포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 절차의 목표는 두 가지 유형의 CRIPSR/Cas9 매개 유전체 편집에 의해 생성된 클론 녹아웃 세포주를 분리하고 식별하는 것입니다. 한 가지 방법은 비상동 말단 결합으로 인한 단백질 녹아웃을 검출하는 반면, 다른 방법은 상동성 유도 복구에 의해 생성된 게놈 섭동을 검출합니다. 이 방법은 유전자 섭동이 있는 세포주의 생성이 유전자 기능을 해부하는 데 중요한 도구인 분자 생물학 분야에서 특히 유용합니다.

이 기술의 주요 장점은 기본 분자 생물학 기술을 사용하여 쉽게 실행할 수 있는 빠르고 상대적으로 처리량이 높은 방법이라는 것입니다. 비상동 말단 결합은 작은 결실 또는 삽입을 도입하고 점 면역블롯에 의해 평가되는 반면, 상동성 유도 복구는 더 크고 더 정확한 섭동을 허용하고 콜로니 PCR에 의해 평가됩니다. 이 실험은 DMEM 배지에서 배양된 T-REx-293 세포를 사용하여 섭씨 37도에서 10%FBS와 5%의 이산화탄소를 보충합니다.

transvection 전에 세포를 6개의 well plate에 plate하고 untransvected control을 위한 well을 포함합니다. 세포를 약 70% 포화도까지 성장시킵니다. 상용 형질주입 프로토콜을 사용하여 2.5마이크로그램의 총 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.

selection 없이 세포를 transvection하려면 2.5 μg의 Cas9-sgRNA plasmid를 사용하십시오. Selection을 통한 세포의 transvection의 경우 0.75 μg의 Cas9-sgRNA1, 0.75 μg의 Cas9-sgRNA2 및 1 μg의 상동 재조합 템플릿을 사용합니다. 형질주입된 세포와 형질주입되지 않은 대조군을 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다.

선택으로 transvec 세포의 경우, 적절한 약물(이 경우 Neomycin)로 세포를 처리하여 약물 선택을 시작합니다. 6웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 하루에 한 번 처리된 세포를 관찰하여 트랜스벡트되지 않은 대조군의 모든 세포가 죽을 때까지 세포 사멸률을 확인합니다.

클론 집단을 분리하려면 먼저 선택 후 원래 웰에서 100% 포화도까지 세포를 성장시킵니다. 다음으로 세포를 연속적으로 희석하고 세포를 계수합니다. 단클론 콜로니(monoclonal colonies)의 적절한 생성이 완전한 녹아웃(knockout)을 얻기 위한 핵심이기 때문에 세포를 원하는 밀도로 안착시키기 위한 올바른 희석을 결정하기 위해 주의를 기울여야 합니다.

올바른 희석이 결정되면 웰당 0.33 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 세포를 안착시킵니다. 3개의 96=웰 플레이트를 장착하는 것은 하나 이상의 올바른 클론을 분리하기 위한 좋은 시작점입니다. 2-4주 동안 군체가 눈에 보일 때까지 군체를 관찰합니다.

이 대표적인 이미지는 다양한 성장 단계에 있는 군체를 보여줍니다. 착석할 때 단일 세포, 5일째에 세포, 10일째에 잘 확립된 군체. 멸균 피펫 팁을 사용하여 눈에 보이는 집락을 신중하고 정밀하게 선택하고 새 웰에 다시 장착하여 단층 성장을 촉진합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 세포를 계속 성장시킵니다. 선택하지 않은 knockout 후보 물질은 고처리량 방식으로 단백질 산물을 평가하기 위해 dot immunoblot에 의해 스크리닝됩니다. 개별 클론을 50-100% 농도로 성장시킨 후 웰 내에서 피펫팅을 하여 세포의 단층을 제거합니다.

각 웰에서 총 부피 100마이크로리터 중 90마이크로리터를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 분취합니다. 이 비디오에서는 두 개의 샘플만 처리됩니다. 5 분 동안 6, 000 RPM으로 스핀 다운하고, 매체를 제거하고, 1X SDS 로딩 버퍼의 10 마이크로 리터에서 셀 팔레트를 용해합니다.

웰에 있는 나머지 세포에 90마이크로리터의 새로운 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 세포 증식을 계속합니다. 1마이크로리터의 세포 용해물을 건조한 니트로셀룰로오스 멤브레인에 피펫팅하여 점을 형성합니다. 두 개의 개별 멤브레인에서 각 샘플을 두 번 블롯핑하여 두 개의 동일한 샘플 패턴을 만듭니다.

TBST에 있는 5%milk에 있는 막을, 흔들기와 더불어, 1 시간 동안 막으십시오. 1시간 후, 권장 1차 항체 희석으로 1차 항체로 멤브레인을 닦아내고 TBST와 우유 5%를 더합니다. 이 실험에서 한 멤브레인에서 표적 단백질인 ELAVL1에 대한 1차 항체를 사용합니다.

다른 막에서는 변화가 없을 것으로 예상되는 대조 단백질에 대한 1차 항체를 사용하며, 여기에는 PUM2가 사용됩니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 각 블롯에서 1차 항체 용액을 제거하고 TBST를 첨가한 후 5분 동안 배양합니다.

