Name: 레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 MLV 기반 레트로바이러스 벡터의 통합 부위를 맵핑하여 인간 세포의 세포 특이적 조절 영역을 정의하는 방법을. 이 기법은 유전자 치료 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 이탈리아 교육, 대학 및 연구부 (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003)의 유럽 연구위원회 (ERC-2010-AdG, GT-SKIN) , EPIGEN Epigenomics 대표 프로젝트), 이탈리아 보건부 (젊은 연구자는 2011 GR-2011-02352026) 및 Imagine Institute Foundation (프랑스, 파리).

1. 인간 세포의 MLV 형질 도입 <ol><li> 대상 세포를 분리하고 eGFP 리포터 유전자를 포함하고 Vesicular Stomatitis Virus G (VSV - G) 또는 amphotropic 봉투 glycoprotein 16 pseudotyped mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 그들을 transduce. <ol><li> 모의 변형 된 세포를 다음 분석을위한 음성 대조군으로 유지하십시오. mLV 기반의 레트로 바이러스 벡터는 효율적으로 분열하는 세포를 형질 도입 할 수 있기 때문에 세포 분열을 자극하는 조건에서 표적 세포 집단을 배양하십시오. 형질 도입 조건은 연구중인 각 세포 유형에 대해 특별히 최적화되어야합니다. 인간 조혈 전구 세포, T 세포 및 표피 세포에 대한 세포 성장 및 형질 도입 조건은 문헌 7, 14, 15 및 17에 기재되어있다. </li></ol></li><li> 48 시간 후, 2 % 태아 소 혈청을 함유 한 인산염 완충 식염수 (PBS) 300 μL에 100,000 세포를 재현하고 f에 의해 eGFP 발현을 측정한다낮은 cytometric 분석 (488 nm의 여기 레이저). 모의 - 형질 전환 된 세포를 음성 대조군으로 사용하십시오. 최적의 통합 사이트 검색을 위해 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)로 GFP + 세포를 정제하십시오. </li><li> 게놈 DNA 준비를 위해 0.5 ~ 5 백만 개의 세포를 수집하십시오. 통합되지 않은 프로 바이러스를 희석하고 선천적 인 줄기 세포의 장기 자손을 분석 할 때 더 긴 배양 기간 (&gt; 7 일)이 바람직합니다 ( 토론 절 및 참조 15 참조). 세포 펠렛은 사용하기 전까지 급속 동결되고 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol> 2. 링커 매개 PCR (LM - PCR)에 의한 mLV 통합 사이트의 증폭 <ol><li> 게놈 DNA (gDNA) <ol><li> 컬럼 기반의 DNA 추출 키트를 사용하여 gDNA를 추출하고 배양 세포에 대한 프로토콜을 따르십시오 (제조 업체의 지침에 따라). </li></ol></li><li> 제한 효소 digesti...에 <ol><li> 1.5 ML 튜브에서 샘플 당 4 제한 효소 소화를 설정합니다. 10 μL의 최종 부피에 1 μL의 Tru9I (10U)와 1 μL의 Buffer M을 첨가하여 각 튜브에 0.1 ~ 1 μg gDNA를 분해하십시오. 65 ° C에서 6 시간 또는 밤새 반응을 일으킨다. </li><li> 각 반응 1 μl의 PstI (10U), 1 μL의 버퍼 H와 8 μL의 물을 첨가하십시오. 37에서 반응을 6 시간 또는 밤새 품어. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 링커 라이 게이션 <ol><li> 100 μM 농도의 링커 플러스 가닥 및 링커 마이너스 스트랜드 oligonucleotides를 혼합하여 1.5 ML 튜브에 100 μM Tru9I 링커 주식 솔루션을 준비합니다. 