Name: 마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 T-세포주에서 크로마틴 면역침전(ChIP)을 수행하여 히스톤 표지 분포를 연구하는 방법을. 초음파 단편화와 특이 항체를 활용한 이 기법은 면역 세포의 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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탁월한 기술 지원에 대해 P. Käse와 T. Schmidt-Wöll에게 감사드립니다. 이 연구는 DFG (독일 연구 재단)의 공동 연구 보조금 TRR81 및 Heisenberg 프로그램 (BO 1639 / 5-1), Freiburg의 Max Planck Society 및 EXC 294, Cardio Pulmonary System의 우수 클러스터 (ECCPS) - Giessen에서 TB까지

참고 :이 프로토콜에 사용 된 모든 버퍼와 매체는 표 1 에 나열되어 있습니다. 1 일과 2 일 1. 셀과 가교 결합하기 <ol><li> 6 잘 접시에서 50 ML 튜브와 4 분 5 분 동안 원심 분리기에서 마우스 T - 세포를 전송 ° C와 ~ 271 X G. IMDM 세포 배양 배지 30 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 Neubauer 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> 새로운 50 mL 튜브에 20 x 10 6 세포의 분취 량을 수집하십시오. </li><li> 포름 알데히드 (FMA)를 세포 배양 배지에 1 % 최종 농도로 첨가하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 주의 : 흡입하면 FMA가 유독하므로 흄 후드 아래에서 작업하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 FMA 폐기물을 처리하십시오. </li><li> 1/8 볼륨의 1M 글리신 (pH 7.0)을 넣고 실온에서 5 분간 품어 둔다. </li><li> 5 일 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛 화4 ° C 및 ~ 271 xg에서 10 분간 인산 완충 식염수 (PBS) 10 mL로 세척한다. </li><li> PBS 1 ML 및 1.5 ML 튜브로 전송 세포 펠렛을 씻으십시오. </li></ol> 2. 세포 용해 및 크로 마틴 절단 <ol><li> SDS 용해 버퍼 1 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 각 샘플을 초음파 처리 튜브로 옮기고 표 2 에 표시된 설정에 따라 집중된 초음파기를 사용하여 전단을 수행하십시오 . </li><li> 전단 후, 샘플을 1.5 mL 튜브에 옮기고 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하고 ~ 18,000 x g. </li><li> 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. </li><li> 50 μL를 수집하여 3 단계에 따라 전단 효율을 결정하고 전단 된 용해 액을 액체 질소로 스냅 프리즈하십시오. lysate를 -80 ° C에서 단일 사용 분취 량으로 보관하십시오. </li></ol> 3. 전단 효율의 결정 <ol><li> 50 &amp; amp;각각의 전단 된 용 해물을 181 ㎕ 씩 넣고 흔들어 주면서 밤새 65 ℃에서 배양한다. </li><li> TE 완충액 100 μL와 10 MG / ML RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 4 μL를 추가합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오. </li><li> 2 μL의 20 mg / mL proteinase K (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 시료에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 배양하고 흔들어 섞으십시오. </li><li> 각 샘플을 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 겔 튜브로 옮긴다. 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오. </li><li> 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 200 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 XG에서 5 분간 원심 분리하고 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물 처리주관 기관의 규칙에 따라 <ol><li> 한 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 다음의 수정 사항과 함께 제조사의 지시에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 : <ol><li> 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후 튜브를 실온에서 2 분 동안 열어두고 잔여 에탄올을 