레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 백혈병 바이러스(murine leukemia virus) 유래 레트로바이러스 벡터의 통합 부위를 매핑하여 세포 특이적 조절 영역을 정의하는 것입니다. 이 방법은 벡터가 인간 게놈의 어디에 통합되는지, 그리고 어떤 조절 요소가 특정 아형을 통해 활발하게 이용될 수 있는지와 같은 유전자 치료 및 유전자 조절 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 유전자 치료 연구에서 MLV 벡터가 활성 아형 특이적 프로모터와 인핸서에 통합된다는 점을 관찰함으로써 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.

먼저 EGFP 리포터 유전자를 포함하며 VSV-G 또는 amphrotopic 엔벨로프 당단백질로 슈도타이핑된 MLV 유래 레트로바이러스 벡터를 표적 세포에 형질도입합니다. 모의 형질도입(Mock transduction)된 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 형질도입 48시간 후, 샘플을 원심 분리한 다음 100,000개의 세포를 2% 태아 송아지 혈청이 포함된 300 µL의 PBS에 재부유시킵니다.

그 후, 유세포 분석법(flow cytometry analysis)을 통해 EGFP 발현량을 측정합니다. 게놈 DNA 준비 및 후속 제한 효소 소화를 위해 형질전환된 세포 0.5~5백만 개를 추가로 수확합니다. 샘플당 4개의 제한 효소 소화 반응을 1.5 milliliter 튜브에 준비합니다.

각 튜브에 0.1~1 µg의 G-DNA를 넣고 소화시킵니다. 최종 부피 10 µL가 되도록 샘플당 10 units의 TRU91과 1 µL의 buffer M을 첨가합니다. 이 혼합액 2 µL를 소화 튜브에 분주합니다.

그런 다음 65 °C에서 6시간 또는 밤새도록 반응물을 배양합니다. 배양 후, 1.5 mL 튜브에 40 µL의 물을 넣습니다. 동일한 튜브에 샘플당 10 units의 PST1과 1 µL의 buffer H를 추가합니다.

소화 튜브에 소화 반응 혼합물 10 µL를 분주합니다. 반응물을 37 °C에서 6시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1.5 mL 튜브에 8개의 링커 결합 반응을 준비합니다.

각 반응마다, 10 µL의 제한효소 처리된 게놈 DNA에 리가아제 반응 혼합물을 첨가합니다. 16 °C에서 3~6시간 동안 배양합니다. 1차 PCR을 위해, 0.2 mL 튜브에 48개의 PCR 반응을 준비합니다.

각 PCR마다 링커 프라이머와 MLV3 prime LTR 프라이머가 포함된 반응 혼합물을 2 µL의 라이게이션 반응액에 추가합니다. 샘플을 가열 덮개가 있는 서멀 사이클러에 넣습니다. 사이클링 파라미터를 설정하고 1차 PCR 반응을 수행합니다.

2차 PCR을 위해 링커 네스티드 프라이머(linker nested primer)와 MLV3 prime LTR 네스티드 프라이머를 포함하여 반응 혼합물을 준비합니다. 그 다음, 1차 PCR의 PCR 산물 2 µL를 템플릿으로 첨가합니다. 이어서 2차 PCR 반응을 수행하여 최종 LN PCR 산물을 생성합니다.

2차 PCR 이후, 48개의 nested LM PCR 반응물을 15 milliliter 튜브에 모읍니다. 그런 다음, 모아서 침전시킨 LM PCR 생성물 100 microliters에 로딩 버퍼 20 microliters를 추가합니다. 그리고 100 base pair DNA ladder와 함께 샘플을 1% 아가로스 겔에 로딩합니다.

밴드가 분리되면 cm당 5V의 전압으로 30분에서 60분 동안 젤을 전기영동하고, 500에서 150 base pair 길이의 증폭산물이 포함된 젤 부분을 절단합니다. 컬럼 기반의 젤 추출 키트를 사용하여 LM PCR 생성물을 정제한 후, 라이브러리 제작 단계로 넘어가기 전에 UV 분광광도계를 사용하여 농도를 측정합니다. 또한, 제조사의 지침에 따라 바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 LM PCR 생성물의 길이를 평가합니다.

