Name: Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regios te definiëren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer retrovirale scanning om integratieplaatsen van MLV-vectoren in menselijke cellen in kaart te brengen. Deze methode identificeert celspecifieke regulerende regio's voor gentherapie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) en de Stichting Imagine Institute (Parijs, Frankrijk).

1. MLV-transductie van menselijke cellen <ol><li> Isolatie doelcellen en transduceer ze met een mLV-afgeleide retrovirale vector die het eGFP reportergen bevat en pseudotypeert met Vesicular Stomatitis Virus G (VSV-G) of het amphotropische envelopglycoproteïne 16 . <ol><li> Bewaar mock-transduced cellen als negatieve controle voor de volgende analyses. Aangezien mLV-gebaseerde retrovirale vectoren effectieve verdeling van cellen kunnen transduceren, kweek de doelcellenpopulatie in omstandigheden die celverdeling stimuleren. Transductie condities moeten specifiek worden geoptimaliseerd voor elk celtype dat onderzocht wordt. Celgroei en transductietoestanden voor humane hematopoietische stamcellen, T-cellen en epidermale cellen zijn beschreven in Referenties 7, 14, 15 en 17. </li></ol></li><li> 48 uur na transductie, 100.000 cellen resuspenderen in 300 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runder serum bevat en eGFP expressie meten fLage cytometrische analyse (488 nm excitatie laser). Gebruik mock-transduced cellen als negatieve controle. Voor optimale integratie site retrieval, zuiver GFP + cellen door Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). </li><li> Verzamel 0,5 tot 5 miljoen cellen voor genomische DNA-bereiding. Een langere cultuurperiode (&gt; 7 dagen) heeft de voorkeur om het niet geïntegreerde provirus te verdunnen en noodzakelijk bij het analyseren van de langetermijn nakomelingen van bona fide stamcellen (zie discussie sectie en referentie 15 ). De celpellets kunnen worden gesneden en opgeslagen bij -80 ° C tot aan het gebruik. </li></ol> 2. Versterking van mLV-integratieplaatsen door linker-gemedieerde PCR (LM-PCR) <ol><li> Bereiding van genomisch DNA (gDNA) <ol><li> Extract gDNA met behulp van een kolom gebaseerde DNA extractie kit en volg het protocol voor gekweekte cellen, volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Restrictie enzym digestiop <ol><li> Stel 4 restrictie-enzymverdichten per monster in 1,5 ml buizen op. Digest 0,1 tot 1 μg gDNA in elke buis door 1 μL Tru9I (10U) en 1 μl buffer M in een eindvolume van 10 μl toe te voegen. Incubeer de reacties bij 65 ° C gedurende 6 uur of &#39;s nachts. </li><li> Voeg bij elke reactie 1 μL PstI (10U), 1 μl buffer H en 8 μl water toe. Incubeer de reacties bij 37 ° C gedurende 6 uur of &#39;s nachts. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li></ol></li><li> Linker ligatie <ol><li> Bereid een 100 μM Tru9I linker voorraadoplossing in een 1,5 ml buis door de linker plus streng en linker minus strand oligonucleotiden bij een 100 μM concentratie te mengen. Zet de buis in een water ingesteld op 100 ° C en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Tru9I linker voorraadoplossing kan bij -20 ° C tot gebruik worden opgeslagen. </li><li> Stel 8 linkerligatie reacties op in 1,5 ml buizen. Voeg bij elke reactie het volgende bestanddeel toeS tot 10 μL restrictie-enzymvertering: 1,4 μl 10X T4 DNA-ligase-reactiebuffer, 1 μl 10 μM linker Tru9I, 1 μL (2000U) T4 DNA-ligase en 0,6 μl water. Incubeer bij 16 ° C gedurende 3 tot 6 uur. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li></ol></li><li> Eerste PCR <ol><li> Stel 48 PCR reacties op (6 reacties van elke ligatiebuis) in 0,2 ml buizen. Voor elke PCR voeg de volgende reagentia toe aan 2 μl ligeringsreactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μl 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM linker primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 &#39;LTR primer, 0,3 μL (1,5U) Taq DNA Polymerase en 37,7 μl water. Primersequenties worden weergegeven in Tabel 1. </li><li> Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 °; C voor 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li></ol></li><li> Tweede PCR <ol><li> Stel 48 PCR reacties (1 uit elke &quot;eerste PCR&quot; buis) in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende componenten toe aan 2 μL van de eerste PCR-reactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μL 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM linker geneste primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 &#39;LTR geneste primer, 0,3 μl Taq DNA Polymerase (1,5 U) en 37,7 μl water. Gebruik geneste primers die zijn ontworpen voor de specifieke massieve sequencing strategie gekozen: (i) linker geneste primer en mLV-3 &#39;LTR geneste primer compatibel met Illumina platform; (Ii) linker geneste primer en mLV-3 &#39;LTR geneste primer compatibel met Roche platform. Primersequenties staan ​​vermeld in Tabel 1 . </li><li> Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25Cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li><li> Pool de 48 geneste PCR-reacties in een 15 ml buis (eindvolume van 2,4 ml). Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li></ol></li><li> Bepaal de aanwezigheid en de grootte van de LM-PCR producten door agarosegel elektroforese. <ol><li> Voeg 4 μL Loadbuffer toe aan 20 μL LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder. Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en visualiseer de PCR-producten door ethidiumbromide-kleuring. </li><li> Voer een LM-PCR-reactie uit van het mock-getransduceerde monster als negatieve controle. </li></ol></li><li> Precipiteer de ampliconen door 0,1 volumes natriumacetaatoplossing (3 M, pH 5,2) en 2,5 volumes 100% ethanol toe te voegen. Meng en vries bij -80 ° C gedurende 20 minuten. <ol><li> Spin at fuLl gedurende 20 minuten in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C versnellen. Gooi de supernatant weg en doe de pellet met 70% ethanol. Spin bij volle snelheid in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Gooi de supernatant weg en laat de pellet drogen. Voeg 200 μl water van PCR-gehalte toe en vul het DNA opnieuw op. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik. </li></ol></li><li> Voeg 20 μL laadbuffer toe aan 100 μl van de LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder. <ol><li> Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en snijd het gedeelte van de gel met 150 tot 500 bp-lange ampliconen. </li><li> Reinig de LM-PCR producten met een kolom gebaseerde gel extractie kit en meet de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer. </li></ol></li><li> Gebruik 1 μL bibliotheek om de lengte van de LM-PCR producten te evalueren met behulp van een bioanalysator, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li><sTrong&gt; Shotgun kloning van ampliconen <ol><li> Gebruik 20 ng van de gezuiverde LM-PCR-producten en kloneer ze in de pCR2.1-TOPO-vector volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Volg sequentieringsreacties met behulp van de M13 Universal Primer, gevolgd door genomische mapping van de resulterende sequenties, om de aanwezigheid van de virale-genoomverbindingen (inclusief de mLV-3 &#39;LTR geneste primer) in&gt; 50% van de klonen te onthullen om passende monsters te identificeren Voor massale sequencing. Voorbeeld van een virale-genoomverbinding: <img alt="Knooppunt" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTR geneste primer 454 en linker geneste primer 454 ( tabel 1 ) zijn vetgedrukt en het 3&#39;-uiteinde van de virale LTR cursief. De menselijke genomische sequentie is gemarkeerd in rode tekst (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Massieve sequencing van mLV Integration Sites OPMERKING: LM-PCR prodUcts kunnen op basis van commerciele platforms worden gesorteerd (het juiste geneste primerpaar selecteren in de tweede PCR-reactie, zie paragraaf 2.5.1). Voor sequencing door Roche GS-FLX pyrosequencing platform, verwijzen wij u naar de vorige documenten 7 , 14 , 15 . In dit gedeelte wordt een nieuw geoptimaliseerd protocol voor Illumina sequencing platform beschreven. <ol><li> Bibliotheekvoorbereiding <ol><li> Stel 1 indexering PCR-reactie per monster in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende reagentia toe aan 5 μL (150-170 ng) gezuiverd LM-PCR product: 5 μL Index Primer 1, 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2X Master Mix en 10 μl PCR- Kwaliteit water. Gebruik een andere indexcombinatie voor elk monster. </li><li> Voer PCR-reacties uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 3 minuten; 8 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 5 min; Vasthouden bij 4 ° C. </li><li> De PCR-producten zuiveren met behulp van een solid-phase reversibel immobilisatie (SPRI) kraalisolatieprotocol: Voeg in nieuwe 1,5 ml buizen 56 μL kralen aan elk monster toe en volg de instructies van de fabrikant. Oplossen in 25 μl Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken kunnen bij -20 ° C worden opgeslagen tot aan het gebruik. </li></ol></li><li> Bibliotheekcontrole <ol><li> Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekgrootte te beoordelen met behulp van een bioanalysator. </li><li> Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekmolariteit te kwantificeren met behulp van een fluorescentie gebaseerde Real-Time PCR-analyse volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Bibliotheekverdunning en sequencing <ol><li> Verdun bibliotheken naar 10 nM