Name: 펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 자동 면역-MALDI(iMALDI) 기술을 사용하여 복잡한 생물학적 유체에서 펩티드와 단백질을 정량화하는 방법을. 이 기술은 조기 질병 진단과 치료 모니터링을 위한 고감도 바이오마커 분석에 활용됩니다.

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우리 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 (204PRO) 운영 및 기술 개발 (214PRO)에 대 한 재정 지원을 게놈 혁신 네트워크 (진)을 통해 감사합니다. 우리는 촬영 MALDI TOF 악기의 사용에 대 한 맥 길 대학 건강 센터의 연구소에서 약물 검색 플랫폼을 감사합니다. H.L. 국가 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에서 박사 후 친목에서 지원에 대 한 감사입니다. C.H.B 감사 지원을 위해 앞 가장자리 기부금 펀드 (LEEF)에서 이다. C.H.B. 맥 길 대학 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에서 분자 종양학 시걸 맥 길의 자에서 지원에 대 한 감사입니다. M.X.C.와 C.H.B.는 유태인 종합 병원 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에 워렌 Y. Soper 자선 신탁 및 앨빈 시걸 가족 재단에서 지원에 대 한 감사.

아래에 설명 된 시 약의 양을 20 환자 혈장 샘플의 측정 기준. 프로토콜 다음과 아래 빅토리아 대학교의 가이드라인 제시 &#39; s 인간 연구 윤리 위원회.
 1. 세대의 중앙 인간 플라스마에서 나 <ol><li>녹여 플라즈마 샘플 (&#8805; 200 µ L) 방에 온도 물 5 분, 목욕 하 고 완전히 해 동 때까지 얼음에 샘플을 넣어 다음.</li>
	<li>1.1 mL 깊은 잘 격판덮개 (샘플 접시)의 웰 스를 분리 하 고 접시 2 ° C와 1278 x g.에서 10 분 원심 분리기에 원심을 수동으로 각 플라즈마 샘플의 전송 200 µ l</li>
	<li>는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여 직렬로 6 교정기 솔루션 치킨 난 백 알 부 민을 준비 500 fmol / µ L 중앙 나 NAT 표준 솔루션을 희석 (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17.2 fmol / µ L).</li>
	<li>피펫은 200 µ L의 세대의 잘, 그리고 125 µ L 각 교정기 버퍼 샘플 접시. 
	참고: 버퍼링 된 식 염 수 (PBS) 버퍼 갓 실험 당일에 준비 해야 하는 인산 염에 CEWA.</li>
	<li>는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여, 새로운 접시에 섞어 표면에 뜨는 플라즈마의 125 µ L 또는 PBS에 CEWA의 125 µ L 중앙의 25 µ L 나 세대 버퍼, 0.2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 트리 스 1 M, 1 mM 포함 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF). 
	참고: 준비는 중앙 난 1 M Tris/0.2 mM EDTA 수성 버퍼를 혼합 하 여 세대 버퍼 (pH 5.5에 조정 초 산을 사용 하 여) PMSF 솔루션 메탄올 (100 mM). 두 솔루션 모두 실험의 날에 4 ° C. 믹스 두 솔루션에서 1 개월을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>자동으로 96 잘 접시, 3 복제 솔루션 당, 잘 당 34 µ L로 솔루션을 전송합니다. 3 h. 위해 37 ° C에서 접시를 품 어</li>
</ol> 2. 중앙의 면역-농축 나 사용 하 여 항 체 코팅 구슬 <ol><li>자기 단백질 G 구슬에 항 체의 활용 참고: 구슬와 항 체의 활용은 중앙 3 h 동안 수동으로 수행 나 생성 기간에는 실험의 하루입니다. 다른 analytes에 대 한 활용된 구슬 속성 및 항 체의 안정성에 따라 3 개월 이상, 4 ° C에서 동작 하는 0.015% 챕 (PBSC)를 포함 하는 PBS 버퍼에 저장할 수 있습니다.
