Name: 조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 인체외 유동 챔버 시스템을 사용하여 폰 빌레브란트 인자와 혈소판 문자열 형성을 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 염증 자극에 따른 혈전 형성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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앨리슨 Michels 프레더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금에서는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR)의 받는 사람입니다. 로 라 L. Swystun 받는 사람 CIHR 화목입니다. 데이비드 Lillicrap 캐나다 연구의 자에 분자 Hemostasis의 받는 사람입니다. 이 연구는 일부 CIHR 그랜트 (MOP-97849)를 운영 하 여 투자 되었다.

이 연구는 연구 윤리 위원회의 여왕의 대학, 캐나다에 의해 승인 되었다.
1. 내 피 성장 세포 자극
<ol><li>
콜라겐-코트 6 잘 조직 문화 접시.
	<ol>
<li>24 미리, 코트 콜라겐의 1 mL와 함께 37 ° C에서 6 잘 조직 문화 접시 h 버퍼 (50 µ g/mL 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1 0.02 M 빙 초 산으로).</li>
		<li>2 mL의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)로 두 번 웰 스 워시. 참고: 판 수 깡통 호 일에 싸여 있으며 4 ° c.에 밀폐 비닐 봉지에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>내 피 세포 성장 매체 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 2 mL에 잘 당 1 x 106 세포의 조밀도에 씨. 37 ° C (5% CO2)에서 24 h에 대 한 셀을 품 어. 참고: 여기, 혈액 결과 내 피 세포 (BOECs) 구절 5와 15 사이 사용 되었다. BOECs는 스타크 외 에 참조 하는 메서드를 사용 하 여 wildtype VWF 시퀀스와 건강 한 지원자에서 고립 되었다 22 정돈23으로 앞서 설명한 것과 비슷한 방식입니다.</li>
	<li>24 시간 후 매체를 제거 하 고 세척 HBSS 셀.</li>
	<li>혈 청 무료 매체 (FBS 없이 최소한의 필수 성장 매체) 포함 phorbol myristate 12 13-아세테이트의 1 mL을 추가 (PMA; 100 nM), unfractionated 히스톤 (어), 그리고 홍콩 또는 2 h 37 ° C (5% CO2)에 대 한 셀에 HR (25 µ g/mL에서 모두). 참고: 히스톤의이 농도 Xu 그 외 여러분 에 의해 이전에 체 외에서 세포 독성 보고에 근거 했다 24 와 브람스 외. 25 50 µ g/mL를 사용 하는.</li>
	<li>2 시간 후 매체를 수집 하 고 분석까지-20 ° C에서 그것을 저장.</li>
</ol>2. VWF 정량화 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해
<ol><li>버퍼 (10 m m 염기 나트륨 인산 염 및 145 m m 염화 나트륨, pH 7.2) 포함 10 µ g/mL polyclonal 안티-VWF 항 체 4 ° c.에 하룻밤 코팅의 100 µ L와 미 판 코트</li>
	<li>세 번 세척 버퍼의 250 µ L와 접시 세척 (10 m m 염기 나트륨 인산 염, 염화 나트륨 500 m m, 0.1% 트윈 20, pH 7.2).</li>
	<li>1: 2와 1:4 워시 버퍼와 중간 샘플을 희석 하 고 표준 곡선, 1시 10분에서 시작에 대 한 일반적인 참조 플라즈마를 사용 하 여 희석.</li>
	<li>100 µ L 희석된 샘플의 접시와 표준 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>워시 워시 버퍼의 250 µ L로 세 번 접시.</li>
	<li>접시에 HRP 활용 된 탐지 항 체 (1.1 µ g / µ L 워시 버퍼에서) 안티 VWF 희석된의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>접시를 세척 하 고 제조업체의 지침에 따라 O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) 시 약을 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>그래서 1 M H2의 100 µ L 반응 중지4 와 읽기 492에 접시 nm.</li>
</ol>3. 고체 상 히스톤-VWF 바인딩 분석 결과
<ol><li>히스톤 0.5% 나트륨 deoxycholate 50 m m 탄산 버퍼 (pH 9.6) 4 ° c.에 하룻밤 10 µ g/mL에에서 희석 한 microplate 코트</li>