튜브를 100 ° C로 설정된 물에 넣고 실온에서 식히십시오. Tru9I 링커 스톡 용액은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에서 8 링커의 연결 반응을 설정합니다. 각 반응에 대해 다음 성분을 첨가하십시오10 μL의 10 X T4 DNA 리가 제 반응 완충액, 1 μL의 10 μM 링커 Tru9I, 1 μL (2,000 U)의 T4 DNA 리가 제 및 0.6 μL의 물. 16에서 3에서 6 시간 동안 품어 라. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 PCR <ol><li> 0.2 ML 튜브에서 48 PCR 반응 (각 연결 튜브에서 6 반응)를 설정합니다. 각 PCR에 대해 다음과 같은 시약을 2 μL의 연결 반응에 첨가하십시오 : 5 μL의 10X PCR 버퍼, 2 μL의 50 mM 마그네슘 설페이트, 1 μL의 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μL의 10 μM 링커 프라이머, 1 10 μM mLV-3 &#39;LTR 프라이머 μL, Taq DNA Polymerase 0.3 μL (1.5 U) 및 물 37.7 μL. 프라이머 서열은 표 1에 제시되어있다. </li><li> 다음과 같이 가열 된 뚜껑을 갖춘 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 2 분; 15 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 55 ℃, 1 분 동안 72 ℃의 25주기; 72 °5 분간 C; 4 ° C에서 유지. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 두 번째 PCR <ol><li> 0.2 ML 튜브에서 48 PCR 반응 (각 &quot;첫 번째 PCR&quot;튜브에서 1)를 설정합니다. 각 PCR에 대해 첫 번째 PCR 반응 2 μL에 다음 구성 요소를 추가합니다. 5 μL의 10X PCR 버퍼, 2 μL의 50 mM 마그네슘 설페이트, 1 μL의 10 mM dNTP Mix, 1 μL의 10 μM 링커 중첩 프라이머, 1 10 μM mLV-3 &#39;LTR 중첩 프라이머 μL, Taq DNA 중합 효소 (1.5 U) 0.3 μL 및 물 37.7 μL. 선택된 거대한 시퀀싱 전략을 위해 설계된 중첩 된 프라이머를 사용하십시오 : (i) 링커 중첩 프라이머 및 Illumina 플랫폼과 호환되는 mLV-3 &#39;LTR 중첩 프라이머; (ii) Roche 플랫폼과 호환되는 링커 중첩 프라이머 및 mLV-3 &#39;LTR 네 스팅 프라이머. 프라이머 서열은 표 1 에 열거되어있다. </li><li> 다음과 같이 가열 된 뚜껑을 갖춘 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 2 분; 25 세95 ℃에서 15 초간, 58 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 1 분간의 사이클; 72 ℃에서 5 분; 4 ° C에서 유지. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 튜브 (~ 2.4 ML의 최종 볼륨)에서 48 개의 중첩 PCR 반응을 풀. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동으로 LM-PCR 제품의 존재 여부와 크기를 결정하십시오. <ol><li> LM-PCR 제품 20 μL에 Loading Buffer 4 μL를 넣고 샘플을 100 bp DNA 사다리와 함께 1 % 아가 로스 겔에로드하십시오. 