	<ol><li>전송 110 µ L (충분히 20 샘플을 측정 하 고 6-포인트 표준 곡선을 만들기 위한) 구슬 슬러리의 1.5 mL 튜브에. 구슬 7 번의 25% 이기/PBSC, 1 mL와 함께 세 번 PBSC의 1 mL 씻으십시오. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 작은 각 세척 단계 사이 구슬. 후에 마지막 워시 워시 버퍼를 제거 
		참고: 25 %7 번 세척 이기/PBSC은 트윈-20 등 구슬 슬러리에 MS-호환 되지 않는 첨가물 제거 중요 합니다. 이 광범위 한 세척 단계 필요 하지 않을 수 있습니다 선택 된 구슬에 같은 첨가제 경우.</li>
		<li>PBSC의 110 µ L에 구슬 resuspend 및 안티 중앙의 110 µ L 추가 나 항 체 (최종 항 체 농도: 100 µ g/mL). Pipetting, 구슬 및 솔루션을 혼합 하 고 다음 1 시간, 8 rpm에 회전에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어.</li>
		<li>구슬 PBSC의 1 mL로 3 번 세척 하 고 PBSC의 1100 µ L에서 resuspend. 
		참고: 경우 어떤 구슬 솔루션은 외피 동안 튜브의 캡으로 흘 렀 다, 스핀 2680 x g.에서 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 솔루션 다운</li>
		<li>96 잘 접시 (구슬 표준 접시)에 구슬 솔루션을 수동으로 전송합니다. 자동된 액체 처리 시스템을 약 수 같은 96 잘 접시, 당 잘. 120 µ L에 구슬 사용</li></ol></li> <li>구슬에 면역-농축 <ol><li>중앙 3 h 나 생성 기간 배양 접시에 배치 후 리안 나의 세대를 종료 10 분을 위한 아이스</li>
		<li>자동으로 SIS 펩 티 드 재고 솔루션 (10 pmol/μ) 약 희석 PBS를 가진 버퍼, 그리고 자동으로 추가 약 96 잘 PCR 접시에 안정적인 isoptope 표준 펩타이드 희석 수. 외피 격판덮개의 각 음에 1.5 µ L의 안정 동위 원소 표준 (SIS) 펩 티 드 솔루션 (100 fmol 포함)을 전송 하 고 플라즈마 샘플 또는 PBS 버퍼에 CEWA와 함께 섞어.</li>
		<li>자동으로 비드 솔루션 잘 당 10 mL에 외피 격판덮개의 내용을 전송, 혼합.</li>
		<li>8 rpm에 회전 하는 동안 1 시간에 4 ° C에서 접시를 품 어.</li>
		<li>씻어 구슬 세 번 자동으로 5 m m 염화 중 탄산염 (AmBic) 솔루션, 잘 세척 당 당 100 µ L. 마지막 세척 후 5mm 각 잘에서 AmBic 솔루션의 7 µ L에 구슬 resuspend. 자석 마지막 워시 후 하단에 비즈를 사용 하 여</li>
	</ol></li></ol> 3. MALDI 표적 격판덮개 및 추가 매트릭스 솔루션에 구슬의 전송 <li>2600의 점 크기를 자동으로 MALDI 표적 격판덮개에 구슬 슬러리의 전송 7 µ L <ol>µ m. 구슬 밖으로 건조 하자. 
	참고: 작은 USB 전원 팬 비드 건조 과정을 가속 화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>자동으로 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (HCCA)의 2 µ L 추가-각 샘플 대상 접시에 자리에 잘 매트릭스 매트릭스 솔루션 (3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL 암모늄 시트르산, 70% 이기, 그리고 0.1 %trifluoroacetic 산 포함) .</li>
</ol> 4. MALDI TOF MS 및 데이터 분석에 의해 인수 신호 긍정적인 반사 모드를 사용 하 여 MALDI TOF 악기와 <ol><li>분석 샘플 명소. 내부 교정, 데이터 스무 딩, 및 공급 업체 특정 소프트웨어와 함께 자동으로 초기 빼기 수행. 
	참고: (긍정/부정, 선형/반사판) 선택한 모드 MALDI TOF 측정 대상 펩 티 드 또는 단백질에 따라.</li>
	<li>상대 응답 비율 (Nat/SIS 강도 비율)를 계산 하 고 각 샘플의 농도 중앙의 결정 하기 위해 표준 곡선에 그것을 비교. PRA 어디 방정식 (1)를 사용 하 여 계산 δ t 중앙 난 세대 중앙 I.의 생성에 사용 된 시간을 나타냅니다 
	PRA = [중앙 난] / δ t 중앙 난 세대 (1)</li></ol>

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</ol>

C.H.B은 iMALDI 기술에 특허를 보유 하고있다.

