간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

본 실험 절차의 전반적인 목적은 DNA를 따라 이동하는 분자의 수송을 연구하기 위해 간단하고 견고하며 처리량이 높은 단분자 유동 신장 분석법(single molecule flow stretching assay)을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 biotin 표지 oligo를 lambda-DNA에 결합하여 biotin 표지 lambda-DNA를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 1단계 반응 프로토콜에 따라 Polyethylene Glycol 또는 PEG 기능화 커버슬립을 준비하는 것입니다.

다음으로, 미리 채널이 절단된 양면 테이프를 PEG 기능화 커버슬립과 입구 및 출구 구멍이 있는 폴리디메틸실록산(PDMS) 슬랩 사이에 끼워 고처리량 유동 셀을 제작합니다. 마지막 단계는 타임랩스 전반사 형광(TIRF) 이미징을 사용하여 유동 채널 내 단일 형광 분자의 궤적을 추적하는 것입니다. 흐름에 의해 신장된 lambda-DNA를 따라 확산되는 단일 분자의 궤적을 식별하기 위해, 신뢰할 수 있고 효율적인 맞춤형 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용하여 원시 형광 이미지를 분석합니다.

다른 대안들에 비해 이 분석 구성의 주요 장점은 커버슬립 준비의 신뢰성, 더 높은 처리량, 시료 준비에 소요되는 수작업 시간의 단축, 그리고 더욱 효율적인 비감독 데이터 분석입니다. 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Kan Xiong이 진행하겠습니다. 분석을 시작하기 전에 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 필요한 모든 시약을 준비하십시오.

0.5 mg/mL lambda-DNA 스톡을 65 °C에서 60초 동안 가열한 후 즉시 젖은 얼음에 담급니다. 마이크로원심분리관 내에서 lambda-DNA 용액 100 µL와 10 µM biotin-labeled oligo 2 µL를 혼합합니다. 혼합물을 65 °C에서 60초 동안 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각합니다.

혼합물을 얼음에 놓습니다. T4 DNA ligase 반응 버퍼 11 µL를 첨가하고 부드럽게 섞습니다. 그다음 800 units에 해당하는 T4 DNA ligase 2 µL를 넣고 부드럽게 섞습니다.

혼합물을 16°C에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 분자량 컷오프(nominal molecular weight limit)가 100 kDa인 원심분리 필터 튜브를 사용하여 생성물을 정제합니다. 염색병에 넣은 1번 커버슬립을 95% ethanol로 10분 동안 초음파 처리한 다음, 초순수로 3회 헹굽니다.

염색 용기에 1 M 수산화칼륨을 채우고 다시 10분 동안 초음파 처리한 후, 초순수로 3회 헹굽니다. 이 과정을 2회 반복합니다. 깨끗하고 건조한 질소 가스 흐름 하에서 커버슬립을 건조합니다.

900 millitorr 압력에서 5분 동안 에어 플라즈마 처리를 하여 커버슬립을 추가로 세척하고 건조합니다. 95% ethanol에 녹인 25 mg/mL silane-polyethylene glycol-biotin 50 µL와 함께 커버슬립을 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 초순수로 과량의 polyethylene glycol을 씻어내고, polyethylene glycol이 코팅된 커버슬립을 깨끗하고 건조한 질소 가스 흐름 하에서 건조합니다.

CAD 소프트웨어를 사용하여 유체 채널을 설계하고, 테이프 커터를 이용해 양면 테이프에 채널을 절단합니다. 채널 내부의 테이프 잔여물을 제거합니다. PDMS 슬래브를 제작하려면, 믹서를 사용하여 45 g의 PDMS와 5 g의 가교제를 충분히 혼합합니다.

혼합물을 두 개의 100 millimeter 페트리 접시에 붓고, 모든 기포가 사라질 때까지 약 30분 동안 진공 챔버 안에 둡니다. PDMS가 경화될 때까지 80 degree Celsius 오븐 안에 약 2시간 동안 둡니다. 채널이 미리 절단된 양면테이프의 크기에 맞게 PDMS 슬래브를 잘라냅니다.

양면테이프에서 보호 필름 하나를 벗겨내고 PDMS 슬래브의 평평한 면에 부착합니다. 23게이지 바늘이 장착된 생검 홀 펀처를 사용하여 PDMS 슬래브에 배출구와 유입구 구멍을 뚫습니다. 양면테이프의 나머지 보호 필름을 벗겨내고 커버슬립의 기능화된 표면에 부착합니다.

조립된 플로우 셀을 현미경 스테이지 인서트에 고정합니다. 모든 탈기된 시약을 리저버에 채웁니다. 리저버에는 솔레노이드 밸브에 연결된 Tygon 튜빙과 시약의 역류를 방지하는 PEEK 튜빙에 연결된 또 다른 튜빙이 연결되어 있어야 합니다. 시약의 흐름은 스크립트 프로그래밍 애플리케이션으로 제어되는 솔레노이드 밸브에 의해 조절됩니다.

공백 버퍼를 흘려 하나의 유로 채널을 프라이밍합니다. 나머지 세 개의 PEEK 튜브를 입구 구멍에 삽입합니다. 이때 채널 내부에 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오.