	<li>0.1%를 보충 하는 PBS의 250 µ L로 세 번 접시 세척 트윈 20, 세척 사이 10 분 동안 잠복기.</li>
	<li>200 µ L의 PBS 0.1% Tween 20과 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h에 대 한 보충으로 접시를 차단 합니다.</li>
	<li>3.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>직렬로 플라스마 파생 된 인간의 VWF/요인 VIII 염 분 버퍼에 25 mU/ml 200 mU/mL에서 복잡 한 희석 (염화 나트륨 10 m m 염기 나트륨 인산 염, , 500 m m와 0.1% 트윈 20, pH 7.2). 실 온에서 2 h에 대 한 접시에 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>3.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>PBS-0.1% 트윈 20, 1:1,000 토끼 polyclonal 안티-VWF 항 체 HRP를 실 온에서 1 h에 대 한 활용을 포함 하는 솔루션의 100 µ L를 사용 하 여 고정된 히스톤 VWF의 바인딩을 검색.</li>
	<li>3.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>OPD 시 약의 100 µ L 30 분 동안 접시를 품 어 하 고 그래서 1 M H2의 100 µ L 반응 중지4. 492에서 광학 밀도 측정 nm.</li>
</ol>4. 시드 흐름 챔버에 내 피 세포
<ol><li>1 mL 주사기 Luer 잠금에 콜라겐 코팅 버퍼 (2.1 단계에서 설명) 0.5 mL를 로드 합니다.</li>
	<li>흐름 챔버 슬라이드의 저수지에 주사기 Luer 잠금 끝을 트위스트.</li>
	<li>전체 레인 코팅 및 각 저수지가 가득 때까지 플런저를 천천히 누릅니다. 각 레인에 대 한 반복 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서 챔버를 품 어.</li>
	<li>콜라겐 코팅 버퍼 200 μ 피펫은와 발음 1 mL HBSS와 다른 주사기를 로드 하 고 천천히 흐름 챔버의 각 레인을 세척 하는 플런저를 누릅니다. 흐름 챔버의 반대 끝에 200 μ 피 펫 세척 발음 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>10% 성장 매체에 3 x 106 셀/mL 내 피 세포 (BOEC) 솔루션의 약 100 µ L 플라스틱 FBS 흐름 챔버의 차선으로. 참고: 내 피 세포의 시드 밀도 챔버의 용량을 초과합니다. 이 최대한 채널 적용; 비 부착 한 세포는 연속적인 세척 단계에서 제거 됩니다.</li>
	<li>품 어 24 h. 변경에 대 한 37 ° C에서 챔버 매체 (4.4 단계) 에서처럼 Luer 잠금 주사기를 사용 하 여 모든 8-12 h. 차선에서 볼 수 없는 거품 인지 확인 합니다.</li>
</ol>5. 인간의 전체 혈액에서 혈소판을 분리
<ol><li>생물 안전 캐비닛 30g 바늘, 무 첨가 3 mL 혈액 컬렉션 vacutainer를 산 시트르산 포도 당 버퍼 (85mm trisodium 시트르산, 111 m m D-포도 당, 그리고 71 m m 구 연산 산 성, pH 4.5)의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>베르나르도 외26의해 비슷한 프로토콜 다음 venipuncture 3 ml (3 관), 여 (7 일 동안 항 혈소판 및 비 스테로이드 성 항 염증 약물에서 무료) 건강 한 지원자에서 전체 혈액 수집 합니다.</li>
	<li>초기 조직 손상에서 venipuncture와 관련 된 자발적인 혈소판 활성화를 발생할 수 있습니다 첫 번째 튜브를 삭제 합니다.</li>
	<li>부드럽게 반전 하는 vacutainers 세 번 혈액 응고 제와 혼합.</li>
	<li>24 ° C (실내 온도)에서 15 분 동안 150 x g에서 vacutainers 원심</li>
	<li>천천히 생물 안전 캐비닛에 피 펫과 혈소판이 풍부한 혈장 (표면에 뜨는)를 제거 하 고 신중 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 그것을 전송. 잠재적인 크로스-활성화를 피하기 위해 단일 원뿔 관에 각 vacutainer의 혈소판이 풍부한 볼륨을 전송 합니다. 참고: 혈소판 격리 생물학 안전 장은 세균 오염 및 잠재적인 인공 혈소판 및 내 피 활성화를 방지 하기 위해 수행 되어야 한다.</li>
	<li>900 x g 작은 공의 혈소판에 24 ° C (실내 온도)에서 10 분에 원뿔 튜브 원심</li>
	<li>플라스틱 및 혈소판 가난한 상쾌한 삭제.</li>