기존의 MS 기반 단백질 정량화에 비해, iMALDI는 analytes 풍부 하 고 따라서 단백질 또는 펩 티 드 낮은 농도에서 정할 수 있도록 복잡 한 샘플에서 그들을 정화 하 항 체를 사용 합니다. IMALDI 프로토콜에 중요 한 단계는 대상 펩 티 드의 면역 농축입니다. 이 목적에 대 한 선호도와 높은 특이성 항 체를 선택 합니다. SISCAPA에서 그것은 10-9 M 또는 더 나은에서 항 체 친 화력 낮은 ng/mL21에서 높은 감도 달성 하기 위해 필요한 것 보고 되었습니다. 또한, 높은 항 체 바인딩 용량 구슬 최적의 농축에 대 한 선호 됩니다.
그것은 또한 최소한의 배경 수준 대상 분자에 대 한 비교적 "깨끗 한" 스펙트럼을 생성 하는 것이 중요입니다. 높은 신호 대 잡음 비율 면역 농축 단계 후에 세척 하는 광범위 한 구슬을 통해 얻을 수 있습니다. 또한, 우리 후 추가 및 매트릭스 솔루션 건조 잡음 신...

질량 분석 양적 proteomics에 불가 결 한 도구가 되고있다. 질량 분석 대상 단백질 또는 펩 티 드의 질량을 확인할 수 있습니다, 그리고 따라서 취득된 분석 신호 수 있습니다 매우 구체적인 immunoassays에 비해. 2 개의 이온화 방법, 분무 및 MALDI, 가장 일반적으로 단백질 및 펩 티 드1,2,,34를 탐지 하는 데 사용 됩니다. MS 기반 단백질 정량화의 주요 과제는 높은 풍부한 단백질의 ng/mL 또는 pg/mL 농도에서 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 단백질의 검출에 거짓말 그리고 인간 플라스마에서 발견 많은 후보 단백질 바이오 마커 내이 범위5. 이 문제는 대부분 본질적으로 넓은 동적 범위와 인간 프로테옴6의 복잡성에 의해 발생 됩니다.
극복 하기 위해 이러한 탐지 과제, 면역 MS 방법은 대상 단백질 또는 펩 티 드 고체 표면에 샘플 솔루션에서 풍부 하 게 개발 되었다 뒤에 analytes과 MS 측정7,8 의 차입 , 9 , 10. 면역 강화 통해는 analytes 복잡 한 샘플에서 순화 된다 그리고 다른 분자에서 이온 억제 효과 최소화 하는 따라서. 다양 한 고체 지원 중 자석 구슬은 현재 가장 널리 사용으로 높은 항 체 바인딩 용량의 장점 및 취급의 용이성. 마그네틱 구슬 다른 functionalizations와 크기를 개발 하 고 immunoprecipitation 실험에 대 한 상용화 되었습니다. 날짜 하려면, immuno-농축 구슬에는 되었습니다 인터페이싱 분무 이온화 (ESI)과 MALDI MS 단백질 및 펩 티 드 측정에 대 한. 안정 동위 원소 표준 및 안티 펩 티 드 항 체 (SISCAPA) 기술에 의해 캡처, 샘플에서 단백질 소화는, 면역 강화에 대 한 항 체 코팅 구슬 부 화 뒤. "클래식" SISCAPA에서 캡처된 proteotypic 펩 티 드, 구슬에서 eluted 있으며 측정 하 여 액체 착 색 인쇄기-ESI-석사 (LC-석사), 또는 직접적인 주입 ESI-다중 반응 모니터링-석사 (ESI-MRM-석사)11,12. 면역-농축 향상 MRM 분석 결과 감도 3-4 배나 낮은 ng/mL 범위13도달.
분무 MS에 비해, MALDI MS 빠릅니다, 그리고 포함 하지 않는 청소 및 LC 열의 재 평형 carryover 및 오염 문제가 없습니다 그래서 높은 처리량 연구14를 위해 더 적당 한 만들기. 와 결합 하 여 면역-농축 MALDI MS 펩 티 드와 단백질 (proteotypic 펩 티 드의 정량 기준)의 과민 하 고 특정 정량화에 대 한 우리의 실험실에서 면역 MALDI 기술 개발 되었습니다15,16 ,17. 면역-농축 후 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 예금 하 고 매트릭스 솔루션 구슬에 추가 하 고 접시 건조 후 MALDI TOF MS 분석에 대 한 준비가 되어. 구슬에서 펩 티 드의 차입 별도 단계로 수행 되지 않습니다 하지만 선호도 바인딩된 analytes는 eluted MALDI 매트릭스 솔루션에 의해 비드 관광 명소, 그로 인하여 시료 준비를 단순화 하 고 샘플 손실 최소화에 추가 되 면. IMALDI 기술 다양 한 애플 리 케이 션18,19에 적용 된 및 최근에 자동화 되었으며 안 측정에 사용 되 나 (중앙 난) 플라즈마 renin 활동 (PRA)20결정. 이 프로토콜은 자동된 iMALDI 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 절차를 시연할 예정 이다. 예를 들어, 10% 미만의 간 날 CVs 프라 분석 결과 복용 하루20당 744 샘플 측정 기능으로 자동화를 통해 달성 되었습니다.
이 원고에서 iMALDI PRA 분석 결과 대상 분자로 단백질 소화를 요구 하지 않는다 (중앙 나) 1295.7 Da의 분자 무게 펩 티 드 이다. 다른 분석 실험 단백질 소화 필요 하 고 펩 티 드 그대로 단백질 대리로 사용 되에서 iMALDI에 대 한 선택 된 펩타이드 독특하고 800 다 그래서 그는 c에서 쉽게 구별 될 수 있다 이상의 질량을 가진 대상 단백질에 특정 해야 MALDI 매트릭스 솔루션에서 hemical 잡음입니다. 안티 펩 티 드 항 체는 면역 강화는 펩 티 드에 대 한 필요 합니다. PRA를 측정 하는 iMALDI 분석 결과 대 한 프로토콜 4 단계로 구성: 1) 중앙의 세대 나 인간의 플라즈마; 2) 중앙의 면역-농축 항 체 코팅 구슬;를 사용 하 여 나 3) 이전 비즈는 MALDI 표적 격판덮개 추가 매트릭스 솔루션; 그리고 4) MALDI TOF MS 및 데이터 분석20수집을 신호.

