Name: 바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 DSC를 이용해 생체 분자의 폴딩 및 결합 상호작용을 빠르게 분석하는 방법을. 열 불안정 리간드를 사용하여 두 번의 실험만으로 열역학적 매개변수를 추출하고, 바이오칼로리메트리 및 신약 설계 연구에 활용할 수 있습니다.

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R. W. H. V 맥 길 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램 Bionanomachines에 의해 지원 되었다. A. K. M. 및 P. E. J. NSERC 보조금 327028-09 (A. K. M) 및 238562 (P. E. J.)에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>원하는 biomolecule13정화. 참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후.</li>
	<li>합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand13를 구입. 참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand thermolability에 대 한 부정적인 제어로 사용 되는 말라리아를 바인딩합니다.</li>
	<li>순화 biomolecule의 투 석 및 ligands (20 m m 인산 나트륨 및 140 m m NaCl 버퍼, pH 7.4, MN4와 여기에 사용 되는 ligands)의 해산에 대 한 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>투 석 튜브를 사용 하 여 버퍼의 적어도 2 L에 대하여 biomolecule dialyze-0.5와 1.0 kDa 잘라.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 철저 하 게 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 최종 버퍼 (작업 버퍼 라고도 함)를 필터링 합니다.</li>
	<li>그리고 무게는 ligands의 원하는 대 중에 밖으로 필터링된 작업 버퍼에 그들을 해산. 원하는 ligand 농도 대 중 정확 하 게 무게를 너무 작은 경우, 집중된 ligand 재고 솔루션 (예: 10 배)를 확인 합니다. 참고: 그것은 중요 한 모든 DSC 실험 활용 샘플에 대 한 동일한 작업 버퍼와 리간드, 즉, 적이 버퍼를 일으킬 것입니다로 ligand는 biomolecule 보다 작업 버퍼의 다른 배치에 녹아은 실험 수행 데이터에서 불일치 유물입니다.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 철저 하 게 작업 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 biomolecule 재고 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>흡 광도 측정에 의해 biomolecule 농도 결정 (260 nm MN4 280 같은 핵 산에 대 한 단백질에 대 한 nm).</li>
	<li>4 ° C 냉장고 (MN4와 여기에 사용 되는 ligands에 적합), 또는-20 준비 biomolecule 및 리간드를 저장 또는-80 ° C 경우 biomolecule 및 ligands 고정 및 장기 저장이 필요. 드가 테이블 상단에 버퍼, biomolecule, ligand 솔루션 degasser ( 재료의 표참조) DSC에 로드 하기 전에. 참고: Degassing 더 높은 온도에서 DSC에 거품 형성을 방지 도움이 됩니다. 거품 발생 신호 아티팩트 DSC 피크 모양 및 베이스 라인 애매.</li>
</ol>2. DSC 준비
<ol><li>DSC에서 압력 손잡이 나사 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 실행 하 고 참조 모 세관의 전면 플랜지 (금속 오프닝)에 연결 합니다.</li>
	<li>앞 예제 플랜지에 후방 참조 플랜지를 연결 하 여 참조 및 샘플 모세 혈관 사이 다리를 만듭니다.</li>
	<li>폐기물 플라스 크에 연결 된 진공 라인으로 실행 되는 후면 샘플 플랜지 실리콘 튜브의 조각을 연결 합니다.</li>