30 ~ 60 분 동안 5 V / cm에서 겔을 실행하고 ethidium 브로마이드 얼룩에 의해 PCR 제품을 시각. </li><li> 모의 - transduced 샘플에서 부정적인 컨트롤로 LM - PCR 반응을 실행하십시오. </li></ol></li><li> 0.1 아세트산 나트륨 용액 (3 M, pH 5.2)과 2.5 부피의 100 % 에탄올을 가하여 증폭 물을 침전시킨다. -80에서 20 분 동안 혼합하고 동결시킨다. <ol><li> 푸에서 스핀표준 미세 원심 분리기에서 4 ° C에서 20 분간 속도. 상등액을 버리고 70 % 에탄올로 펠렛을 씻는다. 5 분 동안 4 ° C에서 표준 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 스핀하십시오. </li><li> 뜨는을 버리고 펠렛을 공기 건조하십시오. PCR 급수 200 μL를 추가하고 DNA를 resuspend. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 100 μL의 LM-PCR 제품에 Loading Buffer 20 μL를 첨가하고 샘플을 100 bp DNA 사다리와 함께 1 % 아가 로스 겔에로드하십시오. <ol><li> 30 ~ 60 분 동안 5 V / cm에서 겔을 실행하고 150 ~ 500 BP의 긴 amplicons을 포함하는 젤의 부분을 자르십시오. </li><li> 칼럼 기반 젤 추출 키트로 LM-PCR 제품을 정제하고 UV 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정하십시오. </li></ol></li><li> 제조사의 지침에 따라 bioanalyzer 악기를 사용하여 LM-PCR 제품의 길이를 평가하기 위해 1 μL의 라이브러리를 사용하십시오. </li><li><strong&gt; 산탄 총 복제 <ol><li> 정제 LM-PCR 제품 20 ng을 사용하고 제조 업체의 지침에 따라 pCR2.1 - TOPO 벡터에서 복제. </li><li> 최종 샘플을 확인하기 위해 클론의&gt; 50 %에서 바이러스 게놈 접합부 (mLV-3 &#39;LTR 중첩 프라이머 포함)의 존재를 밝히기 위해 결과 서열의 게놈지도 작성 후 M13 유니버셜 프라이머를 사용하여 시퀀싱 반응 수행 대규모 시퀀싱. 바이러스 - 게놈 접합의 예 : <img alt="접합" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTR 내포 프라이머 454 및 링커 내포 프라이머 454 ( 표 1 )는 굵게 표시하고 바이러스 성 LTR의 3&#39;말단은 이탤릭체로 표시 하였다. 인간 게놈 서열은 붉은 색 텍스트로 강조 표시됩니다 (chr10 : 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. mLV 통합 사이트의 대규모 시퀀싱 참고 : LM-PCR 제품상업용 플랫폼을 사용하여 서열을 분석 할 수 있습니다 (두 번째 PCR 반응에서 적절한 중첩 프라이머 쌍을 선택하십시오, 2.5.1 절 참조). Roche GS-FLX pyrosequencing 플랫폼을 이용한 시퀀싱에 대해서는 이전 논문 7 , 14 , 15를 참조하십시오. 이 섹션에서는 Illumina 시퀀싱 플랫폼에 대해 새로 최적화 된 프로토콜에 대해 설명합니다. <ol><li> 도서관 준비 <ol><li> 0.2 ML 튜브에서 샘플 당 1 색인 PCR 반응을 설정합니다. 각 PCR에 대해 5 μL (150-170 ng)의 정제 LM-PCR 제품에 다음 시약을 첨가하십시오 : 5 μL의 Index Primer 1, 5 μL의 Index Primer 2, 25 μL의 2X Master Mix 및 10 μL의 PCR- 학년 물. 각 견본마다 다른 색인 조합을 사용하십시오. </li><li> 다음과 같이 열 뚜껑이있는 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 3 분; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초의 8 사이클; 72 ° C에서 5m에서; 4 ° C에서 유지. </li><li> 고상 가역 고정 (SPRI) 비드 격리 프로토콜을 사용하여 PCR 제품을 정화 : 새로운 1.5 ML 튜브에서 각 샘플에 비즈 56 μL를 추가하고 제조 업체의 지침에 따라 진행합니다. Tris-HCl 10 mM 25 μL로 용출시킨다. 