인덱싱 PCR을 설정하여 라이브러리를 준비합니다. 각 PCR마다 정제된 LM PCR 산물 150~170 ng을 사용하며, 샘플별로 서로 다른 인덱스 조합을 적용합니다. 지침에 따라 가열 덮개가 있는 서멀 사이클러에서 PCR을 수행합니다.

PCR 완료 후, 정제된 라이브러리를 10 mM tris HCL을 사용하여 10 nM로 희석합니다. 다음으로, 새로운 1.5 mL 튜브에 희석된 풀 5 µL와 0.2 N sodium hydroxide 5 µL를 혼합합니다. 짧게 볼텍싱하고 원심분리한 후, 라이브러리를 변성시키기 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.

변성된 풀(pool)이 담긴 튜브들을 얼음 위에 두고, 미리 냉각시킨 HT1 하이브리다이제이션 버퍼 990 µL를 준비합니다. 그다음, 변성된 풀 300 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 분주합니다. 여기에 미리 냉각시킨 HT1 300 µL를 추가하여 최종 라이브러리 풀의 농도가 10 pM이 되도록 합니다.

이와 병행하여, 1.5 milliliter 튜브에 10 nanomolar의 고정 제어 라이브러리 2 microliter와 10 millimolar tris HCl 3 microliters를 혼합합니다. 0.2 newtons sodium hydroxide 5 microliters를 첨가하고 짧게 보텍싱합니다. 원심 분리 후, 희석된 고정물을 변성시키기 위해 상온에서 5분 동안 배양합니다.

배양 후, 튜브를 얼음에 넣고 미리 냉각된 HT1 990 µL를 추가합니다. 그런 다음, 변성된 fix 100 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 분주하고 미리 냉각된 HT1 300 µL를 추가하여 fix의 최종 농도가 10 pM이 되도록 합니다. 마지막으로, 새로운 1.5 mL 튜브에 변성된 라이브러리 풀 510 µL와 변성된 고정 라이브러리 90 µL를 혼합하여, 시퀀싱을 위해 15%의 fix 컨트롤이 포함된 최종 10 pM 풀을 얻습니다.

이 이미지는 각각 조혈모세포, 적혈구계 전구세포 및 골수계 전구세포에서 나타난 3498개, 2989개, 4103개의 재발성 MLV 통합 부위 클러스터 분석 결과를 보여줍니다. 각 세포군에서 MLV 클러스터의 95% 이상이 후성유전학적으로 정의된 인핸서 및 프로모터와 겹쳤습니다. 세포 특이적 MLV 표적 영역은 고도로 아세틸화되었으며, 표적 유전자의 세포 특이적 발현과 연관되어 있었습니다.

예시로는 HSP 특이적 SPINK2 유전자의 프로모터, 적혈구 특이적 베타 유사 글로빈 유전자의 강력한 인핸서를 포함하는 locus control region, 그리고 NPP 특이적 LYZ 유전자의 상류에 위치한 인핸서 등이 있습니다.

루시퍼레이스 리포터 분석을 통해 EPP 및 MPP 내 세포 특이적 MLV 표적 인핸서의 서브셋을 검증하였습니다. 적혈구 특이적 MLV 표적 영역은 MPP보다 EPP에서 더 높은 활성을 보였으며 그 반대의 경우도 마찬가지였으며, 이는 MLV가 인접 유전자의 발현을 조절할 가능성이 있는 세포 특이적 인핸서를 식별함을 확인시켜 줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 최적의 통합 부위 회수를 위해 형질전환된 세포의 빈도를 최대화하는 것이 중요함을 기억해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 먼저 게놈 DNA를 조절한 다음 게놈 단편을 DNA 링커와 결합시키고, LM PCR을 통해 숙주 게놈-바이러스 접합부를 증폭한 후, 마지막으로 앰플리콘 라이브러리를 심층 시퀀싱하여 바이러스 통합 부위를 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.