증발시킵니다. </li><li> 용출을 위해, 50 μL의 H 2 O를 첨가하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하고, 막을 적절하게 적시는데 1 초 동안 스핀시키고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하여, 1 분 동안 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다 24 ° C ~ 17,900 X g. </li></ol></li><li> 제조 업체의 지침에 따라 고감도 키트를 사용하여 형광 분석기에서 정제 DNA를 정량하십시오. </li><li> 1.8 % 아가 로스 겔에서 약 500 ng의 정제 된 DNA를 분석하고 고감도 키트를 사용하는 전기 영동 시스템에서 약 1 ng을 분석합니다. 참고 : 예상 크기e는 200 내지 500 bp이다. </li></ol> 3, 4 일째 4. 면역 침전 <ol><li> 5 부피의 희석 완충액으로 전단 된 용 해물 1 부피를 희석한다. </li><li> 30μL / ML 단백질 A 아가로 오스 비즈 ( 부록 A에 따라 준비)와 미리 차가운 방에서 회전하면서 30 분. </li><li> ~ 750 x g에서 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하십시오. </li><li> 투입물의 10 %를 모으고 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 원하는 분량의 용 해물을 새로운 튜브에 분주하십시오 (자세한 내용은 표 3 참조). 각 튜브에 원하는 항체를 추가하고 (자세한 내용은 표 3 참조) 4 ° C에서 밤새 회전하십시오. </li><li> 회전하는 동안 단백질 A 비즈 40 μL를 추가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. </li><li> 낮은 소금 버퍼, 높은 소금 버퍼, LiCl 버퍼 및 TE 버퍼 (각 씻어에 대한 4 분 ° C.에 5 분 품어 회전 및 원심 분리기 1 ML의 구슬을 씻으십시오4 ℃에서 3 분, ~ 950 xg). 자세한 내용은 표 3 을 참조하십시오. </li><li> 용리 버퍼 110 μL를 추가하고 매 2 분 vortexing 실온에서 15 분 품어. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 원심 분리기와 ~ 950 XG 및 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는의 100 μL를 전송합니다. </li><li> 용리 완충액 100 μL로 4.7-4.8 단계를 반복하고 용리액을 합치십시오. 샘플을 입력하기 위해 최대 200 μL의 용리 완충액을 첨가하십시오. </li><li> 모든 샘플을 65 ° C에서 밤새 인큐팅하여 흔들어 섞으십시오. </li></ol> 5 일째 5. DNA 정제 <ol><li> 각 용리액에 TE 완충액 200 μL와 10 mg / mL RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 8 μL를 넣는다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오. </li><li> 20 μg / mL proteinase K 4 μL (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 용리액에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 항온 배양하십시오. </li><li> 각 샘플을 젤로 옮기십시오.페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 튜브; 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오. </li><li> 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 400 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 X g에서 5 분간 원심 분리하십시오. 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물을 처리하십시오. <ol><li> 한 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 다음의 수정 사항과 함께 제조 업체의 지침에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 : </li><li> 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 씻은 후 잔여 에탄올을 증발 실온에서 2 분 동안 튜브를 열어 둡니다. </li><li> 용출을 위해, 50 μL의 H 2 O를 첨가하고, 실온에서 배양한다다시 1 분 동안 24 ° C에서 1 분간 원심 분리하여 DNA를 용리시키기 전에 실온에서 1 분 동안 배양하고 ~ 17,900 x g. </li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