라이브러리는 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 도서관 수표 <ol><li> Bioanalyzer 장비를 사용하여 라이브러리 크기를 평가하기 위해 1 μL 샘플을 사용하십시오. </li><li> 제조사의 지침에 따라 형광 기반 실시간 PCR 분석을 사용하여 라이브러리 몰 농도를 계량하기 위해 1 μL 샘플을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 라이브러리 희석 및 시퀀싱 <ol><li> Tris-HCl 10 mM을 사용하여 10 nM까지 라이브러리를 희석하십시오. 라이브러리를 풀링하려면 각 희석 라이브러리 5 μL를 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 10 mM Tris-HCl에서 4 nM으로 풀을 희석하십시오. </li><li> 희석 된 풀 5 μL와 새로운 1.5 m의 0.2 N NaOH 5 μL를 섞는다.L 튜브에 넣고 간단히 보텍스로 스핀 - 다운하고 실온에서 5 분 동안 배양하여 라이브러리를 변성시킨다. </li><li> 얼음에 튜브를 넣어 사전 냉각 하이브 리다이 제이션 버퍼 (HT1) 990 μL를 추가합니다. 새로운 1.5 ML 튜브에 300 μl의 변성 풀을 나누어 주며 미리 냉각 된 HT1 300 μL를 첨가하여 10 pM 최종 라이브러리 풀을 얻습니다. </li><li> 병렬로 PhiX 컨트롤 라이브러리 (10nM) 2 μL와 1.5 mL 튜브에 3 μL의 Tris-HCl 10 mM을 섞으십시오. NaOH 0.2 N 5 μL를 가볍게 넣고 스핀 - 다운하고 상온에서 5 분 동안 배양하여 희석 된 PhiX를 변성시킨다. 얼음에 튜브를 넣고 미리 냉장 된 HT1 990 μL를 넣으십시오. </li><li> 분분한 PhiX 300 μL를 새로운 1.5 mL 튜브에 넣고 미리 냉각 된 HT1 300 μL를 첨가하여 최종 PhiX 10 pM을 얻습니다. </li><li> 새로운 1.5 mL 튜브에서 변성 라이브러리 풀 510 μL와 변성 PhiX 라이브러리 90 μL를 혼합하여 15 % PhiX 컨트롤을 갖춘 최종 10 pM 풀을 얻습니다. </li><li> 샘플 600μL를 피펫볼륨을 해동 된 시퀀싱 시약 카트리지의로드 샘플 저장고에 넣고 즉시 단일 판독 150 사이클 실행을 수행하십시오. 참고 :이 프로토콜에 필요한 중요한 시약 및 프라이머 서열은 표 1 에 나와 있습니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서 우리는 염색질 부위를 표적으로하는 레트로 바이러스 인 mLV의 통합 사이트의 게놈 - 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명했으며, 활성 프로모터 및 인핸서로 후생적으로 표시했습니다. 프로토콜의 중요한 단계 및 / 또는 한계는 다음을 포함합니다 : (i) 표적 세포 집단의 mLV 형질 도입; (ii) LM-PCR에 의한 바이러스 - 숙주 접합부의 증폭; (iii) 통합 사이트의 높은 비율의 검색. mLV- 기반 레트로 바이러스 벡터는 분열 세포를 효율적으로 형질 전환시킨다. 비분 할 세포 (예 : 사후 유사 분열 신경 세포)의 형질 도입 효율이 낮 으면이 기법의 잠재적 한계가됩니다. 그러나, 리포터 유전자 ( 예, eGFP)의 발현에 기초하여 형질 감염된 집단의 세포 분류를 통해 극복 될 수있다. LM-PCR (150 ~ 500 bp)에 의한 상대적으로 짧은 앰플 리콘의 생성은 현재 사용되는 방대한 시퀀싱 전략과 호환되는 앰플 리콘 라이브러리를 생성하고 포괄적 인 유전자를 허용하는 데 필수적입니다mLV 통합 ...