이런 식으로 TBST로 얼룩을 세 번 씻으십시오. 다음으로, 각 멤브레인에 적절한 HRP 접합 2차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 블롯합니다. 1시간 후 TBST로 멤브레인을 5분씩 3회 세척합니다.

제조업체의 지침에 따라 화학발광 기질 용액을 블롯에 바르고 디지털 화학발광 이미저에서 블로트된 멤브레인을 이미지화합니다. 마지막으로, 적절한 소프트웨어를 사용하여 표적 및 제어 단백질에 대한 점 강도를 정량화하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결과를 분석합니다. 선택 가능한 resistance marker가 있는 후보 물질은 colony PCR로 스크리닝합니다.

새로운 96웰 플레이트에서 개별 콜로니를 복제하고 세포 용해물 준비를 위해 100% 포화도로 성장시켜 이 절차를 시작합니다. 클론 한 세트에서 배지를 제거하고, 상용 DNA 전처리 키트에서 30마이크로리터의 추출 완충액에 각 웰의 세포를 재현탁한 후 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 용액을 섭씨 96도까지 15분 동안 가열한 다음 실온으로 식힙니다.

각 마이크로 원심분리기 튜브에 30마이크로리터의 안정화 버퍼를 추가하고 잘 섞습니다. 콜로니 PCR로 야생형 및 단일대립유전자 또는 이중대립유전자 돌연변이 세포주를 식별하려면, 저항성 카세트의 성공 또는 실패한 통합을 기반으로 상동성 암 주변 영역을 증폭하기 위해 두 개의 별도 PCR 프라이머 세트를 설계합니다. 각 측면에서, homology arm 외부에서 어닐링되는 공통 프라이머를 사용합니다.

야생형 대립유전자를 검사하려면 상동성 영역에 걸쳐 있는 내인성 서열에 상보적인 해당 쌍 프라이머와 함께 공통 프라이머를 사용합니다. 원하는 돌연변이를 테스트하려면 삽입된 저항 카세트를 보완하는 다른 쌍의 프라이머와 함께 공통 프라이머를 사용합니다. 검사할 각 샘플에 대해 0.5마이크로리터의 세포 용해물, 1.25마이크로리터의 10X KOD 완충액, 0.75마이크로리터의 25밀리몰 마그네슘 황산염, 1.25마이크로리터의 2밀리몰 dNTP, 0.375마이크로리터의 정방향 프라이머, 0.375마이크로리터의 역방향 프라이머, 0.25마이크로리터의 KOD 중합효소 및 7.75마이크로리터의 물을 포함하는 반응 혼합물을 준비합니다.

섭씨 95도에서 2분간 PCR을 실시한 후 95°C에서 20초, 프라이머 용융 온도를 10초, 70°C에서 20초씩 25회 사이클을 실시한다. 그 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 PCR 산물을 시각화합니다. 비상동 말단 결합을 사용한 게놈 편집을 수행하여 ELAVL1 녹아웃 라인과 점 면역 블롯을 생성하고 ELAVL1 및 PUM2를 프로빙했습니다. 제어 신호가 거의 나타나지 않는 클론은 X로 표시하고, 추가 분석에서 제외시켰다.

ELAVL1 신호가 낮은 클론은 웨스턴 블롯에 의해 추가로 테스트되었습니다. 확인된 후보는 녹색으로, 무효화된 후보는 회색으로 표시됩니다. 이 그래픽은 단백질 신호를 오름차순으로 제어하는 ELAVL1의 비율을 보여줍니다.

대부분의 경우, 상대적 ELAVL1 신호가 가장 낮은 클론 집단이 녹아웃(knockout)으로 정확하게 식별되었습니다. homology directed repair 방법에 의해 생성된 후보 물질은 colony PCR에 의해 스크리닝되었고, PCR 산물은 agarose gel 전기영동에 의해 시각화되었습니다. 다음은 내부 프라이머 및 내부 프라이머를 사용하는 업스트림 통합 접합에 걸친 프라이머를 사용한 결과의 예입니다.

프라이머는 먼저 모세포와 벌크 선택된 세포 모두에서 검증되었습니다. 24개의 개별 후보 클론의 결과가 야생형, 녹아웃 및 단일대립유전자 결실 클론에 대한 예상 밴드 패턴과 함께 표시됩니다. 검은색 화살표는 올바른 증폭 산물을 나타내고 별은 이대립유전자 녹아웃 클론을 나타냅니다.

이중대립유전자 돌연변이 계통은 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 추가로 검증되었습니다. 비상동 말단 접합은 단일 Cas9 절단 및 선택 독립적 스크리닝을 사용하므로 사전 준비가 거의 필요하지 않으며 점 블롯에 의한 녹아웃 클론 스크리닝을 통해 넉아웃 생성이 성공적인지 빠르게 결정할 수 있습니다. PCR 기반 스크리닝은 상동성 유도 복구에 의해 생성된 큰 게놈 섭동을 가진 올바른 후보 물질을 정확하게 검출합니다.

이러한 기술을 통해 분자 생물학 연구자들은 knockout을 쉽고 효율적으로 식별할 수 있으며, 세포주를 사용하여 정상 또는 기능 장애 세포 과정을 탐색할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집에 의해 생성된 클론 녹아웃 세포주를 분리하고 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.