ChIP는 단백질 또는 그 PTM이 특정 게놈 영역에서 풍부하게되는지 여부를 조사하는 유효한 기술입니다. ChIP 분석 결과는 종종 생물학적 또는 기술적 인 이유로 해석하기가 어렵습니다. 생물학적 인 이유는 여러 가지이며 DNA에 약하거나 간접적으로 결합하는 단백질을 포함합니다. 제한된 항체 특이성 및 비효율적 인 세포 용해 또는 염색질 전단과 같은 기술적 한계도 있습니다. 문제 해결 가이드 ( 표 5 )는 독자가 ChIP 분석에서 발생할 수있는 문제를 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 냉각 집중 초음파 장치를 사용하여 성숙한 마우스 T 세포주의 염색질을 효율적으로 전단 할 수 있습니다. 프로토콜의 주요 중요 단계는 각 세포 유형에 대해 항상 최적화되어야하는 염색질의 전단으로 표현됩니다. 세포 수와 sonication주기의 수를 변화시키는 것이 좋습니다. 게다가, 그녀는<html> 활성 효율성은 샘플에서 SDS 침전물의 존재에 의해 부정적으로 영향을받으며, 이는 SDS 용해 완충액으로 얼음 위에서 세포를 분해하는 동안 형성 될 수있다. 이 경우 SDS 침전물의 존재를 줄이기 위해 실온에서 몇 분 동안 용해한 후 시료를 배양하는 것이 가장 좋습니다. 200 ~ 500 bp 사이에서 절단 된 단편을 얻고 면역 침전을 진행하기 전에 시료의 전단 품질을 항상 평가하기 위해 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다. 또한, 고정 시간, 항체 및 / 또는 세포의 양 및 세척 조건은 각각의 항체에 대해 최적화되어야한다. 저 특이성 항체가 면역 침강의 효율을 현저히 감소 시킴에 따라 ChIP 절차를 성공적으로 수행하는 데있어 한 가지 더 중요한 단계는 항체의 선택입니다. 이전에는 통일 된 품질 검사 절차를 통해 시장에서 판매되는 여러 항체의 특이성을 평가할 수있었습니다<html> ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. 선별 파이프 라인은 도트 블랏, 웨스턴 블랏 및 ChIP을 기반으로 ChIP 19에 적합한 고품질 시약 목록을 제공합니다. 보다 최근에는 여러 상업적으로 이용 가능한 항체의 특이성을 고밀도 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 평가하여 항체 특이성에 대한 데이터베이스를 확립했다. 독자는이 유용한 도구를 사용하여 ChIP 실험에 사용할 수있는 가장 구체적인 항체를 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기본 T 세포에 대해 테스트되지 않았으며,이 경우 판독기는 기본 T 세포 3 , 4 , 21 에서 ChIP를 성공적으로 수행하는 다른 게시 된 프로토콜을 참조해야합니다. 주목할 만하게,이 프로토콜은 성공적으로 마우스 progenitor T - 세포 라인뿐만 아니라 마우스 내피 세포 라인에 대한 칩을 수행하는 데 사용되었습니다. ove_content &quot;&gt; 히스톤 자국 분석을 위해 각 면역 침전에 5 x 10 6 개 세포를 사용해야한다.이 프로토콜은 일부 최적화와 함께 TF 또는 보조 인자에 ChIP를 수행하기에 적합하기 때문에 세포 수를 늘리는 것이 가장 좋다 이 경우 면역 침전에 사용됩니다. 각 실험에 필요한 수의 세포에 도달하기 위해 전단 분해물의 더 많은 분량을 희석 완충액에서 염색질을 희석하기 전에 함께 모을 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 DNA에 직접적으로 결합하지 않는 내인성 단백질에서 ChIP을 수행하도록 변형 될 수 있습니다. 이 경우 단백질 - 단백 가교제 ( 예 : 디메틸 아디 피 미딘, DMA)를 사전 고정해야 할 수 있습니다 (자세한 내용은 부록 B 참조). 보조 인자에 대한 ChIP의 성공적인 수행은 이전에 biotin-tag에 융합 된 단백질을 과발현함으로써 이루어졌습니다. 이 경우 단백질을 streptavidin-conjuga자성 비드를 넣고 DMA로 사전 고정시켰다.

발달, 분화 및 항상성은 염색질 구조를 조절하는 시그널링 사건에 의해 확립 된 특정 유전자 발현 프로그램에 의존하기 때문에 특정 유전자가 세포 및 시간 특이 적 방식으로 활성화되거나 억제되는지를 결정한다. T 세포 발달 과정에서 여러 개의 중간 단계 1 을 거쳐 이중 네거티브 (DN)에서 단일 포지티브 (SP) 상태로 T 세포 전구체의 성숙을 올바르게 결정하기위한 특정 유전자 발현 프로그램을 수립해야합니다 1 . T 세포 발달 과정에서 유전자 발현 프로그램이 어떻게 동적으로 조절되는지는 지난 몇 년 동안 여러 실험실에서 2 , 3 , 4 , 5 , 6 번 조사 되었다. 히스톤의 번역 후 변형 (PTM)에 의해,히스톤 변이가있는 표준 히스톤, 뉴 클레오 솜 퇴거 및 DNA 메틸화는 유전자의 ON / OFF 스위치를 조절합니다. 여러 그룹이 PTM과 히스톤 변이체의 게놈 전체 분포를 조사하여 근위 및 원위의 조절 영역 7 , 8 , 9 , 10 에서 다른 염색질 상태와 관련된 표지를 결정했습니다. 시그널링 캐스케이드는 특정 인핸서 요소에서 양성 및 음성 염색질 변형 효소 (염색질 변형 제로도 알려짐)의 교환을 통해 동적 인 염색질 조절을 조율합니다. 이러한 염색질 변형 제는 염색질 구조를 조절하여 예를 들어 동적 히스톤 메틸화 및 아세틸 화에 의한 전사 결과를 조절합니다. 이것은 Notch 신호 전달 경로 11 , 12 , 13 ,14. 동적 히스톤 PTM; 히스톤 변이체와 교환; 히스톤, 전사 인자 및 보조 인자의 동적 인 점유는 염색질 면역 침전 (ChIP) 분석에 의해 조사 될 수있다. 