	<li>시트르산 포도 당 나트륨 (CGS) 버퍼 (13 m m 나트륨 구 연산 염, 30 mM D-포도 당, 및 120 m m 염화 나트륨, pH 7.0)의 1 mL와 함께 신중 하 게 펠 릿을 세척. 참고:는 혈소판에에서 나타납니다 wisp 모양의 형성 때 CGS 버퍼 추가 되 고 펠 릿 부드럽게 resuspended. 혈소판 활성화에 의해 오염 된 샘플에는 혈소판 쉽게 resuspend 하지 않습니다 고 clumpy 표시 됩니다.</li>
	<li>일단 완벽 하 게 resuspended, 원심에서 24 ° C (실내 온도)에서 10 분 동안 900 x g 샘플.</li>
	<li>CGS 워시 버퍼를 제거 하 고 Tyrode의 버퍼 (138 m m 염화 나트륨, 5.5 m m D-포도 당, 12 m m 탄산, 2.9 m m 염화 칼륨, 그리고 0.36 m m 염기 나트륨 인산 염, pH 7.4) 3 mL에 펠 릿을 resuspend. 혈소판의 완전 한 물의 resuspension를 확인 하 고, 집계, 관찰 하는 경우 삭제 샘플.</li>
	<li>20 mM DiOC6 재고 솔루션 (디졸브 57.25 mg에 메탄올의 5 mL)에서 각 3 mL 원뿔 튜브 1 µ M의 최종 농도 대 한 세척된 혈소판의 1.5 µ L를 추가 합니다. 참고: DIOC6 라벨 혈소판이이 실험에 사용 되는 녹색 형광 미토 콘 드 리아 염료 이다.</li>
	<li>3 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 씻어 혈소판 솔루션의 aliquot 1 mL. 참고:이 실험에 필요한 혈소판 볼륨은 기준으로 계산 흐름 챔버 크기, 원하는 전단 응력 실험 (단계 6.5)의 길이에. 이 프로토콜은 조건이 유체 흐름에 대 한 충분 한 볼륨을 변경 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>격리의 2 h 이내 씻어 혈소판을 사용 합니다.</li>
</ol>6. 흐름 장치 어셈블리
<ol><li>메 마른 실리콘 한쪽 끝에 남성 팔꿈치 Luer 연결관 및 다른 여성 Luer 잠금 어댑터 (실내 직경 1.6 m m의) 튜브 70 c m 조각을 연결 합니다.</li>
	<li>20 mL 주사기에 튜브에 부착 된 여성 Luer 잠금 어댑터를 연결 합니다.</li>
	<li>6.1 및 6.2 3 동일한 주사기 튜브 연결을 생성 하는 두 번 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>
주사기 펌프를 사용 하 여 유체 흐름을 생성. 주사기 펌프에 다음과 같은 설정을 입력: 주사기와 흐름 속도의 실내 직경. 참고: 20 mL 주사기는 19.55 m m 내부 직경. 흐름 속도 원하는 전단 속도/전단 응력 및 흐름 챔버의 크기에 따라 계산 됩니다. 1 dyn/cm2 (에서 관찰 된 낮은 정 맥 전단), 달성 하기 위해 현재 연구에 사용 된 흐름 챔버 9.37 µ L/min의 유량이 필요 합니다. 히스톤을 연결 하는 정 맥 혈전 증으로 증거 때문에 4.45 dyn/cm2 의 중간 정 맥 전단 선택 됩니다. 이것은 또한 가정에 기초는 버퍼 물에 비슷한 점도 있다. 유량 계산 하는 다양 한 흐름 챔버 크기의 유량에서 찾을 수 있습니다 하는 데 사용 하는 41.7 µ L/분 방정식 다음입니다.<ol>
<li>펌프 주사기 펌프에 단추 옵션을 사용 하 여 액체를 철회를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 주사기 주사기 펌프에 튜브에 부착 된 로드 하 고 단단히 주사기와 plungers 브래킷을.</li>
	<li>남성 팔꿈치 Luer 살 균 실리콘 튜브의 두 번째 20 cm 조각의 양쪽 끝에 연결 합니다.</li>
	<li>무딘된 18 게이지 바늘을 한 팔꿈치 루어를 연결 합니다.</li>
	<li>흐름 챔버의 3 개의 차선에 대 한 3 개의 동일한 흡입 시스템을 만드는 두 번 반복 합니다. 참고: 실리콘 튜브와 손잡이 10% 표 백제 뒤에 다시 사용 하기 전에 증류수로 세척 될 수 있다. 흐름 챔버를 다시 사용 하는 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>7. 현미경 설정
<ol><li>회전 디스크 현미경을 갖춘 완전 자동화 된 단계를 사용 합니다. 405, 458, 491, 543, 633 nm 레이저 라인을 제공 하는 레이저 출시와 함께 조명을 수행 합니다. 20 X 목적으로 모든 이미지를 캡처하십시오. 분석 소프트웨어 (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf)의 모든 매개 변수를 조정 합니다.</li>
	<li>채널 설정 (배출 필터: 520/35), 491에 여기 nm, 수집에 대 한. 전체 동적 데이터 범위를 얻기 위해 전 하 결합 소자는 전자 멀티 이득의 150, 200 ms의 노출 시간을 곱한 전자를 설정 합니다. 참고: 혈소판 녹색 형광 염료, DiOC6, 파장 맥시 마와 함께 표시 됩니다 (여기, 482 nm; 방출, 504 nm).</li>
	<li>491 nm 레이저 전력 20%로 조정 합니다.</li>
