마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

이 프로토콜의 전반적인 목표는 특정 게놈 영역에서 히스톤 마크의 분포를 연구하기 위해 합리적인 시간 내에 재현성이 높은 마우스 T 세포주에서 염색질 면역침전을 효율적으로 수행하는 것입니다. 이 방법은 T 세포 분열 또는 활성화 중에 염색질 구조가 어떻게 조절되는지와 같은 T 세포에 특히 초점을 맞춘 염색질 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염색질 전단이 효율적이고 재현성이 높다는 것입니다.

페놀-클로로포름 이소아밀 알코올 단계가 까다로울 수 있으므로 염색질 전단 조건을 설정하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Francesca Ferrante입니다. 첫째 날에는 마우스 T 세포를 6웰 플레이트에서 50ml 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 24도에서 약 271회 G로 5분 동안 세포를 원심분리하고, 30ml의 IMDM 세포 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁한 후, Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 2,000만 개의 세포로 구성된 부분 표본을 새로운 50ml 튜브로 수집합니다. 그런 다음 포름알데히드를 1% 최종 농도로 세포 배양 배지에 직접 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로 pH 7.5 몰 글리신 1/8 부피를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 24 섭씨 온도에 5 분 동안 원심 분리에 의하여 세포를 펠릿 만들고 대략 271 시간 G.Then는 인산염에 의하여 완충된 염분의 10 밀리리터에 있는 세포 펠릿을 resuspending 및 분리기분리를 반복해서 세포를 세척합니다. PBS 1ml로 세포를 다시 씻으십시오.

원심분리 전에 재현탁 세포를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 염색질의 전단은 세포, 전단 튜브, 장치 및 용해 완충액의 양과 전단 매개변수에 따라 달라지는 가장 중요한 단계입니다. 세척 후 세포 펠릿을 SGS 용해 완충액 1ml에 재현탁하고 얼음 위에서 배양합니다.

10 분 후 각 샘플을 초음파 처리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 표시된 설정에 따라 집속 초음파를 사용하여 전단을 수행합니다. 전단 후 샘플을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

4 섭씨 온도와 대략 18, 000 시간 G.Then에 10 분 동안 분리기는 새로운 관에 상등액을 옮깁니다. 전단 효율 측정을 위해 50마이크로리터를 수집하고 전단된 용해물을 액체 질소에서 급속 동결합니다. 용해물을 영하 80도의 일회용 부분 표본에 보관하십시오.

전단 효율을 측정하려면 먼저 각 전단 용해물의 50마이크로리터에 50마이크로리터의 용리 완충액을 추가합니다. 혼합물을 섭씨 65도에서 밤새 흔들어 배양합니다. 2일차에 100마이크로리터의 TE 버퍼와 10밀리리터 Rnase A당 10밀리그램의 4마이크로리터를 샘플에 추가합니다.

샘플을 혼합하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 흔들면서 배양합니다. 그런 다음 각 샘플에 20밀리리터 단백질분해효소 K 2마이크로리터를 첨가한 후 섭씨 55도에서 2시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 다음으로, 각 샘플을 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 추출에 적합한 겔 튜브로 옮깁니다.

제조업체의 지침에 따라 튜브를 다루십시오. 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 200마이크로리터를 넣고 튜브를 흔듭니다. 원심분리 후 상부상을 새 튜브로 옮깁니다.

이 과정을 한 번 반복합니다. 멤브레인을 두 번 세척하는 것을 제외하고 제조업체의 지침에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제합니다. 마지막 세척 후 튜브를 실온에서 2분 동안 열어 두어 잔류 에탄올을 증발시킵니다.

용리를 위해 컬럼에 50마이크로리터의 물을 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 1초 동안 돌려 멤브레인을 적절하게 적십니다. 원심분리로 DNA를 용리시키기 전에 실온에서 1분 동안 멤브레인을 배양합니다.

제조업체의 지침에 따라 고감도 키트를 사용하여 형량계에서 정제된 DNA를 정량화합니다. 마지막으로 1.8% 아가로스 겔에서 정제된 DNA의 약 500나노그램을 분석합니다. 및 고감도 키트를 사용하는 전기영동 시스템에서 정제된 DNA의 약 1나노그램을 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 시스템.