고도로 특이적인 항체를 사용하여 특정 DNA- 단백질 복합체를 정제하고 정제 된 DNA를 정량적 PCR (qPCR)로 분석합니다. 심층 시퀀싱 (ChIP-Seq); 또는 요즘에는 마이크로 어레이 (ChIP-ChIP)와의 하이브리드 화가 적습니다. 칩 분석은 세포의 용해, 염색질의 전단 및 / 또는 항체의 낮은 특이성으로 인해 때로는 어려움을 겪습니다. NEXSON 15 와 마찬가지로 프로토콜을 개선하기위한 몇 가지 전략이 채택되었습니다. 냉각 수 욕조 소니 케이 터의 사용은 조사중인 단백질에 존재하는 에피토프를 손상시킬 수있는 시료 가열을 피할 수 있지만 시료의 전단에 필요한 에너지는 물에 분산됩니다.에너지의 분산을 방지하는 집속 된 초음파 장치의 개발로 또 다른 개선이 이루어졌습니다. 따라서 초점을 맞춘 초음파 장치는 세포 용해 및 염색질 전단에서의 개선을 허용하여 조작자 - 유도 된 변이를 제거하고 재현성을 현저히 증가시킵니다. 이 작업은 E2-10HA 16 , 17 이라고 불리는 성숙한 마우스 T 세포주에서 히스톤 단백질의 ChIP을 효율적으로 수행하기위한 프로토콜 ( 그림 1의 개략도)을 설명합니다. T 세포는 보통 용해하기가 어렵고, 염색질의 전단은 비효율적 인 것으로 밝혀졌습니다. 냉각 집중 초음파 장치를 사용하는이 프로토콜에서는 E2-10HA 마우스 T 세포주에 대해 세포 수, 용해 완충액 및 전단 설정이 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 높은 재현성과 합리적인 시간에 ChIP을 수행 할 수있게합니다. 사실, 그것은 requir염색질을 전단하고 전단력의 품질을 평가하고 약 3 일 동안 면역 침전을 수행하고 교차 결합을 역전 시키며 DNA를 정제하는 데 약 2 일이 소요됩니다.

<table><tbody><tr><td>애질런트 고감도 D5000 시약</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 고감도 D5000 스크린 테이프</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 테이프 4200</td><td>애질런트 기술</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA 시스템</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 아디피미데이트(DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 (FMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 용액 인간&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 변형된 Dulbecco's medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>펩톤 프리마톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>페이즈 록 젤 헤비 2&nbsp; mL</td><td>5 프라임</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K 용액(20mg/mL), RNA 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트 (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 어세이 튜브</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA HS 어세이 키트</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase 및 프로테아제-프리 (10&nbsp; mg/mL)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>튜브 AFA 섬유 및 캡</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 t- 세포주에서 chromatin immunoprecipitation (chip)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

시그널링 경로는 히스톤 테일의 번역 후 변형 (PTM), 히스톤 변이체와의 표준 히스톤 교환 및 뉴 클레오 솜 퇴거와 같은 상이한 수준에서 염색질 구조의 조절을 통해 유전자 발현 프로그램을 조절한다. 이러한 조절은 인핸서 (enhancers)로 정의 된 조절 요소에서 염색질 변형 효소를 모집하는 신호 감수성 전사 인자 (signal-sensitive transcription factors, TF)의 결합을 필요로한다. 신호 전달 계통이 enhancer 활동을 조절하는 방법을 이해하려면 TF, 염색질 변형 효소의 결합, 특정 히스톤 마크로 및 히스톤 변이체의 점유에 대한 포괄적 인 분석이 필요합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 분석은 특이 적 항체를 이용하여 특정 단백질 / DNA 복합체를 면역 침전시킨다. 정제 된 DNA의 후속 분석은 항체에 의해 인식되는 단백질에 의해 점유 된 영역을 확인하게한다. 이 작업은 효율적으로 pe성숙 마우스 T 세포주에서 histone 단백질의 rform 칩. 제시된 프로토콜은 합리적인 시간 프레임 및 높은 재현성으로 ChIP 분석의 수행을 가능하게한다.