	<li>모든 3 레인의 센터를 표시 하 고 z 범위 1 μ m와 0.5 μ m 단계 크기를 선택 합니다. 모든 10 시간 점 (즉, 기간)의 수와 이미지 캡처 이미지 (즉, 간격) 사이의 시간을 선택 s; 슬라이드 당 "60 시간 점"을 선택 합니다. 3 차선에서 이미지를 캡처하고 지정 된 실험 폴더에 저장을 현미경을 설정 합니다. 참고: 흐름 챔버 3 차선 있기 때문에, 현미경 이미지를 캡처 3 위치 사이 전환 하려면 필요 합니다.</li>
</ol>8. VWF 혈소판 문자열 형성
<ol><li>(4 단계)에서 흐름 상공에서 문화 매체를 제거 단계 4.4 에서처럼 동일한 기술을 사용 하 여.</li>
	<li>중 히 스타 민 (25 µ M), PMA의 100 µ L를 추가 (100 nM), 어, 홍콩, 또는 실 온 및 주변 O2/CO2에서 15 분 동안 BOEC 단층을 자극 (1.4 단계)에서 혈 청 자유로운 매체에 희석 (25 µ g/mL에서 모두) 인사. 참고: 비록 VWF 릴리스에 대 한 필요 하지 않습니다, 37 ° C에서이 자극 수행 향상 됩니다 VWF exocytosis27.</li>
	<li>셋 중 하나를 확인 흐름 챔버의 별도 차선 유지 실험 컨트롤로 치료.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 매체를 제거 하 고 씻어 내 피 단층의 secretagogues PBS의 100-200 µ L로 대체.</li>
	<li>장소에 챔버를 확보 하기 위해 혈관 클립을 사용 하 여 슬라이드 스탠드에 흐름 챔버를 탑재 합니다.</li>
	<li>흐름 챔버의 저수지에 70 cm 튜브 (주사기에 연결)의 끝에 사용할 수 있는 남성 Luer 커넥터를 연결 합니다. 두 개의 다른 흐름 챔버 레인에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>주사기 펌프 PBS 세척 제거를 시작 합니다. 피 펫 레인 건조 실행 할 수 있도록 반대 흐름 챔버 저수지로 추가 PBS</li>
	<li>모든 3 개의 차선에 걸쳐 해당 흐름에 대 한 흐름 시스템을 확인 하 고 주사기 펌프를 일시 중지.</li>
	<li>에 대 한 실험 사이 대략 동일한 지역에서 각 레인의 중간에 이미지를 캡처하는 영역을 선택 합니다. 참고: 현미경을 운영 하는 사람 실험 조건에 멀게 될 수 있다. 이 단계를 수행 하면 현미경은 혈소판 흐름 전에 초점을 맞추고 (7 단계 참조).</li>
	<li>여성 luer 커플러를 연결<a> </a>5 mL 주사기 그리고 무료 남성 luer 커넥터 (단계 6.8) 잠수함 무딘된 바늘 1.5 mL microcentrifuge 튜브 세척된 혈소판 솔루션 (5.13 단계)를 포함 하 고. 천천히 그릴 시스템 내에서 아무 공기 방울을 보장 하기 위해 튜브를 통해 혈소판 솔루션.</li>
	<li>5 mL 주사기를 제거 하 고 남성 Luer 흐름 챔버의 오픈이 저수지에 연결. 3 개의 차선에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 다시 시작 하 고 어둠 속에서 10 분에 대 한 단계 7에서에서 현미경 및 프로토콜 설정을 사용 하 여 혈소판 흐름 중 이미지를 캡처하십시오.</li>
	<li>10 분 후 흐름 챔버 저수지에 섭취 튜브에서는 루어를 분리 하 고 내 피 단층을 통해 흐름을 유지 하기 위해 PBS 저수지를 채울.</li>
</ol>9. VWF 혈소판 문자열 정량화
참고: PBS의 지속적인 흐름 이미지 분석을 위한 VWF 혈소판 문자열 연신 율을 유지 하기 위해 필요 합니다. 흐름의 정지 되는 구형 VWF에 되며 VWF 혈소판 문자열 정량화에 악영향을 줄 것 이다. 그것은 이미지 캡처 동안 PBS 가진 각 저수지를 가기로 필수적 이다. HBSS 셀 축소 또는 초연이이 단계 동안 관찰 되는 경우 PBS를 바꿀 수 있습니다.
<ol><li>첫 번째 레인로 시작 하는 슬라이드의 중간에 주위 20 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 중복 없이 슬라이드 당 10 이미지를 캡처합니다. 각 레인에 대 한 반복이. 참고: 저수지 주변 지역 난 류 전단 응력 때문에 피해 야 한다.</li>
	<li>"이미지," "조정," 및 "밝기/대비."를 클릭 하 여 밝기를 조정 하는 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 준수 혈소판 정량화 충분히 볼 수 있습니다 때까지 스크롤 막대를 끕니다.</li>
	<li>때 3 개 이상의 정렬 된 혈소판 이미지에는 VWF 혈소판 문자열을 기록 합니다. 이미지의 모든 VWF 혈소판 문자열을 계산 합니다. 모든 10 이미지에 대 한 반복 하 고 실험에 대 한 평균. 참고:는 정량화를 수행 하는 사람 실험 조건에 멀게 될 수 있다. 이것은 독립적인 연구8,,2829에 의해 확인 된 대로, VWF에 대 한 공동 얼룩 필요는 없습니다.</li>
	<li>최소한 각 간접적인 평가를 세 번의 실험을 반복 합니다.</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