met behulp van Tris-HCl 10 mM. Voor het bundelen van bibliotheken overbrengt 5 μL van elke verdunde bibliotheek naar een nieuwe 1,5 ml buis en verdund het pool vervolgens tot 4 nM in Tris-HCl 10 mM. </li><li> Meng 5 μl verdund zwembad met 5 μL 0,2 N NaOH in een nieuwe 1,5 mL buis, vortex kort, draai-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de bibliotheken te denatureren. </li><li> Zet buizen op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde hybridisatiebuffer (HT1) toe. Aliquot 300 μL gedenatureerde pool in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM eindbibliotheek zwembad te verkrijgen. </li><li> Gelijktijdig meng 2 μL PhiX controle bibliotheek (10 nM) met 3 μl Tris-HCl 10 mM in een 1,5 ml buis. Voeg 5 μL NaOH 0,2 N, vortex kort, spin-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de verdunde PhiX te denatureren. Doe de buis op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde HT1 toe. </li><li> Aliquot 300 μL gedenatureerde PhiX in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM uiteindelijke PhiX te verkrijgen. </li><li> In een nieuwe 1,5 ml buis mengen 510 μL gedenatureerde bibliotheekpool met 90 μl gedenatureerde PhiX-bibliotheek, waardoor een laatste 10 pM pool met 15% PhiX-controle wordt verkregen. </li><li> Pipetteer deze 600 μL monsterVolume in het laadproefreservoir van de ontdooide sequentie-reagentcartridge en ga onmiddellijk door om een ​​lopende 150-cyclus uit te voeren. OPMERKING: De kritische reagentia en primersequenties die nodig zijn voor dit protocol zijn vermeld in tabel 1 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we een protocol beschreven voor genoom-wide mapping van de integratie sites van mLV, een retrovirus dat zich richt op chromatinegebieden, epigenetisch gemarkeerd als actieve promotors en enhancers. Kritieke stappen en / of beperkingen van het protocol omvatten: (i) mLV transductie van de doelcellenpopulatie; (Ii) amplificatie van virus-gastheer kruisingen door LM-PCR; (Iii) het ophalen van een hoge fractie integratieplaatsen. MLV-gebaseerde retrovirale vectoren transduceren delende cellen efficiënt. De lage ...

Celidentiteit wordt bepaald door de expressie van specifieke sets genen. De rol van cis-regulerende elementen, zoals promotors en enhancers, is van cruciaal belang voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma&#39;s van de celtype. Deze regulerende gebieden worden gekenmerkt door specifieke chromatinfuncties, zoals eigenaardige histon-modificaties, transcriptiefactoren en co-factoren binding, en chromatin toegankelijkheid, die veel gebruikt zijn voor hun genoom-brede identificatie in verscheidene celtypes 1 , 2 , 3 . In het bijzonder wordt het genoom-breed profiel van acetylering van histon H3-lysine 27 (H3K27ac) algemeen gebruikt om actieve promoters, versterkers en superversterkers 4 , 5 , 6 te definiëren. Moloney muizen leukemie virus (MLV) is een gamma-retrovirus dat algemeen gebruikt wordt voor genenOverdracht in zoogdiercellen. Na het infecteren van een doelcel, wordt het retrovirale RNA-genoom getranscribeerd in een dubbelstrengs DNA-molecuul dat virale en cellulaire eiwitten bindt om het pre-integratiecomplex (PIC) te assembleren. De PIC komt in de kern en bindt de gastheercelchromatine. Hier bemiddelt de virale integrase, een belangrijke PIC component, de integratie van het provirale DNA in het gastheer-genoom. MLV-integratie in het genomische DNA is niet willekeurig, maar komt in actieve cis-regulerende elementen, zoals promoters en versterkers, op een celspecifieke wijze 7 , 8 , 9 , 10 voor . Dit eigenaardige integratieprofiel wordt gemedieerd door een directe interactie tussen de mLV integrase en de cellulaire bromodomain en extraterminale domein (BET) eiwitten 11 , 12 , 13 . BET eiwitten (BRD2, BRD3 enBRD4) fungeren als een brug tussen gastheerchromatine en mLV PIC: door hun bromomaten herkennen zij sterk geacyleerde cis-regulerende gebieden, terwijl het extraterminale domein interactieert met de mLV integrase 11 , 12 , 13 . Hier beschrijven we het retrovirale scannen, een nieuw gereedschap om actieve cis-regulerende gebieden te lokaliseren op basis van de integratie eigenschappen van mLV. In het kort worden cellen getransduceerd met mLV-afgeleide retrovirale vector die het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) reportergen tot expressie brengt. Na de genomische DNA-extractie worden de kruisingen tussen de 3&#39;-lange terminale herhaling (LTR) van de mlV-vector en het genomische DNA geamplificeerd door linker gemedieerde PCR (LM-PCR) en massief opeenvolgend. MLV-integratieplaatsen worden toegewezen aan het menselijk genoom en genomische gebieden die sterk gerangschikt zijn door mLV worden gedefinieerd als clusters van mLV-integratieplaatsen. Retrovirale scanNing werd gebruikt om celspecifieke actieve regulerende elementen in verschillende menselijke primaire cellen 14 , 15 te definiëren. MLV clusters co-mapped met epigenetisch gedefinieerde promoters en enhancers, waarvan de meeste actieve histonenmerken, zoals H3K27ac, bevatten en cellspecifiek waren. Retrovirale scanning laat de genoombrede identificatie van DNA regulatorische elementen toe in prospectief gezuiverde celpopulaties 7 , 14 , evenals in retrospectief gedefinieerde celpopulaties, zoals keratinocytstamcellen, die geen effectieve markers voor toekomstige isolatie hebben 15 .