세포 동일성은 특정 유전자 세트의 발현에 의해 결정됩니다. 프로모터 및 인핸서와 같은 시스 조절 요소의 역할은 세포 유형 특이 적 전사 프로그램의 활성화에 결정적이다. 이러한 조절 부위는 특이적인 히스톤 변형, 전사 인자 및 보조 인자 결합, 염색질 접근성과 같은 특이적인 염색질 특징을 특징으로하는데, 이는 여러 세포 유형 1 , 2 , 3 에서 게놈 전체의 식별을 위해 널리 사용되어왔다. 특히 히스톤 H3 라이신 27 (H3K27ac)의 게놈 전체 프로파일은 활성 프로모터, 인핸서 및 슈퍼 인핸서 4 , 5 , 6 을 정의하는 데 일반적으로 사용됩니다. Moloney murine leukemia virus (MLV)는 유전자에 널리 사용되는 감마 - 레트로 바이러스입니다포유 동물 세포에서 전달. 표적 세포를 감염시킨 후 retroviral RNA genome은 pre-integration complex (PIC)를 조립하기 위해 바이러스 및 세포 단백질에 결합하는 이중 가닥의 DNA 분자에서 역전사된다. PIC는 핵을 입력하고 숙주 세포 염색질을 바인딩합니다. 여기에서 중요한 PIC 성분 인 바이러스 인테그라 아제 (viral integrase)는 프로 바이러스 DNA의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 매개한다. 게놈 DNA에서의 mLV 통합은 무작위 적이 지 않지만 세포 특이적인 방식으로 활성 cis 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및 인핸서에서 일어난다 7 , 8 , 9 , 10 . 이 특이 적 통합 프로파일은 mLV integrase와 세포 bromodomain 및 외쪽 끝 도메인 (BET) 단백질 11 , 12 , 13 사이의 직접적인 상호 작용에 의해 매개됩니다. BET 단백질 (BRD2, BRD3 및BRD4)는 숙주 염색질과 mLV PIC 사이의 가교 역할을한다. 브롬 도메인을 통해 고도로 아세틸 화 된 시스 조절 영역을 인식하고 외측 말단 도메인은 mLV 인테그라 아제 11 , 12 , 13 과 상호 작용한다. 여기에서, 우리는 mLV의 통합 특성에 기초하여 활성 cis- 조절 영역을 매핑하는 새로운 도구 인 레트로 바이러스 스캐닝을 기술한다. 간략하게, 세포는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 리포터 유전자를 발현하는 mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 게놈 DNA 추출 후, mLV 벡터의 3 &#39;긴 말단 반복 (LTR)과 게놈 DNA 간의 연결 부위는 링커 매개 PCR (LM-PCR)에 의해 증폭되고 대량으로 서열 분석된다. mLV 통합 사이트는 인간 게놈에 매핑되며 mLV에 의해 표적화되는 게놈 영역은 mLV 통합 사이트의 클러스터로 정의됩니다. 레트로 바이러스 검사ning은 여러 인간의 일차 세포에서 세포 특이 적 활성 조절 요소를 정의하는 데 사용되었습니다 14 , 15 . mLV 클러스터는 후생 적으로 정의 된 프로모터 및 인핸서와 함께 매핑되었으며, 대부분은 H3K27ac과 같은 활성 히스톤 마커를 가지며 세포 특이 적이었다. 레트로 바이러스 스캐닝은 전향 적으로 정제 된 세포 집단 7,14뿐 아니라 예비 격리 15 에 효과적인 마커가없는 케라틴 틴틴 줄기 세포와 같은 후 향적으로 정의 된 세포 집단에서 DNA 조절 요소의 게놈 전체 식별을 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>0.2 ml 튜브</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>링커 플러스 스트랜드 올리고뉴클레오티드</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td>5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (정화 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>링커 마이너스 스트랜드 올리고뉴클레오티드</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (정화 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>PCR 등급 물</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well thermal cycler (가열 뚜껑 포함)</td> <td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>링커 프라이머</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (정제 등급 : PCR 등급)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR 프라이머</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5 '-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3 ' (정제 등급 : PCR 등급)</td></tr><tr><td>링커 중첩 프라이머 454</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](정제 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR 중첩 프라이머 454</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](정제 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>링커 