VWF 혈소판의 생리 적인 관련성 VWF 고착 효소 ADAMTS13의 그들의 급속 한 해체로 인해 논란이 남아 문자열, 그들은 사이트에서 VWF에 의해 혈소판 모집의 정량 생체 외에서 모델 역 히스톤 레벨5에 증가 지역화는 혈전의 존재 양식을 수 있습니다. 또한, 병 리 thrombotic thrombocytopenic 혈관 (TTP)으로-또는 염증 성 microenvironments-ADAMTS13 활동 같은 부족에 ADAMTS13 활동 저해 VWF 혈소판 문자열32 vivo에서관찰 될 수 있다 고 수 있습니다 혈소판 microaggregation 및 백혈구 넘쳐 흐름, 연결 하는 VWF33의 hemostatic 및 proinflammatory 기능에 기여 한다. 마지막으로, 가설 되어 있다 그 VWF 혈소판 문자열 형성 정 맥 또는 동맥 혈전 증, 형성 하는 병 적인...

혈전 증 사망률 전세계1 의 주요 원인이 되 고 응답 todysregulated 혈소판 활성화 및 트 롬 빈 세대에 모두 veinsand 동맥에서 개발할 수 있습니다. VWF의 플라스마 수준 혈액 응고의 키 레 귤 레이 터, 그것에 의하여 낮은 수준 (< 50%)로 알려진 폰 Willebrand 질병 (VWD)2 그리고 상부 출혈 장애 발생 (> 150%) 정 맥3 의 위험 증가와 관련 된 고 4 동맥 혈전 증입니다.
VWF는 없으며 및 내 피 세포에 의해 합성 및 혈소판 α과 립 및 WPBs에 각각 저장 multimeric 당단백질 이다. Hemostatic 도전 시 VWF 순환 혈소판 활성화 된 내 피 세포5 또는6의 배 벽 노출 된 콜라겐을 밧줄로 내 피 WPBs에서 발표 될 수 있습니다. 내 피 세포에 VWF의 앵커 P selectin7 그리고 integrin αvβ38에 의해 중재에 표시 되었습니다. 혈소판 알파과 립 점포의 후속 릴리스 더욱 혈소판 혈소판 혈소판 플러그 형성, 응고 캐스케이드 및 섬유 소의 전파에 필요한 비 계에 대 한 상호 작용을 안정 된 VWF 농도 높일 수 있습니다. 증 착입니다. VWF의 혈소판 바인딩 활동 큰 hemostatic 활동9,10를 가진 높은 분자 무게 multimers와 그것의 multimeric 구조에 의해 통제 된다. 혈액 순환, VWF 또한 행위로 VIII 응고 인자에 대 한 캐리어.
유체 전단 응력 VWF 생리학의 필수 레 귤 레이 터 이다. 전단 응력의 부재, VWF 혈소판 당단백질 Ib 접착11에 대 한 바인딩 도메인 은폐 구형 형태로 존재 합니다. 전단 응력은 존재, metalloprotease, disintegrin 및 thrombospondin 모티브 (ADAMTS13), metalloprotease에 대 한 분열 사이트 노출 됩니다. ADAMTS13의 hemostatic 활동12줄일 적나라 하 고 혈소판 장식 VWF 문자열 multimer 크기 조절을 앞.
VWF 이라면 급성 상 단백질, 그리고 수많은 자극, hypoxia13, 감염14및 proinflammatory cytokines를 포함 하 여 내 피 세포에서 VWF 릴리스를 중재에 표시 되었습니다. 다른 비슷한 염증 성 에이전트, extracellular 히스톤 또한 표시 되었습니다 조직의 VWF 릴리스 마우스15,16 와 혈소판 생체 외에서17,18, 의 활성화를 유도 하 19.이 리에 차이점으로 히스톤 하위에 종속 되도록 표시 했다 및 아르기닌 콘텐츠 기능15에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 연구 목표로 설정 흐름 챔버 리-리치 (홍콩)의 영향을 조사 하 모델과 아르기닌이 풍부한 (HR) 히스톤 하위 및 내 피 VWF 릴리스 및 실시간 혈소판에 secretagogues에 잠재적인 초기 이벤트 캡처 염증 유발 혈전 증
이 흐름 챔버 방법론 생체 외에서 시스템에 시각, 재현성, 고 정량에 vivo에서 상호 subendothelial 콜라겐, 내 피 세포, VWF, 및 혈소판이. VWF 혈소판 상호 작용, WPB 분 비, 혈소판 활성화, VWF 베이스 등을 조절 하는 통로의 모든 측면의 실시간 평가 대 한 수 있습니다. 제어 전단 응력 조건 하에서 VWF의 연구 VWF 릴리스 및 혈소판 바인딩 함수20, WPB 생리학21, VWF 분열 손상 VWD 돌연변이 평가 하 ADAMTS135에 의해 사용 되었습니다. 계량 한 염증 성 자극의 결과로 VWF 혈소판 문자열 형성이이 방법론 사용: extracellular 히스톤.