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>0.2 ml tubes</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reactie buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Linker Plus Strand oligonucleotide</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3&rsquo;&nbsp; (zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Linker Minus Strand oligonucleotide</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3&rsquo; (zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>PCR grade water</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well thermal cycler (met verwarmd deksel)</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>linker primer</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3&rsquo; (zuivering graad: PCR graad)</td></tr><tr><td>MLV-3&rsquo; LTR primer</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3&rsquo; (zuivering graad: PCR graad)</td></tr><tr><td>linker nested primer 454</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3&rsquo; LTR nested primer 454</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5&rsquo;-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>linker nested primer Illumina</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3&rsquo; LTR nested primer Illumina</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](zuivering graad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Natriumacetaatoplossing (3M) pH 5.2</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (absoluut) voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Topo TA Cloning kit (met pCR2.1-TOPO vector)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>6x Loading Buffer</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrofotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 of FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Dynal magnetische stand voor 2 ml tubes</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml kit</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation systeem</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>D1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit voor Illumina platformen (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR Systeem</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, moleculaire biologie-kwaliteit</td><td>algemene lableverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT1 (Hybridisatie Buffer)</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>Wordt geleverd in de MiSeq Reagent Kit</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Systeem</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirale scanning: mapping mlv integration sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney muizen leukemie (MLV) -virus gebaseerde retrovirale vectoren integreren overwegend in geacyleerde versterkers en promoters. Om deze reden kunnen mLV-integratieplaatsen worden gebruikt als functionele markers van actieve regulerende elementen. Hier presenteren wij een retrovirale scan tool, waarmee de genoom-breed identificatie van celspecifieke enhancers en promotors mogelijk is. In het kort wordt de doelcellenpopulatie getransduceerd met een mLV-afgeleide vector en genomisch DNA wordt verteerd met een frequent snijbeperkingsenzym. Na ligatie van genomische fragmenten met een compatibele DNA-linker maakt linker-gemedieerde polymerase kettingreactie (LM-PCR) de amplificatie van de virus-gastheer-genoomverbindingen mogelijk. Massieve sequentiebepaling van de ampliconen wordt gebruikt om het mLV integratieprofiel genoom breed te definiëren. Tenslotte worden clusters van terugkerende integraties gedefinieerd om celspecifieke regulerende gebieden te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma&#39;s van de celtype. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Het retrovirale scaninstrument maakt de genoom-breed identificatie van celspecifieke promotors en enhancers mogelijk in prospectief geïsoleerde doelcelpopulaties. Met name retrovirale scanning is een instrumentale techniek voor de retrospectieve identificatie van zeldzame populaties ( bijv. Somatische stamcellen) die robuuste markers voor toekomstige isolatie hebben.