중첩 프라이머 Illumina</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](정제 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR 중첩 프라이머 Illumina</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](정제 등급: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 용액(3M) pH 5.2</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학용 에탄올(절대)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Topo TA 클로닝 키트(pCR2.1-TOPO 벡터 포함)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Ethidium bromide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>또는 동급</td></tr>, <tr><td>100 bp DNA ladder</td>, <td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>또는 동급</td></tr>, <tr><td>6x 로딩 버퍼</td><td>, ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>또는 동급</td></tr>, <tr><td>NanoDrop 2000, UV-Vis 분광광도계</td><td>, ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr>, <tr><td>Nextera XT Index 키트</td><td>, Illumina</td><td>FC-131-1001 또는 FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi 핫 스타트 레디 믹스&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Dynal 2 ml 튜브용 마그네틱 스탠드</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml 키트</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>또는</td></tr><tr><td>동급 Illumina 플랫폼용 KAPA 라이브러리 정량 키트(ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, 분자 생물학 등급</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT1(혼성화 완충액)</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>MiSeq 시약 키트</td><td></td>에 제공</tr>: <tr><td>MiSeq 시약 키트 v3 (150 사이클)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr>, <tr><td>MiSeq 시스템</td><td>, Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr>, <tr><td>PhiX Control v3</td>, <td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

레트로 바이러스 스캐닝 : mlv 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) 바이러스 기반 레트로 바이러스 벡터는 주로 아세틸 화 된 인핸서와 프로모터에 통합됩니다. 이러한 이유로 mLV 통합 사이트는 능동적 인 규제 요소의 기능적 표지자로 사용될 수 있습니다. 여기에 우리는 세포 특이 적 인핸서 (enhancer)와 프로모터 (promoter)에 대한 게놈 차원의 식별을 가능하게하는 레트로 바이러스 스캐닝 도구를 제시한다. 간단히 말해, 표적 세포 집단은 mLV 유래 벡터로 형질 도입되고 게놈 DNA는 절단 제한 효소로 절단된다. 호환 DNA 링커와 게놈 조각의 연결 후, 링커 중재 폴리머 라제 연쇄 반응 (LM-PCR)은 바이러스 - 호스트 게놈 교차점의 증폭을 허용합니다. amplicons의 대규모 시퀀싱은 게놈 전체 mLV 통합 프로필을 정의하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 반복적 통합의 클러스터는 세포 유형 특이적인 전사 프로그램의 활성화를 담당하는 세포 특이 적 조절 영역을 확인하기 위해 정의된다. 예를 들면 체세포 줄기 세포)의 회고 확인을위한 도구 기술을 대표한다.

레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로우 레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로가 그림 1 에 나와 있습니다. 표적 세포 집단을 정제하고 eGFP 리포터 유전자를 발현하는 mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 형질 감염시켰다. 형질 도입 유전자는 2 개의 동일한 긴 말단 반복 (5 &#39;및 3&#39;LTR)에 의해 둘러싸여 있으며, 합성, 역전사 및 바이러스 게놈의 숙주 DNA 내로의 통합을 보장한다. 형질 도입 효율은 eGFP 발현의 FACS 분석에 의해 평가된다. mLV - transduced 세포의 높은 비율 (&gt; 30 %)을 포함하는 세포 인구가 증폭하고 통합 mLV 바이러스 카세트를 포함하는 게놈 DNA를 추출하기 위해 lysed. 게놈 ...