<table><tbody><tr><td>송아지-흉선 미분획 히스톤(UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>혈청 환원 배지에서 재구성(5mg/mL)</td></tr><tr><td>송아지-흉선 라이신이 풍부한 히스톤(HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>혈청 환원 배지에서 재구성(5mg/mL)</td></tr><tr><td>종아리-흉선 아르기닌이 풍부한 히스톤(HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>혈청 환원 배지에서 재구성(5mg/mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>DMSO (20 mM)</td></tr>에서 재구성히<tr><td>스타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>물에서 재구성 (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>메탄올 (20 mM)</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-VWF 코팅 항체</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>VWF ELISA용</td></tr><tr><td>토끼 Anti-VWF 검출 항체, HRP conjugated</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>VWF ELISA 및 histone-VWF 결합 분석</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>Histone-VWF 결합 분석용</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>VWF ELISA용</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>플라즈마 유래 human von Willebrand factor/factor VIII complex</td></tr><tr><td>Normal Reference Plasma</td><td>Precision BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>VWF ELISA 표준 곡선</td></tr><tr><td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>ThermoFisher Scientific을 통해 구할 수 있는 동급 제품 (카탈로그 번호: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>배양 및 초기용 BOEC</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td>의 파종<td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rat-tail Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>For endothelial cell stimulations</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 혈액 채취 튜브, 무첨가</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>이 제품은 단종되었습니다. &micro;-Slide VI 0.1 (#80661) 또는 0.4 (# 80601)를 사용하고 4.45 dyn/cm2의 전단 응력을 유지하는 데 필요한 유속 및 혈소판 부피를 다시 계산하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 1.6 mm ID: 5 m, 멸균된</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 커넥터 암: 천연 폴리프로필렌, 멸균된</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>엘보우 Luer 커넥터 수: 흰색 폴리프로필렌, 멸균된</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>무딘 18G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 회전 디스크 현미경</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