<table><tbody><tr><td>건강한 제어 인간 플라즈마</td><td>생물 재생</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 암모늄</td><td>시그마 알드리치</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>구연산 암모늄 이염기</td><td>성 시그마 알드리치</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>시그마 알드리치</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자위의 알부민(>98%)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>, 시그마 알드리치</td>, <td>EDS,</td><td></td></tr><tr><td>알파-시아노-4-하이드록시신남산</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>70990</td><td></td></tr>, <tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr>, <tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>78830</td><td></td></tr>, <tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS 등급</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td>, <td>Fluka</td><td>34967</td>, <td>LC-MS 등급</td></tr>, <tr><td>물</td><td>, Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS 등급</td></tr><tr>,<td>아세트산</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS 등급</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td>, <td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 마그네틱 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I 염소 다클론 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat and SIS Ang I</td><td>synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid handling system</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotic workstation</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 자</td></tr><tr><td>석 튜브 회전기</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>자석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 측면 스커트 자석</td></tr><tr>자<td>석</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td>은 비드를 웰 MALDI-TOF Bruker Bruker <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Microflex LRF 기기의</td></tr> 바닥으로 당기는 데 사용됩니다.</tbody></table>

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

질량 분석 (MS)는 각 대상 분자의 질량 대 전 비의 직접적인 탐지 결과로 우수한 시험으로 복잡 한 견본에서 단백질을 측정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 기술 중 하나입니다. 그러나, 대부분의 다른 분석 기법 처럼 MS 기반 proteomics, 높은 풍부 analytes 측정으로 편견을가지고, 그래서 그것을 달성 하기 위해 도전 검색 낮은 ng/mL의 제한 또는 복잡 한 예제 및 이것에서 pg/mL은 많은 농도 범위 biofluids 인간 플라스마 등에서 질병 관련 단백질. 낮은 풍부한 analytes의 검색에서을 돕기 위해, 면역 강화에 집중 하 고 순화 MS 측정, 시험 감도 크게 향상 하기 전에 분석 분석 결과 통합 되었습니다. 이 작품에서는, 면역 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 (iMALDI) 기술은 단백질과 펩 티 드 biofluids에의 정량화에 대 한 제시, 구슬에 면역-농축에 따라, 사전 차입 없이 MALDI MS 측정 뒤. 안티 펩 티 드 항 체는 자성 구슬에 기능성 고 샘플 incubated. 세척, 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 직접 전송 됩니다 후 신호 매트릭스 솔루션 구슬에 적용 된 후 MALDI 시간의 비행 (TOF MALDI) 악기에 의해 측정 됩니다. 샘플 준비 절차는 다른 면역 MS 분석 실험에 비해 간소화 하 고 MALDI 측정은 빠르다. 전체 샘플 준비 향상 된 분석 결과 재현성 및 높은 처리량 처리 시스템, 액체 자동입니다. 이 문서에서는, iMALDI 분석 결과 펩 티 드 안을 결정 하는 데 사용 되 나 (중앙 나) 기본 aldosteronism (PA)의 심사에 대 한 플라즈마 renin 활동의 판독으로 임상으로 사용 되는 플라즈마에 농도.

