 c 방출 및 카스파아제 활성화로 이어져 신경 세포 사멸을 초래합니다.

Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

출처 : Chan, U.,  et al., 소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 In vivo Postnatal Electroporation을 활용합니다. J. Vis. 특급. (2021).이 비디오는 형광 단백질로 표지된 마우스의 사전 고정된 뇌 조직 절편을 이미징하여 소뇌 과립 뉴런 발달 분석을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 고해상도 Z-stack 이미지를 캡처하고 신경돌기 길이, 수지상 발톱 형성, 표면적 및 부피를 포함한 구조적 매개변수를 측정하여 시냅스 형성을 연구합니다.

다양한 발달 단계에서 소뇌 과립 뉴런의 시냅스 형성 시각화

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

여기에서 우리는 출생 후 뇌 발달 과정에서 마우스 소뇌에서 과립 뉴런의 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다.이 세포는 시냅스 구조를 개선하고 시냅스를 형성하여 전체 뇌 회로에 통합됩니다.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

배우세요 마우스 소뇌 과립층 신경원을 분리 배양하여 유전자 조작 및 흥분독성, 산화 스트레스, DNA 손상 등 다양한 신경 손상 메커니즘을 체외에서 모델링하는 방법을. 이 기술은 급성 뇌 손상 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

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