성숙한 쥐의 T 세포를 ChIP 분석하여 히스톤 3 (H3K4me1)에 대한 리신 4의 모노 메틸화, 히스톤 3 (H3K4me3)에 대한 리신 4의 트리 메틸렌 화, 및 리신 27의 아세틸 화 히스톤 3 (H3K27ac)뿐만 아니라 panH3 칩에 의해 밝혀 뉴 소 솜 점유. 전단 품질은 1.8 % 아가 로즈 겔 ( 그림 2A ) 및 전기 영동 시스템 ( 그림 2B )에 대한 분석에 의해 평가되었습니다. H3K4me1과 H3K4me3은 일반적으로 각각 인핸서 사이트와 프로모터를 식별하는 데 사용됩니다 ( 그림 3A ). 사실, H3K4me3는 발기인 5 , 8 , 14 에서 두드러지게 나타나지만 배타적이지는 않습니다. 활성 증강 인자의 특성은 H3K4me1 및 H3K27ac에 대해 고도로 강화되고 H3K4me3에 대해서는 풍부하게 농후하게된다 (&lt;비활성 패널은 H3K4me3과 H3K27ac의 낮은 수준을 나타내지 만 높은 수준의 H3K4me1을 보였다 ( 그림 3A , 하부 패널). 도 3B 에 나타낸 바와 같이 , 글리세롤 알데히드 3- 인산 탈수소 효소 ( Gapdh ) 유전자는 활성 유전자 프로모터 ( Gapdh 프로모터 )의 분석을 대표한다. 사실, H3K4me3과 H3K27ac의 높은 수준과 H3K4me1의 낮은 수준을 보여줍니다. 도 3b 에서, Deltex1 ( Dtx1 )은 H3K4me1에 대해 고도로 농축되고 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 불충분하게 풍부하므로, 비활성 인핸서 ( Dtx1 인핸서 )를 대표한다. 유전자 사막 은 코딩 유전자가없는 지역의 대표이며, 일반적으로 활성 염색질 표지에 대한 음성 대조군으로 고소됩니다. H3K4me1이 잘 받아 들여지는 인핸서 마크 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 번은 진 사막 에서 풍성하지 않다.이 지역에는 인핸서가 없다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> 그림 1 : 제시된 ChIP 프로토콜의 개략 개요. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> 그림 2 : 성숙한 마우스 T - 세포 라인의 전단 품질 관리. ( A ) 성숙한 마우스 T 세포주 E2-10HA의 2 개의 상이한 분취 량을 전단하고 약 500 ng의 정제 된 DNA를 1.8 % 아가 로스 겔에서 분석하여 이들의 전단을 평가 하였다ing 품질. ( B ) 샘플 2의 정제 DNA 1ng을 전기 영동으로 분석하여 전단 품질을 평가 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> 그림 3 : 인핸서와 프로모터를 특징 짓는 크로마 틱 마크. ( A ) 액티브 인핸서 (상부 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 높은 H3K27ac을 특징으로하는 반면, 비활성 인핸서 (낮은 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 낮은 H3K27ac을 나타낸다. ( B ) 그림 2A 에 제시된 샘플을 함께 모아 ChIP 분석 대 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 히스톤 마크와 히스톤 점유, panH3 칩에 의해 밝혀졌다. 이 분석은 the 프로모터 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh promoter )는 H3K4me3과 H3K27ac에 대해 매우 농축되어 있으며 H3K4me1에 대해서는 풍부하게 농축되어있다. 한편, 비활성 유전자 Deltex1 ( Dtx1 인핸서 )의 인핸서 는 H3K4me1에 대해 고도로 농축되지만 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 풍부하게 농축되지 않는다. panH3 항체를 사용하는 칩을 사용하여 뉴 소솜 점유를 조사 하였다. 유전자 사막 은 음성 대조군으로 사용되었다. 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 버퍼의 이름 </td><td> 시약 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td rowspan="5"> 희석액 완충액 </td><td> 나트륨 도덱(SDS) </td><td> 0.01 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1.1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 16.7 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA 용액 </td><td> 디메틸 아디 피 이미 데이트 (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 인산염 완충 식염수 (PBS) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 용출 완충액 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 고염 버퍼 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아 미넷 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM 매체 </td><td> Iscove의 변형 된 Dulbecco &#39;s medium (IMDM) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 2 % (v / v) </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 펩톤 프리마 존 </td><td> 0.3 mg / mL </td></tr><tr><td> 인간 인슐린 용액 </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> 최소 필수 필수 비 필수 아미노산 (MEM NEAA) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl 염 완충액 </td><td> 리튬 클로라이드 (LiCl) </td><td> 0.25M </td></tr><tr><td> 이 페칼 - CA630 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 저염 버퍼 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 단백질 A 세파 로즈 비드 세척 완충액 </td><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 이 페칼 - CA630 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS 용해 완충액 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민aminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE 완충액 </td><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> 표 1 :이 프로토콜에 사용 된 버퍼 및 매체 목록. