조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성

이 절차의 전반적인 목표는 분비에 대한 반응으로 von Willebrand 인자 또는 VWF-혈소판 끈 형성을 관찰하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 Von Willebrand 요인 생물학 및 웨이보 완화 신체 병태 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 von Willebrand 인자 방출 및 혈소판 결합 기능을 손상시키는 돌연변이에 대한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이 기술의 주요 장점은 내피하 콜라겐, 내피 세포 VWF 및 혈소판 간의 생체 내 상호 작용을 시각적이고 정량화 가능한 체외 시스템에서 재현한다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요하다고 생각합니다. 여러 동시 조건에서 VWF-혈소판 스트링 형성을 실시간으로 캡처하는 데 필요한 현미경 단계는 텍스트만으로는 마스터하기 어려울 수 있습니다.

0.5ml의 콜라겐 코팅 버퍼를 1ml 루어 잠금 주사기에 로드하는 것으로 시작합니다. 주사기 끝을 플로우 챔버 슬라이드의 저장소에 비틀고 전체 레인이 코팅되고 각 저장소가 가득 찰 때까지 플런저를 천천히 누릅니다. 저수지를 가득 채워 각각이 가득 찼는지 확인하십시오.

모든 레인이 로드되면 챔버를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날 200마이크로리터 피펫을 사용하여 콜라겐 코팅 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 HBSS로 각 레인을 헹구고 200마이크로리터 피펫으로 식염수를 흡인합니다.

HBSS의 세 번째 라운드를 폐기한 후, 100마이크로리터의 성장 배지에 100%FBS를 보충하고 플로우 챔버의 각 레인에 10%FBS를 보충하여 밀리리터당 6번째 혈액 성장 내피 세포에 약 3배 10을 추가합니다. 그런 다음 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터에 24시간 동안 다시 넣고 8시간에서 12시간마다 배지를 교체합니다. 흐름 장치를 조립하려면 먼저 70cm 크기의 멸균 실리콘 튜브 3개 각각의 한쪽 끝에 하나의 수 엘보우 루어 커넥터를 부착합니다.

그리고 각 튜브의 다른 쪽 끝에 하나의 암 루어 잠금 어댑터를 부착합니다. 암 루어 잠금 어댑터를 개별 20ml 주사기에 연결하고 주사기 펌프를 프로그래밍합니다. 주사기를 펌프에 로드하고 주사기와 플런저 주위에 브래킷을 단단히 고정합니다.

그런 다음 3개의 서로 다른 20cm 멸균 실리콘 튜브 조각의 양쪽 끝에 개별 수형 엘보우 루어를 부착하고 무딘 18게이지 바늘을 세 개의 엘보우 루어 중 하나 각각에 연결합니다. 다음으로, 완전 자동화된 스테이지가 장착된 스피닝 디스크 현미경에서 20x 대물렌즈를 선택하고 적절한 채널 설정을 지정합니다. 전체 동적 데이터 범위를 얻으려면 전자 곱셈 전하 결합 장치를 노출 시간이 200밀리초인 전자 곱셈 이득 150으로 설정합니다.

491 나노미터 레이저 출력을 20%로 조정하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 세 레인 모두의 중심을 표시합니다. Z 범위를 1.0마이크로미터로 설정하고 단계 크기를 0.5마이크로미터로 설정합니다. 마지막으로 슬라이드당 60개의 시점으로 10초마다 이미지를 캡처할 기간과 간격을 선택합니다.

VWF-혈소판 스트링의 형성을 유도하기 위해 유동 챔버의 3개 레인에서 배양 배지를 무혈청 배지만 대조군으로 교체한 다음 관심 자극제를 100마이크로리터의 무혈청 배지로 희석하여 추가 레인으로 이동합니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 챔버를 배양합니다. 자극 기간이 끝나면 100-200마이크로리터의 PBS로 3개의 레인을 모두 세척하고 혈관 클립을 사용하여 흐름 챔버를 슬라이드 스탠드에 매핑합니다.

70cm 튜빙 조각의 끝에서 하나의 수 루어 커넥터를 플로우 챔버의 각 저장소에 연결합니다. 그리고 주사기 펌프를 시작하여 PBS 세척을 제거합니다. 레인이 건조되지 않도록 반대쪽 흐름 챔버 저장소에 PBS를 추가로 피펫팅합니다.

등가 유량이 확인되면 주사기 펌프를 일시 중지합니다. 암 루어 잠금 커플러가 있는 5밀리리터 주사기를 첫 번째 무료 수 루어 커넥터에 부착합니다. 그리고 뭉툭한 바늘을 형광 라벨이 붙은 세척된 혈소판 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오.

천천히 튜브를 통해 혈소판 용액을 당겨 시스템 내에 기포가 없는지 확인합니다. 수컷 루어를 흐름 챔버의 열린 저장소에 부착하고 방금 시연한 것처럼 다른 두 레인에 혈소판 용액을 로드합니다. 흐름 시스템 설정을 확인하여 모든 연결이 안전한지 확인합니다.

주사기 펌프를 다시 시작하고 어둠 속에서 10분 동안 혈소판 흐름을 영상화합니다. 그런 다음 흐름 챔버 저장소의 흡기 튜브에서 루어를 분리합니다. 그리고 저장고를 PBS로 채워 내피 세포 단일층 위로 부드러운 식염수 흐름을 유지합니다.

VWF-혈소판 스트링 형성을 정량화하려면 슬라이드 중앙에서 겹치지 않고 각 레인에서 슬라이드당 10개의 이미지를 캡처합니다. 모든 이미지를 얻었으면 이미지 처리 소프트웨어를 열고 이미지를 클릭하고 밝기 대비를 조정합니다. 첫 번째 이미지의 밝기를 조정하려면 부착된 혈소판이 정량화에 충분히 잘 보일 때까지 스크롤 막대를 드래그합니다.

그런 다음 3개 이상의 정렬된 혈소판이 관찰될 때 VWF-혈소판 문자열을 기록하고 이미지의 모든 문자열을 계산합니다. 유동 조건의 시작 후, 처리되지 않은 세포는 히스타민 또는 PMA 처리된 세포에 비해 VWF-혈소판 끈이 매우 적습니다. 시야당 평균 2-3개의 문자열을 나타냅니다.

더욱이, 혈소판과 내피 세포를 활성화하는 히스톤은 치료되지 않은 대조군, 히스타민 또는 PMA 자극 대조군보다 더 많은 VWF-혈소판 끈의 생성을 유도합니다. 이 절차를 시도하는 동안 첫 번째 채혈 튜브를 버리고 모든 시약을 실온에서 유지하고 부드러운 피펫 기술을 사용하여 흐름 실험이 진행될 때까지 혈소판을 정지 상태로 유지합니다. 이 절차를 수정하여 백혈구, 혈소판 활성화제 또는 절단 효소 원자 TS13에 의한 끈 용해의 존재 하에서 VWF-혈소판 끈 형성을 평가할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 분비고그에 의한 VWF-혈소판 끈 형성 및 체외 유동 챔버 모델을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.