중앙을 측정 하기 위한 자동화 된 iMALDI 절차 나 그림 1에 표시 됩니다. 대상 펩 티 드 (내 인 성 펩 티 드 또는 소화 단백질에서 펩 티 드) 안티 펩 티 드 자석 구슬에 풍성 하 게 하 고 구슬 MALDI 측정 대상 접시에 전송 됩니다. 전체 프로시저 추가 펩타이드 차입 단계를 필요로 하는 다른 면역-MS 기술에 비해 간단 합니다. IMALDI 분석 결과의 자동화와 10 20아래 편차 (CV)의 간 날 계수 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석 할 수 있습니다. 중앙을 측정 하 여 얻은 대표적인 스펙트럼 인간의 플라즈마 샘플에 난 그림 2에 표시 됩니다. SIS 펩 티 드는 펩 티 드 정량에 대 한 내부 표준으로 작동합니다. 프라 프라 값 임상 LC-MS/MS 절차17 ...

자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

이 자동화된 immuno-MALDI 분석의 전반적인 목표는 복잡한 생물학적 유체 내의 펩타이드와 온전한 단백질을 정확하고 민감하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 진단을 위해 단백질 수준을 정량화하거나 환자의 치료 반응을 모니터링하는 것과 같이 정량 단백질체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 핵심 장점은 복잡한 시료로부터 단백질 수준을 매우 민감하고 정확하게 정량화할 수 있다는 점입니다.이 기술은 분석의 면역 농축 단계 덕분에 저농도의 단백질 및 펩타이드 바이오마커를 정량할 수 있어 질병의 조기 진단이 가능합니다. 이 방법은 혈장 레닌 활성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 예후, 진단 및 치료 관리를 위한 암 관련 단백질 정량과 같은 다른 질환 관련 연구에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 인체 혈장 샘플을 실온의 워터 배스에서 5분 동안 해동하십시오.그 다음, 샘플이 완전히 녹을 때까지 얼음 위에 둡니다. 이어서, 각 혈장 샘플 200 µL를 1.1 mL 딥웰 플레이트의 개별 웰로 수동으로 옮깁니다. 플레이트를 2 °C, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리합니다.그런 다음, Bravo를 사용하여 500 femtomole per microliter Ang-1 NAT 표준 용액을 단계 희석하여 chicken egg white albumin으로 6개의 교정 용액을 준비합니다. 원심분리 후, 각 교정 용액 200 microliters를 웰에 피펫팅하고 125 microliters의 generation buffer를 샘플 플레이트에 넣습니다. 자동 액체 핸들링 시스템을 사용하여, 1.1 milliliter deep well 플레이어에 혈장 상층액 125 microliters 또는 chicken egg white albumin 용액 125 microliters를 angiotensin I generation buffer 25 microliters와 혼합합니다.이제 각 용액을 96-웰 플레이트로 자동 분주하며, 용액당 3회 반복 측정하고 웰당 34 µL씩 분주합니다. 그 다음, 플레이트를 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 항체를 Protein G 비드와 접합시키기 위해, 먼저 이전에 준비한 비드 슬러리 78 µL를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.자석 스탠드를 사용하여 각 세척 단계마다 비드를 침전시키며, PBSC 내 25% acetonitrile 1 mL로 비드를 7회 세척하고 PBSC 1 mL로 3회 세척합니다. 비드 세척 후, 110 µL의 PBSC에 비드를 재현탁하고 110 µL의 anti-angiotensin I 항체를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 비드와 용액을 혼합합니다.그 다음, 비드를 8 rpm으로 회전시키며 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이후, 1 mL의 PBSC로 비드를 3회 세척합니다. 그런 다음, 1,100 µL의 PBSC에 비드를 다시 현탁합니다.이제 비드 용액을 96-웰 플레이트로 수동으로 옮깁니다. 그런 다음, Bravo를 사용하여 비드를 동일한 96-웰 플레이트에 분주합니다. 