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 에 </td><td> 떨어져서 </td></tr><tr><td> 최고 출력 </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 듀티 팩터 </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> 사이클 / 버스트 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 사이클 수 </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>표 2 :이 프로토콜에서 사용 된 전단 설정. 이러한 조건은 성숙한 마우스 T 세포주에 최적화되었습니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 공급자 </td><td> 항체 양 / 면역 침전 량 </td><td> 세포의 양 / 면역 침전 </td><td> 세탁 조건 </td></tr><tr><td> H3 </td><td> 아캄 (ab1791) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> 디아 노 코드 (pAb-174-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 저염 완충액 중 Oce, 고염 완충액 중 두 번, LiCl 염 완충액 중 두 번 및 TE 완충액 중 세 번 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> 변하기 쉬운* </td><td> 변하기 쉬운* </td><td> 변하기 쉬운* </td></tr><tr><td colspan="5"> IgG 컨트롤의 경우, 항체와 세포의 양과 세척 단계는 다른 면역 침전의 조건을 반영해야합니다. </td></tr></tbody></table> 표 3 :이 연구에서 사용 된 항체 및 세척 조건. <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;fo : keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 유전자 </td><td> 정방향 프라이머 </td><td> 리버스 프라이머 </td><td> 조사 </td></tr><tr><td> Gapdh 프로모터 (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTGCAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 인핸서 ( +26kb ) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 진 사막 </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 표 4 :이 연구에서 qPCR에 사용 된 프라이머 및 프로브. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 문제 </td><td> 원인 </td><td> 해결책 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 크로마 틴이 전단되고 파편이 너무 큽니다. </td><td> 너무 많은 셀이 사용되었습니다. </td><td> 세포 수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 전단이 너무 낮습니다. </td><td> 전단 사이클 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 전단 피크 파워, 듀티 팩터 및 / 또는 사이클 / 버스트를 증가시킵니다. </td></tr><tr><td rowspan="3"> 크로마 틴이 절단되어 파편이 너무 작습니다. </td><td> 너무 적은 셀이 사용되었습니다. </td><td> 세포의 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 전단력이 너무 높습니다. </td><td> 전단 사이클 수를 줄입니다. </td></tr><tr><td> 전단 피크 파워, 듀티 팩터 및 / 또는 사이클 / 버스트를 줄입니다. </td></tr><tr><td rowspan="11"> 너무 낮은 복구gG 조절 및 / 또는 음성 대조 (높은 배경). </td><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 적습니다. </td><td> 항체 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 많습니다. </td><td> 항체 양을 줄이십시오. </td></tr><tr><td> 항체는 특이도가 낮습니다. </td><td> 항체를 변경하십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세탁 조건이 너무 엄격합니다. </td><td> 세탁 횟수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td> 세척 버퍼의 엄격 성을 줄입니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세탁 조건은 충분히 엄격하지 않습니다. </td><td> 세탁 횟수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 세척 버퍼의 엄격 성을 증가시킵니다. </td></tr><tr><td> 너무 많은 DNA가 qPCR에 pipetted되었다. </td><td> qPCR에서 pipetted DNA의 양을 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR 조건이 최적이 아닙니다. </td><td> qPCR 조건을 최적화하십시오. </td></tr><tr><td> 주기 수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 입력 샘플의 qPCR 반응에서 제품이나 제품이 너무 낮습니다. </td><td> qPCR에는 충분한 DNA가 피펫 팅되어 있지 않습니다. </td><td> qPCR에서 pipetted DNA의 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR 조건이 최적이 아닙니다. </td><td> qPCR 조건을 최적화하십시오. </td></tr><tr><td> 주기 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 양성 대조군 및 / 또는 panH3 칩에는 신호가 없음. </td><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 적습니다. </td><td> 항체 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 안티몸은 특이성이 낮습니다. </td><td> 항체를 변경하십시오. </td></tr><tr><td> 용출은 차선책입니다. </td><td> 용액에 비드를 유지하기 위해 샘플을 자주 와동시킨다. </td></tr></tbody></table> 표 5 : 문제 해결.