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 백혈병 바이러스(murine leukemia virus) 유래 레트로바이러스 벡터의 통합 부위를 매핑하여 세포 특이적 조절 영역을 정의하는 것입니다. 이 방법은 벡터가 인간 게놈의 어디에 통합되는지, 그리고 어떤 조절 요소가 특정 아형을 통해 활발하게 이용될 수 있는지와 같은 유전자 치료 및 유전자 조절 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 유전자 치료 연구에서 MLV 벡터가 활성 아형 특이적 프로모터와 인핸서에 통합된다는 점을 관찰함으로써 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.먼저 EGFP 리포터 유전자를 포함하며 VSV-G 또는 amphrotopic 엔벨로프 당단백질로 슈도타이핑된 MLV 유래 레트로바이러스 벡터를 표적 세포에 형질도입합니다. 모의 형질도입(Mock transduction)된 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 형질도입 48시간 후, 샘플을 원심 분리한 다음 100,000개의 세포를 2% 태아 송아지 혈청이 포함된 300 µL의 PBS에 재부유시킵니다.그 후, 유세포 분석법(flow cytometry analysis)을 통해 EGFP 발현량을 측정합니다. 게놈 DNA 준비 및 후속 제한 효소 소화를 위해 형질전환된 세포 0.5~5백만 개를 추가로 수확합니다. 샘플당 4개의 제한 효소 소화 반응을 1.5 milliliter 튜브에 준비합니다.각 튜브에 0.1~1 µg의 G-DNA를 넣고 소화시킵니다. 최종 부피 10 µL가 되도록 샘플당 10 units의 TRU91과 1 µL의 buffer M을 첨가합니다. 이 혼합액 2 µL를 소화 튜브에 분주합니다.그런 다음 65 °C에서 6시간 또는 밤새도록 반응물을 배양합니다. 배양 후, 1.5 mL 튜브에 40 µL의 물을 넣습니다. 동일한 튜브에 샘플당 10 units의 PST1과 1 µL의 buffer H를 추가합니다.소화 튜브에 소화 반응 혼합물 10 µL를 분주합니다. 반응물을 37 °C에서 6시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1.5 mL 튜브에 8개의 링커 결합 반응을 준비합니다.각 반응마다, 10 µL의 제한효소 처리된 게놈 DNA에 리가아제 반응 혼합물을 첨가합니다. 16 °C에서 3~6시간 동안 배양합니다. 1차 PCR을 위해, 0.2 mL 튜브에 48개의 PCR 반응을 준비합니다.각 PCR마다 링커 프라이머와 MLV3 prime LTR 프라이머가 포함된 반응 혼합물을 2 µL의 라이게이션 반응액에 추가합니다. 샘플을 가열 덮개가 있는 서멀 사이클러에 넣습니다. 사이클링 파라미터를 설정하고 1차 PCR 반응을 수행합니다.2차 PCR을 위해 링커 네스티드 프라이머(linker nested primer)와 MLV3 prime LTR 네스티드 프라이머를 포함하여 반응 혼합물을 준비합니다. 그 다음, 1차 PCR의 PCR 산물 2 µL를 템플릿으로 첨가합니다. 이어서 2차 PCR 반응을 수행하여 최종 LN PCR 산물을 생성합니다.2차 PCR 이후, 48개의 nested LM PCR 반응물을 15 milliliter 튜브에 모읍니다. 그런 다음, 모아서 침전시킨 LM PCR 생성물 100 microliters에 로딩 버퍼 20 microliters를 추가합니다. 그리고 100 base pair DNA ladder와 함께 샘플을 1% 아가로스 겔에 로딩합니다.밴드가 분리되면 cm당 5V의 전압으로 30분에서 60분 동안 젤을 전기영동하고, 500에서 150 base pair 길이의 증폭산물이 포함된 젤 부분을 절단합니다. 컬럼 기반의 젤 추출 키트를 사용하여 LM PCR 생성물을 정제한 후, 라이브러리 제작 단계로 넘어가기 전에 UV 분광광도계를 사용하여 농도를 측정합니다. 또한, 제조사의 지침에 따라 바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 LM PCR 생성물의 길이를 평가합니다.인덱싱 PCR을 설정하여 라이브러리를 준비합니다. 각 PCR마다 정제된 LM PCR 산물 150~170 ng을 사용하며, 샘플별로 서로 다른 인덱스 조합을 적용합니다. 