3시간의 angiotensin I 생성 기간이 지난 후, 배양 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 두어 angiotensin I 생성을 중단시킵니다. 안정 동위원소 표준 펩타이드 스톡 용액을 PBS 버퍼로 100배 자동 희석합니다.이어서, 안정 동위원소 표준 펩타이드 희석액을 96-웰 PCR 플레이트에 자동으로 분주합니다. 희석된 펩타이드 용액 10 µL를 배양 플레이트의 각 웰에 옮깁니다. 희석된 펩타이드 용액을 혈장 시료 또는 닭 달걀 흰자 알부민 용액과 혼합합니다.시료 또는 표준 용액을 비드 용액과 함께 배양 플레이트에 자동으로 추가하고 혼합합니다. 1시간 동안 배양한 후, 5 mM 중탄산암모늄 용액으로 비드를 3회 자동으로 세척합니다. 각 세척 단계 후에는 자석을 사용하여 비드를 바닥으로 끌어내립니다.마지막 세척 후, 비드들을 재현탁시키기 위해 각 웰에 10 µL의 탄산수소암모늄 용액을 첨가합니다. 비드 슬러리 7 µL를 스폿 크기가 2,600 µm인 MALDI 타겟 플레이트로 자동 전송합니다. 비드가 건조되면, 매트릭스 웰에서 미리 준비한 HCCA 매트릭스 용액 2 µL를 타겟 플레이트의 각 샘플 스폿에 자동으로 첨가합니다.그 다음, 양이온 리플렉터 모드를 사용하여 MALDI-TOF 기기로 샘플 스팟을 분석합니다. 제조사 전용 소프트웨어를 사용하여 내부 보정, 데이터 평활화 및 기선 보정을 수행합니다. 안지오텐신 I 측정을 위한 자동 iMALDI 절차를 통해 일내 변동 계수 10% 미만으로 대량의 샘플을 고속 분석할 수 있습니다. 인간 혈장 샘플에서 안지오텐신 I을 측정하여 얻은 대표 스펙트럼이 여기에 표시되어 있습니다.자동화된 iMALDI 분석법으로 얻은 188개 환자 샘플의 PRA 값과 임상 LC-MS/MS 절차를 사용하여 얻은 PRA 값의 상관관계가 여기에 나타나 있습니다. 두 방법의 상관계수는 0.98이며, 기울기의 차이는 서로 다른 내부 표준물질 또는 서로 다른 항체 사용으로 인해 발생했을 수 있습니다. 분석법의 선형 범위와 분석 정밀도가 여기에 표시되어 있습니다.이 기술을 숙달하면 약 5시간 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 팁 헤드와 액체 핸들링 속도를 적절하게 조정해야 함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 경구 염분 부하 검사나 생리식염수 주입 검사를 포함하여 환자의 원발성 알도스테론증을 확인하기 위한 추가적인 방법들을 사용할 수 있습니다.자동화된 iMALDI 기술을 통해 환자 샘플을 포함한 생물학적 샘플에서 질병 관련 단백질 또는 펩타이드를 특이적이고 정확하게 고처리량 정량 스크리닝할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 질량 분석 기반의 단백질 및 펩타이드 정량을 위한 자동화 iMALDI 분석법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 혈장과 같은 생물학적 샘플을 다루는 것은 매우 위험하므로, 절차를 수행하는 동안 항상 필요한 안전 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

우리는 인간의 혈청에서 낮은 분자량의 단백질과 펩티드의 선택적 회수를위한 mesoporous 실리카 박막을 기반으로 기술을 개발했습니다. 우리 mesoporous 칩 physico - 화학적 성질은 잘게 펩타이드 강화에 실질적인 컨트롤을 제공하며, 결과적으로 진단을 위해 혈청 프로테옴을 프로파일하기 위해 조정되었습니다.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

이 프로토콜은 선택된 반응 모니터링을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 정량화 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 마우스 대식세포 화학주성 신호전달 경로의 단백질을 정확하게 정량화하는 데 사용되었습니다. 표적 펩타이드 선택, 분석 개발, 정성적 및 정량적 분석이 자세히 설명되어 있습니다.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

배우세요 자동 면역-MALDI(iMALDI) 기술을 사용하여 복잡한 생물학적 유체에서 펩티드와 단백질을 정량화하는 방법을. 이 기술은 조기 질병 진단과 치료 모니터링을 위한 고감도 바이오마커 분석에 활용됩니다.

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

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