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 마우스 T세포 라인에서 염색질 면역침전법을 효율적으로 수행하여, 적절한 시간 내에 높은 재현성으로 특정 게놈 영역의 히스톤 표지 분포를 연구하는 것입니다. 이 방법은 T세포 분열 또는 활성화 동안 염색질 구조가 어떻게 조절되는지와 같이 T세포에 특히 초점을 맞춘 염색질 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염색질 전단 과정이 효율적이며 재현성이 매우 높다는 점입니다.페놀-클로로포름-이소아밀알코올 단계가 까다로울 수 있어 염색질 전단 조건을 설정하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차 시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Francesca Ferrante가 진행하겠습니다. 첫째 날에는 6웰 플레이트에서 마우스 T-세포를 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.그 다음, 세포를 24 °C에서 약 271 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 30 mL의 IMDM 세포 배양 배지에 다시 현탁한 후, Neubauer chamber를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 2,000만 개의 세포를 분주하여 새로운 50 mL 튜브에 수집합니다. 그런 다음 세포 배양 배지에 formaldehyde를 최종 농도 1%가 되도록 직접 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로 1 M glycine(pH 7.5)을 부피의 1/8만큼 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 24 °C에서 약 271 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그다음 세포 펠렛을 10 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 원심분리를 반복하여 세포를 세척합니다. 1 mL의 PBS로 세포를 한 번 더 세척합니다.원심분리 전 재현탁된 세포를 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 크로마틴 전단(shearing)은 세포 수, 전단 튜브, 장치, 용해 버퍼 및 전단 파라미터에 따라 달라지므로 가장 중요한 단계입니다. 세척 후, 세포 펠렛을 1 milliliter의 SGS lysis buffer에 재현탁하고 얼음 위에서 배양합니다.10분 후, 각 샘플을 초음파 처리 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 명시된 설정에 따라 집중 초음파 분쇄기로 전단 과정을 수행합니다. 전단 처리 후, 샘플을 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.4 °C, 약 18,000 ×g에서 10분간 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 전단 효율 측정을 위해 50 µL를 채취하고, 전단된 용해물을 액체 질소로 급속 냉동합니다. 용해물은 1회 사용량씩 분주하여 -80 °C에서 보관합니다.전단 효율을 결정하기 위해, 먼저 전단된 각 용해물 50 µL에 용출 버퍼 50 µL를 추가합니다. 혼합물을 65 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 둘째 날에, 샘플에 TE 버퍼 100 µL와 10 mg/mL Rnase A 4 µL를 추가합니다.시료를 혼합하고 37 °C에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 다음, 각 시료에 20 mg/mL proteinase K 2 µL를 첨가한 후 55 °C에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 이어서 각 시료를 phenol chloroform isoamyl alcohol 추출에 적합한 젤 튜브로 옮깁니다.제조사의 지침에 따라 튜브를 취급하십시오. 200 µL의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가하고 튜브를 흔들어 섞습니다. 원심분리 후, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.이 과정을 한 번 더 반복합니다. 제조사의 지침에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하되, 멤브레인을 두 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 잔류 에탄올을 증발시키기 위해 튜브를 연 상태로 상온에서 2분 동안 둡니다.용출을 위해, 컬럼에 50 µL의 물을 넣고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 1초 동안 원심 분리하여 막을 적절히 적십니다. 원심 분리로 DNA를 용출시키기 전, 막을 실온에서 1분 동안 배양합니다.제조사의 지침에 따라 고감도 키트를 사용하여 형광 광도계로 정제된 DNA를 정량합니다. 마지막으로 정제된 DNA 약 500 nanograms를 1.8% agarose 겔에서 분석합니다. 또한 정제된 DNA 약 one nanogram을 고감도 키트를 사용하여 전기영동 시스템에서 분석합니다.3일째에, 전단된 용해물을 희석 버퍼 5배 부피로 희석합니다. 