지침에 따라 가열 덮개가 있는 서멀 사이클러에서 PCR을 수행합니다.PCR 완료 후, 정제된 라이브러리를 10 mM tris HCL을 사용하여 10 nM로 희석합니다. 다음으로, 새로운 1.5 mL 튜브에 희석된 풀 5 µL와 0.2 N sodium hydroxide 5 µL를 혼합합니다. 짧게 볼텍싱하고 원심분리한 후, 라이브러리를 변성시키기 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.변성된 풀(pool)이 담긴 튜브들을 얼음 위에 두고, 미리 냉각시킨 HT1 하이브리다이제이션 버퍼 990 µL를 준비합니다. 그다음, 변성된 풀 300 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 분주합니다. 여기에 미리 냉각시킨 HT1 300 µL를 추가하여 최종 라이브러리 풀의 농도가 10 pM이 되도록 합니다.이와 병행하여, 1.5 milliliter 튜브에 10 nanomolar의 고정 제어 라이브러리 2 microliter와 10 millimolar tris HCl 3 microliters를 혼합합니다. 0.2 newtons sodium hydroxide 5 microliters를 첨가하고 짧게 보텍싱합니다. 원심 분리 후, 희석된 고정물을 변성시키기 위해 상온에서 5분 동안 배양합니다.배양 후, 튜브를 얼음에 넣고 미리 냉각된 HT1 990 µL를 추가합니다. 그런 다음, 변성된 fix 100 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 분주하고 미리 냉각된 HT1 300 µL를 추가하여 fix의 최종 농도가 10 pM이 되도록 합니다. 마지막으로, 새로운 1.5 mL 튜브에 변성된 라이브러리 풀 510 µL와 변성된 고정 라이브러리 90 µL를 혼합하여, 시퀀싱을 위해 15%의 fix 컨트롤이 포함된 최종 10 pM 풀을 얻습니다.이 이미지는 각각 조혈모세포, 적혈구계 전구세포 및 골수계 전구세포에서 나타난 3498개, 2989개, 4103개의 재발성 MLV 통합 부위 클러스터 분석 결과를 보여줍니다. 각 세포군에서 MLV 클러스터의 95% 이상이 후성유전학적으로 정의된 인핸서 및 프로모터와 겹쳤습니다. 세포 특이적 MLV 표적 영역은 고도로 아세틸화되었으며, 표적 유전자의 세포 특이적 발현과 연관되어 있었습니다.예시로는 HSP 특이적 SPINK2 유전자의 프로모터, 적혈구 특이적 베타 유사 글로빈 유전자의 강력한 인핸서를 포함하는 locus control region, 그리고 NPP 특이적 LYZ 유전자의 상류에 위치한 인핸서 등이 있습니다.루시퍼레이스 리포터 분석을 통해 EPP 및 MPP 내 세포 특이적 MLV 표적 인핸서의 서브셋을 검증하였습니다. 적혈구 특이적 MLV 표적 영역은 MPP보다 EPP에서 더 높은 활성을 보였으며 그 반대의 경우도 마찬가지였으며, 이는 MLV가 인접 유전자의 발현을 조절할 가능성이 있는 세포 특이적 인핸서를 식별함을 확인시켜 줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 일주일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 최적의 통합 부위 회수를 위해 형질전환된 세포의 빈도를 최대화하는 것이 중요함을 기억해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 먼저 게놈 DNA를 조절한 다음 게놈 단편을 DNA 링커와 결합시키고, LM PCR을 통해 숙주 게놈-바이러스 접합부를 증폭한 후, 마지막으로 앰플리콘 라이브러리를 심층 시퀀싱하여 바이러스 통합 부위를 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다...

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

학습하세요 MLV 기반 레트로바이러스 벡터의 통합 부위를 맵핑하여 인간 세포의 세포 특이적 조절 영역을 정의하는 방법을. 이 기법은 유전자 치료 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

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