Tygon 튜빙과 짧은 PEEK 튜빙을 사용하여 배출구 구멍을 시료 폐기 용기에 연결하십시오. 0.2 mg/mL Streptavidin 용액을 흘려주고 5분 동안 배양하십시오. 그 다음, 결합되지 않은 Streptavidin을 씻어내기 위해 공백 버퍼를 흘려보내십시오.

1 mg/mL bovine serum albumin 용액을 흘려주고 1분 동안 배양합니다. 그다음, 결합되지 않은 bovine serum albumin을 씻어내기 위해 공백 버퍼를 흘려줍니다. 100 pM biotin-lambda-DNA 용액을 흘려주고 10분 동안 배양합니다.

그 다음, 결합되지 않은 lambda-DNA를 씻어내기 위해 공버퍼를 흘려줍니다. PEG가 기능화된 커버슬립의 품질을 확인하려면 SYTOX Orange 염료와 같은 DNA 염색 염료를 흘려준 후 형광 이미징을 시작합니다. 커버슬립의 품질이 좋다면, 유동으로 신장된 lambda-DNA의 밀도가 높게 나타날 것입니다.

또한, 거의 완전히 유동 연신된 lambda-DNA 이미지에서 가장 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있도록 TIRF 각도를 조정하십시오. 단일 분자의 궤적을 추적하려면, 새로운 채널 내부에서 배양을 시작한 다음 시린지 펌프를 사용하여 충분히 높은 유속으로 서브나노몰 농도의 형광 표지 분자들을 융합시키고, 100 Hertz의 프레임 속도로 타임랩스 형광 이미지를 수집하십시오. 일반적으로 하나의 시야에서 10,000 프레임을 수집하며, 여러 시야에서 영상을 수집합니다.

마지막으로, DNA 염색 시약을 다시 흘려주어 DNA가 여전히 유동 연신(flow stretched)될 수 있는지 확인합니다. DNA를 따라 확산되는 단일 분자의 궤적을 식별하기 위해 맞춤형 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용합니다. 이 소프트웨어는 먼저 높은 정확도로 단일 입자의 중심 위치를 결정합니다.

커버슬립 표면에 붙어 있는 입자들을 제거한 다음, 서로 다른 프레임에 있는 입자들을 연결하여 타임랩스 궤적을 생성합니다. 이 궤적들로부터 1D 확산 계수를 추정합니다. 데이터 분석을 시작하려면 스크립트 프로그래밍 애플리케이션을 열고 단일 입자 추적 소프트웨어의 디렉터리로 이동하십시오.

largedataprocess3.m라는 이름의 스크립트를 엽니다. 정의해야 할 중요한 매개변수 중 하나는 단일 입자 검출을 위한 임계값입니다. 최적의 임계값을 결정하려면 determine_threshold_value를 실행하십시오.

m 스크립트입니다. 이 스크립트는 임계값이 단일 입자 검출에 미치는 영향을 시각화합니다. 최적의 임계값을 결정한 후, largedataprocess3를 실행하십시오.

m 스크립트입니다. 단일 입자 추적 분석이 완료되면, trajectory_filtering.m 스크립트를 실행하여 가공되지 않은 궤적을 필터링합니다.

필터링 단계를 시각화하기 위해 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 구축합니다. GUI 패널에서 DNA를 따른 최소 변위인 MinXDisp를 2픽셀로 설정합니다. DNA에 수직인 최대 변위인 MaxYDisp를 2픽셀로 설정합니다.

최소 프레임 수인 minFrames를 10으로 설정하십시오. 트리플렛의 최소 상태 수인 minTriplets를 10으로 설정하십시오. DNA를 따른 최소 확산 계수인 D_par를 0으로 설정하십시오.

DNA에 수직인 방향의 최대 추정 확산 계수 D_trans를 10 mega base pair squared per second로 설정하십시오. 최소 통계 파라미터 Chi2 Stat를 -5로 설정하십시오. DNA를 따른 변위와 DNA에 수직인 변위의 최소 비율 MinX/Y를 2로 설정하십시오.

이 필터링 파라미터를 통과한 모든 원본 궤적은 표 1에 나열되며, 통과하지 못한 궤적은 표 3에 나열됩니다. 표 1에서 궤적 번호를 클릭하십시오. 해당 궤적이 그래픽 1과 2에 표시됩니다.

재생 버튼을 클릭하여 원본 형광 이미지를 재생하십시오. 이 궤적이 단일 분자 슬라이딩 궤적인 경우 'table2에 추가'를 클릭하십시오. 마지막으로, GUI를 닫을 때 table2에 추가된 모든 궤적이 저장됩니다.

모든 필터링 단계를 통과한 궤적들을 하나로 모아 평균 확산 계수를 추정합니다. 평균 확산 계수를 계산하려면 calculate_mean_diffusion_constant.m 스크립트를 실행하십시오. 이 절차는 인비트로(in vitro) 단일 분자 생물물리학을 연구하는 많은 연구자들에게 도움이 될 것입니다.