Werkstroom van de retrovirale scanprocedure De werkstroom van retrovirale scanprocedure is in figuur 1 geschetst. De doelcellenpopulatie wordt gezuiverd en getransduceerd met een mLV-afgeleide retrovirale vector die een eGFP-reportergen uitmaakt. Het transgen wordt geflankeerd door de twee identieke lange terminale herhalingen (5 &#39;en 3&#39; LTR), waardoor synthese, omgekeerde transcriptie en inte...

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Het algemene doel van deze procedure is om integratieplaatsen van retrovirale vectoren, afgeleid van het muizenleukemievirus, in kaart te brengen om cel-specifieke regulatoire regio's te definiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in gentherapie- en genregulatiestudies, zoals waar de vector integreert in het menselijk genoom en welk regulatoir element actief gebruikt kan worden via een specifiek subtype. Het idee voor deze methode ontstond nadat we observeerden dat MLV-vectoren in gentherapiestudies integreren in actieve, subtype-specifieke promotors en enhancers.Begin met het transduceren van de doelcellen met een MLV-afgeleide retrovirale vector die het EGFP-reportergen bevat en gepseudotypeerd is met VSV-G of het amfrotrope envelop-glycoproteïne. Mock-getransduceerde cellen worden gebruikt als negatieve controle. Centrifugeer de monsters 48 uur na transductie en resuspendeer vervolgens 100.000 cellen in 300 µL PBS met twee procent foetaal runderserum.Meet vervolgens de EGFP-expressie via flowcytometrische analyse. Oogst nog eens 0,5 tot vijf miljoen getransduceerde cellen voor de preparatie van genomisch DNA en de daaropvolgende restrictie-enzymdigestie. Zet vier restrictie-enzymdigesties per monster op in 1,5 milliliter buisjes.Verteer 0,1 tot 1 µg G-DNA in elke buis door 10 units TRU91 en 1 µL buffer M per monster toe te voegen in een eindvolume van 10 µL. Pipetteer 2 µL van het mengsel in de digestiebuizen.Incubeer de reacties vervolgens gedurende zes uur of overnacht bij 65 °C. Voeg na de incubatie 40 µL water toe aan een buisje van 1,5 mL. Voeg in hetzelfde buisje 10 units PST1 en 1 µL buffer H per monster toe.Pipetteer 10 µL van het digestiemengsel in de digestiebuisjes. Incubeer de reacties gedurende zes uur of overnacht bij 37 °C. Zet de volgende dag acht linker-ligatiereacties op in 1,5 mL buisjes.Voeg voor elke reactie het ligasereactiemengsel toe aan 10 µL van het gedigesteerde genomische DNA. Incubeer gedurende drie tot zes uur bij 16 °C. Zet voor de eerste ronde PCR 48 PCR-reacties op in 0,2 mL buisjes.Voeg voor elke PCR het reactiemengsel met de linker-primer en de MLV3 prime LTR-primer toe aan twee microliters van de ligatiereactie. Plaats de monsters in een thermocycler met verwarmde klep. Stel de cyclingsparameters in en voer de eerste ronde van de PCR-reactie uit.Stel voor de tweede ronde PCR het reactiemengsel samen, inclusief de linker nested primer en de MLV3 prime LTR nested primer. Voeg vervolgens twee µL van het PCR-product uit de eerste ronde PCR toe als template. Voer daarna de tweede ronde PCR-reactie uit om de uiteindelijke LN PCR-producten te genereren.Na de tweede ronde PCR worden de 48 nested LM PCR-reacties verzameld in een buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens 20 microliters laadbuffer toe aan 100 microliters van het gepoolde en geprecipiteerde LM PCR-product. Laad het monster vervolgens op een agarosegel van één procent, samen met de 100 base pair DNA-ladder.Voer de gel door bij vijf volt per centimeter gedurende 30 tot 60 minuten; zodra de banden gescheiden zijn, snijdt u het deel van de gel uit dat amplicons van 500 tot 150 baseparen lang bevat. Nadat het LM PCR-product is gezuiverd met een kolomgebaseerde gel-extractiekit, meet u de concentratie met een UV-spectrofotometer voordat u overgaat tot de library-preparatie. Evalueer daarnaast de