조사 폰 willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 willebrand 요인-혈소판 문자열 형성

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

폰 Willebrand 인자 (VWF) multimeric 당단백질 응고 요소를 혈소판 접착 력 및 내 피 손상의 사이트에서 집계 하는 중재 하 고 그 순환에 VIII 인자 이다. VWF 내 피 세포에 의해 합성 플라즈마에 constitutively 발표 하거나 또는 hemostatic 도전 하 응답에 온 디맨드 출시 Weibel Palade 시체 (WPBs) 라는 특수 세포에 저장 됩니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극 WPB exocytosis, VWF 출시에 급속 하 게 유도할 수 있다. 대부분 내 피 세포에 의해 풀어 놓인 VWF의 플라즈마;에서 순환 그러나, VWF의 비율 내 피 세포 표면에 고정은 됩니다. 생리 전단의 조건 하에서 내 피 고정 VWF 혈전 형성의 nidus 나타내는 VWF 혈소판 문자열을 형성, 혈소판에 바인딩할 수 있습니다. 시각적으로 재현 하 고 중재 하는 VWF 혈전 형성의 이상에 관련 된 방식으로 캡처 후속 혈소판 및 내 피 세포에서 VWF의 릴리스를 관찰 하는 흐름 챔버 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 내 피 세포는 교양 흐름 챔버에 고 이후에 WPB exocytosis 유도 하 secretagogues와 자극. 씻어 혈소판은 다음 활성화 endothelium에 끼얹는다. 혈소판 활성화 되 고 이후에 유체 흐름의 방향으로 길쭉한 VWF 문자열에 바인딩합니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극으로 extracellular 히스톤을 사용 하 여, 히스톤 치료 내 피 세포 치료 내 피 세포에 비해 증가 VWF 혈소판 문자열 형성을 관찰 합니다. 이 프로토콜 모델의 혈전 증 및 hemostasis 상호 작용 VWF 혈소판의 활성화의 양적, 시각, 그리고 실시간 평가 설명합니다.