저온실에서 회전시키며 밀리리터당 30 µL의 protein A agarose beads를 사용하여 희석된 용해물을 30분 동안 사전 제거(pre-clear)합니다. 샘플을 4 °C에서 약 750 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 정제된 용해물의 10%를 입력 샘플로 수집하여 4 °C에서 보관합니다.다음으로, 투명해진 용해물을 원하는 양만큼 새 튜브에 분주합니다. 그런 다음 각 튜브에 선택한 항체를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 회전 배양합니다. 4일 차에 40 µL의 protein A beads를 첨가합니다.회전시키면서 4°C에서 혼합물을 1시간 동안 배양합니다. 회전시키며 4°C에서 5분 동안 배양하여 1 mL의 저염 버퍼(low salt buffer)로 비즈를 세척합니다. 그 후 4°C에서 약 950 ×g로 3분 동안 원심 분리합니다. 고염 버퍼(high salt buffer), 염화리튬 버퍼(lithium chloride buffer) 및 TE 버퍼로 세척 과정을 반복합니다.그 다음 샘플에 110 µL의 용출 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하며, 2분마다 샘플을 볼텍싱합니다. 다시 원심분리한 후, 상층액 100 µL를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.100 µL의 용출 버퍼로 용출을 반복하고 용출액을 합칩니다. 그동안, 이전에 수집한 입력 시료에 용출 버퍼를 추가하여 최종 부피가 200 µL가 되도록 합니다. 모든 시료를 65 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다.5일 차에, 각 용출액에 200 µL의 TE 버퍼와 8 µL의 10 mg/mL Rnase A를 첨가합니다. 샘플을 혼합한 후 37 °C에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 다음, 각 용출액에 4 µL의 20 mg/mL proteinase K를 첨가하고 55 °C에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 이어서 각 샘플을 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 추출에 적합한 젤 튜브로 옮깁니다.페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 400 µL를 첨가하고 튜브를 흔들어 섞습니다. 튜브를 원심 분리한 후, 상층액을 새 튜브로 옮기고 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 마지막으로, 이전과 동일하게 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제합니다.마우스 T세포주 전단법(shearing)의 이 대표적인 결과는 염색질의 효율적인 단편화를 보여줍니다. 여기에는 마우스 T세포주에서 수행된 대표적인 염색질 면역침강 실험 결과가 제시되어 있습니다. 하우스키핑 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase의 프로모터에서 히스톤 3의 4번 라이신 삼메틸화가 매우 풍부하게 나타납니다.또한 히스톤 3의 라이신 27 아세틸화가 나타납니다. 하지만 히스톤 3의 라이신 4 단일메틸화는 나타나지 않습니다. 반대로, 비활성 유전자인 deltex-1의 인핸서는 히스톤 3의 라이신 4 단일메틸화가 매우 풍부하게 나타납니다.하지만 histone three의 lysine four trimethylation과 histone three의 lysine 27 acetylation은 농축 효율이 낮았습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플을 쉐어링(shearing) 하기 전에 SGS 침전물을 먼저 용해시키는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.우리는 T세포의 유전자 조절을 연구하던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. T세포는 의료 응용 분야와 밀접한 관련이 있으며, 고등 진핵생물의 유전자 발현을 연구하는 데 가장 잘 설명된 모델 시스템 중 하나이기 때문에 선택했습니다. 개발 이후, 이 기술은 염색질 생물학 분야의 연구자들이 포유류 시스템에서 염색질 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 기술의 함의는 T세포 유전자 발현 프로그램의 구축 및 조절을 분석할 수 있게 함으로써 T세포 관련 질환의 치료까지 확장됩니다. 포름알데히드, 페놀 클로로포름, 이소아밀 알코올을 사용하는 작업은 매우 위험하므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 내에서 작업하고 적절한 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 방법은 마우스 T세포의 염색질 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 혈관 내피 세포 및 폐 세포주와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

배우세요 마우스 T-세포주에서 크로마틴 면역침전(ChIP)을 수행하여 히스톤 표지 분포를 연구하는 방법을. 초음파 단편화와 특이 항체를 활용한 이 기법은 면역 세포의 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

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