lengte van de LM PCR-producten met een bioanalyzer-instrument volgens de instructies van de fabrikant.Bereid de bibliotheek voor door een indexerings-PCR op te zetten. Gebruik voor elke PCR 150 tot 170 nanogram gezuiverd LM PCR-product, met een verschillende indexcombinatie voor elk monster. Voer de PCR uit in een thermocycler met verwarmde klep zoals aangegeven.Verdun na de PCR de gezuiverde library tot 10 nanomolair met 10 millimolair tris HCL. Meng vervolgens vijf microliter van de verdunde pool met vijf microliter 0,2 newton natriumhydroxide in een nieuwe 1,5 milliliter buis. Vortex kort, centrifugeer en incubeer daarna vijf minuten bij kamertemperatuur om de libraries te denatureren.Plaats de buisjes met gedenatureerde pool op ijs en voeg 990 µL vooraf gekoelde HT1-hybridisatiebuffer toe. Aliquoteer vervolgens 300 µL van de gedenatureerde pool in een nieuw buisje van 1,5 mL. Voeg 300 µL vooraf gekoelde HT1 toe om een uiteindelijke library pool van 10 pM te verkrijgen.Meng parallel 10 nanomolair van de vaste controlebibliotheek in een volume van twee microliter met 3 microliter 10 millimolair tris HCl in een 1,5 milliliter buis. Voeg vijf microliter 0,2 newton natriumhydroxide toe en vortex kort. Na het centrifugeren, incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om de verdunde fix te denatureren.Plaats de buis na de incubatie op ijs en voeg 990 µL vooraf gekoelde HT1 toe. Pipetteer nu 100 µL van de gedenatureerde fix in een nieuwe buis van 1,5 mL en voeg 300 µL vooraf gekoelde HT1 toe om een uiteindelijke concentratie van 10 pM fix te verkrijgen. Meng tot slot in een nieuwe buis van 1,5 mL 510 µL van de gedenatureerde library pool met 90 µL van de gedenatureerde fixed library, zodat een uiteindelijke pool van 10 pM met 15% fix-controle wordt verkregen voor sequencing.Deze afbeelding toont de analyse van respectievelijk 3498, 2989 en 4103 clusters van recurrente MLV-integratieplaatsen in hematopoëtische stam- en progenitorcellen, erytroïde progenitoren en myeloïde progenitoren. In elke celpopulatie overlapte meer dan 95% van de MLV-clusters met epigenetisch gedefinieerde enhancers en promotors. Celspecifieke MLV-doelregio's waren sterk geacetyleerd en geassocieerd met de celspecifieke expressie van het doelgen.Voorbeelden zijn de promotor van het HSP-specifieke SPINK2-gen. De locus-controlregio die potente enhancers bevat van de erytroïde-specifieke bèta-achtige globinegenen. Enhancers die stroomopwaarts van het NPP-specifieke LYZ-gen liggen.Luciferase reporter-assays valideerden de subset van cel-specifieke MLV-getargette enhancers in EPP en MPP. Erythroïde-specifieke MLV-getargette regio's vertoonden een hogere activiteit in EPP dan in MPP en vice versa, wat bevestigt dat MLV cel-specifieke enhancers identificeert die mogelijk de expressie van nabijgelegen genen reguleren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één week worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de frequentie van getransduceerde cellen te maximaliseren voor een optimale terugwinning van de integratieplaatsen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het in kaart brengen van virale integratieplaatsen door eerst het genomisch DNA aan te passen, vervolgens de genomische fragmenten te ligeren met een DNA-linker, daarna de junctie tussen het gastgeurgenoom en het virus te amplificeren via LM-PCR en tot slot de amplicon-bibliotheek via deep sequencing te analyseren.

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen...

Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Leer retrovirale scanning om integratieplaatsen van MLV-vectoren in menselijke cellen in kaart te brengen. Deze methode identificeert celspecifieke regulerende regio's voor gentherapie-onderzoek.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio's te definiëren

Meer video's verkennen