직접 내 피 세포에서 VWF 석방에 히스톤의 효과 평가, 우리 2 h 혈 청 무료 중간 포함 PMA (긍정적인 통제), 어, 시간, 및 홍콩에 confluent BOECs 노출. 우리는 홍콩 VWF 단백질 (VWF:Ag) 치료 내 피 세포 (그림 1)의 중간에 2-fold 증가 유도 보였다. 흥미롭게도, BOECs 어와 HR 자극 했다 때 거기 VWF:Ag 덜 발견 되었다 치료 조건에 보다 매체에. 우리는 히스톤 VWF30에 직접 바인딩할 수 있습니다, 때문에 그들은 차동 문화 매체에서 VWF:Ag 검색 방해할 수 가설. VWF 히스톤 바인딩을 평가, 우리는 고체 상 바인딩 분석 결과 사용 합니다. 우리는 어 및 HR VWF 홍콩 (그림 2) 보다 더 강력 하 게 바인딩된 지원 탐지 간섭 <strong class="xfig...

이 문서에서 설명 하는 내 피 폰 Willebrand 평가 하는 방법 요소 릴리스 및 다음 혈소판 유체 전단 응력은 생체 외에서 흐름 챔버 시스템을 사용 하 여 염증 성 자극에 대 한 응답에서에서 캡처.

조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 분비 촉진제에 반응하여 형성되는 von Willebrand factor 또는 VWF-혈소판 스트링(string) 형성을 관찰하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 von Willebrand factor 생물학과 혈관 완화 신체 병태생리학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 von Willebrand factor 방출 및 혈소판 결합 기능을 손상시키는 돌연변이에 관한 질문을 해결하는 데 도움을 줍니다.이 기술의 주요 장점은 내피하 콜라겐, 내피 세포 VWF 및 혈소판 사이의 생체 내(in-vivo) 상호작용을 시각화 및 정량화가 가능한 생체 외(in-vitro) 시스템으로 재현한다는 점입니다. 저는 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요하다고 생각합니다. 여러 조건에서 실시간으로 VWF-혈소판 스트링 형성 과정을 캡처하는 데 필요한 현미경 조작 단계는 텍스트만으로는 숙달하기 어려울 수 있습니다.먼저 1 mL 루어 락 시린지에 콜라겐 코팅 버퍼 0.5 mL를 채웁니다. 시린지 끝을 플로우 챔버 슬라이드의 저장조에 돌려 끼운 다음, 전체 레인이 코팅되고 각 저장조가 가득 찰 때까지 플런저를 천천히 누릅니다. 각 저장조가 완전히 채워졌는지 확인하며 부족한 부분을 보충합니다.모든 레인의 로딩이 완료되면, 챔버를 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 200 µL 피펫을 사용하여 콜라겐 코팅 버퍼를 제거합니다. 그 후 각 레인을 HBSS로 헹구고, 200 µL 피펫으로 식염수를 흡입하여 제거합니다.세 번째 HBSS 세척액을 제거한 후, 10% FBS가 첨가된 성장 배지 100 µL에 1 mL당 약 3 × 10⁶개의 혈액 유래 내피세포(Blood Outgrowth Endothelial Cells)를 현탁하여 유체 챔버의 각 레인에 첨가합니다. 그 다음 챔버를 37 °C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하며, 8~12시간마다 배지를 교체합니다. 유체 장치를 조립하려면, 먼저 70 cm 길이의 멸균 실리콘 튜브 3개의 각 끝단에 수컷 엘보 루어 커넥터(male elbow luer connector)를 하나씩 연결합니다.그리고 각 튜브의 반대쪽 끝에 암형 루어 락 어댑터를 하나씩 부착합니다. 암형 루어 락 어댑터를 각각의 20 milliliter 시린지에 연결하고 시린지 펌프를 설정합니다. 시린지를 펌프에 장착하고, 시린지와 플런저 주변의 브래킷을 단단히 고정합니다.그 다음, 20cm 길이의 멸균 실리콘 튜브 3개 각각의 양 끝에 개별 수형 엘보우 루어(male elbow luers)를 부착하고, 3개의 엘보우 루어 중 하나씩에 끝이 뭉툭한 18 gauge 바늘을 연결합니다. 다음으로, 완전 자동화 스테이지가 장착된 스피닝 디스크 현미경에서 20x 대물렌즈를 선택하고 적절한 채널 설정을 지정합니다. 전체 동적 데이터 범위를 얻으려면, 전자 증배 전하결합소자(electron multiplying charge coupled device)의 전자 증배 이득을 150으로, 노출 시간을 200 milliseconds로 설정합니다.491 nano-meter 레이저 출력을 20%로 조정하고, 현미경 소프트웨어를 사용하여 세 개 레인의 중심을 모두 표시합니다. Z-범위는 1.0 micrometers로, 단계 크기(step size)는 0.5 micrometers로 설정합니다. 마지막으로, 슬라이드당 60개 시점에서 10초마다 이미지를 캡처하도록 지속 시간과 간격을 선택합니다.VWF-혈소판 스트링 형성을 유도하기 위해, 유동 챔버의 3개 레인 중 하나는 대조군으로 무혈청 배지만으로 배양액을 교체하고, 나머지 레인에는 100 µL의 무혈청 배지에 희석한 관심 자극제를 넣습니다. 그 후 챔버를 상온에서 15분 동안 배양합니다. 자극 기간이 끝나면 세 레인을 모두 100~200 µL의 PBS로 세척하고, 혈관 클립을 사용하여 유동 챔버를 슬라이드 스탠드에 고정합니다.70 cm 튜브 끝에 달린 수컷 루어 커넥터를 유동 챔버의 각 리저버에 연결합니다. 그리고 시린지 펌프를 작동시켜 PBS 세척액을 제거합니다. 레인이 마르지 않도록 반대편 유동 챔버 리저버에 PBS를 추가로 피펫팅합니다.동일한 유량이 확인되면 시린지 펌프를 일시 정지하십시오. 암형 루어 락 커플러가 달린 5 millileter 시린지를 첫 번째 빈 수형 루어 커넥터에 연결하십시오. 그런 다음 끝이 뭉툭한 바늘을 형광 표지된 세척 혈소판 용액이 들어 있는 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오.시스템 내에 기포가 생기지 않도록 혈소판 용액을 튜브를 통해 천천히 끌어당깁니다. 유동 챔버의 개방된 리저버에 수루락(male luer) 커넥터를 연결하고, 방금 시연한 것과 같이 나머지 두 레인에도 혈소판 용액을 채웁니다. 모든 연결 부위가 확실하게 고정되었는지 유동 시스템 설정을 확인합니다.시린지 펌프를 다시 작동시키고 암실에서 10분 동안 혈소판 흐름을 이미징합니다. 그 다음 flow chamber 리저버의 흡입 튜빙에서 루어(luer)를 분리합니다. 그리고 리저버를 PBS로 채워 내피세포 단층 위로 완만한 식염수 흐름이 유지되도록 합니다.VWF-혈소판 스트링 형성을 정량화하려면, 슬라이드 중앙부터 겹치지 않게 각 레인당 슬라이드당 10장의 이미지를 캡처하십시오. 모든 이미지를 획득한 후, 이미지 처리 소프트웨어를 열고 이미지, 조정, 밝기 대비를 클릭하십시오. 첫 번째 이미지의 밝기를 조정하려면, 부착된 혈소판이 정량화가 가능할 정도로 충분히 잘 보일 때까지 스크롤 바를 드래그하십시오.그 다음, 정렬된 혈소판이 3개 이상 관찰될 때 VWF-혈소판 스트링(string)으로 기록하고, 이미지 내의 모든 스트링 수를 측정합니다. 유동 조건이 시작된 후, 처리되지 않은 세포는 히스타민 또는 PMA 처리된 세포에 비해 VWF-혈소판 스트링이 거의 나타나지 않습니다. 처리된 세포의 경우 시야당 평균 2~3개의 스트링이 관찰됩니다.또한, 혈소판과 혈관 내피 세포를 모두 활성화하는 히스톤은 처리하지 않은 대조군이나 히스타민 또는 PMA 자극 대조군보다 더 많은 VWF-혈소판 스트링(string) 생성을 유도합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 첫 번째 혈액 채취 튜브를 폐기하고, 모든 시약을 실온으로 유지하며, 부드러운 피펫팅 기술을 사용하여 유동 실험 전까지 혈소판이 정지 상태를 유지하도록 하십시오. 백혈구 또는 혈소판 활성화제의 존재 하에서 VWF-혈소판 스트링 형성을 평가하거나, 절단 효소인 atom TS13에 의한 스트링 용해를 평가하기 위해 이 절차를 수정하여 적용할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 분비 촉진제(secretogogue)로 유도된 VWF-혈소판 스트링(string) 형성 및 인비트로(in-vitro) 유동 챔버 모델을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

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이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

혈류 하의 혈소판 기능을 평가하고 시뮬레이션된 지혈 소생술을 외상 및 수혈 의학에 응용하는 미세유체 장치를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

이 글은 전혈 유동 세포분석을 이용해 조직인자(TF) 양성 혈소판의 비율을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질을 평가하여: (1) 휴식 상태에서 세포 내 분포, (2) 휴식 상태와 활성화 상태 모두에서 검사합니다. 또한 혈소판 풍부 혈장 내 TF 양성 혈소판 평가에 대한 지침도 제공됩니다.

인간 혈소판에서 조직 인자 발현의 유동세포분석(flow cytometry analysis)

이 연구는 전단 응력을 이용해 혈전 형성을 유도하고, 여러 차원의 판독을 통해 혈전을 특성화하는 마이크로유체 분석법을 설명합니다. 이 검사법은 혈액 샘플의 혈전형성 경향을 측정할 수 있어 질병 진단, 신약 개발, 혈전증과 관련된 기전적 연구에도 유용합니다.

혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

학습하세요 인체외 유동 챔버 시스템을 사용하여 폰 빌레브란트 인자와 혈소판 문자열 형성을 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 염증 자극에 따른 혈전 형성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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