3일차에 1부피의 전단 용해물을 5부피의 희석 완충액으로 희석합니다. 단백질 A 아가로스 구슬 밀리리터당 30마이크로리터로 희석된 용해물을 냉장실에서 회전하면서 30분 동안 미리 세척합니다. 대략 750 시간에 5 분 동안 섭씨 4 도에서 표본을 원심 분리기하십시오 G. 입력 표본으로 맑게 한 용해물의 10%를 모으고 4 섭씨에 저장하십시오.

다음으로, 원하는 양의 세척된 용해물을 새 튜브로 분취합니다. 그런 다음 선택한 항체를 각 튜브에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 회전합니다. 4일째에는 단백질 A 비드 40마이크로리터를 추가합니다.

회전하는 동안 섭씨 4도에서 1시간 동안 혼합물을 배양합니다. 1ml의 저염 완충액으로 구슬을 회전하면서 섭씨 4도에서 5분 동안 배양하여 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리하고 약 950회 G.고염 완충액, 염화리튬 완충액 및 TE 완충액으로 세척을 반복합니다.

그런 다음 샘플에 110마이크로리터의 용리 완충액을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하고 2분마다 샘플을 와류로 배양합니다. 다시 원심분리 후 100마이크로리터의 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

100마이크로리터의 용리 완충액으로 용리를 반복하고 용출물을 결합합니다. 그 동안, 이전에 수집된 입력 샘플에 용리 완충액을 추가하여 200마이크로리터의 최종 부피를 달성합니다. 모든 샘플을 섭씨 65도에서 밤새 흔들면서 배양합니다.

5일째에 각 용리액에 200마이크로리터의 TE 완충액을 추가하고 8마이크로리터의 10밀리리터 Rnase A.Mix를 첨가한 후 섭씨 37도에서 2시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 그런 다음 각 용출액에 20mg당 20mg의 단백질 분해 효소 K 4마이크로리터를 첨가한 후 섭씨 55도에서 2시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 다음으로, 각 샘플을 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 추출에 적합한 겔 튜브로 옮깁니다.

페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 400마이크로리터를 넣고 튜브를 흔듭니다. 튜브를 원심분리한 후 상부상을 새 튜브로 옮기고 이 과정을 한 번 반복합니다. 마지막으로 이전과 같이 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제합니다.

마우스 T-세포주 전단의 이러한 대표적인 결과는 염색질의 효율적인 단편화를 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 마우스 T 세포주에서 대표적인 염색질 면역침전 실험입니다. 하우스 유지 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소의 프로모터는 히스톤 3에서 라이신 4의 트리메틸화를 위해 고도로 농축됩니다.

그리고 히스톤 3에 라이신 27의 아세틸화. 그러나 히스톤 3에 라이신 4의 monomethylation를 위해 아닙니다. 반대로, 비활성 유전자 deltex-1의 인핸서는 히스톤 3에서 라이신 4의 단메틸화를 위해 고도로 농축됩니다.

그러나 히스톤 3에 라이신 4의 트리메틸화를 위해 가난하게 풍성하게. 그리고 히스톤 3에 라이신 27의 아세틸화. 이 절차를 시도하는 동안 샘플을 전단하기 전에 SGS 침전물을 분해해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 방법에 대한 아이디어는 유전자 조절 T 세포를 연구할 때 처음 떠올랐습니다. 우리가 T 세포를 선택한 이유는 T 세포가 의료 응용 분야와 매우 관련이 있고 유전자 발현이 더 높은 진핵생물을 연구하기 위해 가장 잘 설명된 모델 시스템 중 하나이기 때문입니다. 개발 후 이 기술은 염색질 생물학 분야의 연구자들이 포유류 시스템의 염색질 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 기술의 의미는 T 세포 유전자 발현 프로그램의 확립 및 조절을 해부할 수 있기 때문에 T 세포 관련 질병의 치료로 확장됩니다. 포름알데히드, 페놀 클로로포름 및 이소아밀릭 알코올로 작업하는 것은 매우 심각하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 아래에서 작업하고 적절한 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 방법은 마우스 T 세포 염색질 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 내피 및 폐 세포주와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.