	<li>작업 버퍼의 200 mL와 함께 DSC를 진공 라인을 켭니다.</li>
	<li>작업 버퍼와 DSC의 참조 모 세관을 로드 합니다. 약 참조 모 세관 플랜지에 실리콘 튜브의 3-5 cm 섹션을 연결 합니다.</li>
	<li>후면 플랜지의 실리콘 튜브에 1 mL 피 펫 팁을 삽입 합니다. 작업 버퍼는 피 펫의 0.8 mL 그리고 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 버퍼 피 펫 팁을 삽입.</li>
	<li>부드럽게 통과 전면 실리콘 튜브를 통해 작업 버퍼 참조 모 세관으로 아래로 피 펫 플런저를 누르고 후면 플랜지로 최대 피 펫 팁 첨부. 작업 버퍼 레벨에 바로 앞 실리콘 튜브 위에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 누르십시오 다음 작업 버퍼 수준 바로 위에 후면 실리콘 튜브에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 놓습니다.<ol>
<li>반복 앞뒤로 거품의 참조 모 세관에서 볼륨을 제거 하는 작업 버퍼를 전달 합니다. 참고: 일반적으로, 앞뒤로 솔루션의 10 단계는 모든 거품을 취소 하기에 충분 한 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>엄지손가락으로 뒤쪽 피 펫 팁을 뚜껑을 부드럽게 후면 피 펫 팁에서에서 그들을 제거 참조 플랜지 연결 된 실리콘 튜브와 전면 피 펫에 잡아당깁니다.</li>
	<li>로드 단계 2.6 2.9에서 작업 버퍼 샘플 모 세관. 후면 참조에 검은 플라스틱 캡을 놓고 떠나 발견 전면 플랜지 플랜지를 샘플 합니다.</li>
	<li>압력 핸들을 첨부 합니다.</li>
	<li>DSC 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 파워 독서는 안정; 되 면 빨강 위쪽 인터페이스의 상단에 화살표를 클릭 하 여 악기를 기 압 및 DSC 전원 상단에 있는 상자에 표시 됩니다 악기 온도 및 압력 읽기 인터페이스의 오른쪽. 참고: 모니터 전원 DSC로 읽는 속도가 힘에 변화 보다 더 ~ 10 µW 데이터에서 아티팩트를 일으킬 수 있는 모 세관에 거품 형성을 나타냅니다. 솔루션 제거 되어야 하며 degassed 계속 하기 전에 추가.</li>
	<li>정방향 및 역방향 검색을 수행 하 여 작업 버퍼와 DSC를 equilibrate. 화면 왼쪽에 "실험적인 방법" 탭에서 "검색" 옵션을 DSC 온도 스캐닝 모드에서 실행 되도록 선택 확인 합니다. 참고: 실험적인 매개 변수는 검색 범위, 스캔 속도, 낮은 및 높은 온도 평형 시간, 및 검사의 수 온도.<ol>
<li>"온도 매개 변수" 삽입 "실험적인 방법" 탭 아래에서 "난방"에 대 한 버튼을 클릭 합니다. 하위 및 상위 실험 온도, 1 ° C/min 스캔 속도와 60에 대 한 1 및 100 ° C를 입력 평형 기간에 대 한 s.</li>
		<li>재래식 기간에 대 한 입력된 필드 아래의 "추가 시리즈" 단추를 클릭 합니다. (대 한 한 난방 및 냉각 한 스캔) 팝업 창에서 "추가 하는 단계" 필드에 2를 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 확인란을. "클릭"; 추가 스캔 인터페이스의 아래 부분에 나타납니다. 각 검색에 대 한 매개 변수를 확인 원하는.</li>
		<li>인터페이스의 상단에 녹색 "재생" 버튼을 클릭 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 폴더에 이동한 실험 팝업 창에서 저장할 파일 이름을 입력 합니다. "실험 방법" 탭의 오른쪽에 "데이터" 탭을 클릭 하 여 실험 진행 상황 보기</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Thermolabile Ligand DSC 데이터 집합 수집
참고: 최소한의 절차 5 실험의 구성: 버퍼와 ligand 없이 참조 실험 (기준선 빼기 사용 내용참조), 샘플 무료 biomolecule ligand 바인딩 biomolecule 실험 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 장기간 높은 온도 평형으로.
<ol><li>샘플 데이터의 초기 빼기에 대 한 참조 실험을 실행 합니다. 작업 버퍼 모두 모세 혈관에서 DSC를 다시 로드 하 고 1 ° C min-1 위 (높은 온도)에 적당 한 온도 범위에 걸쳐 여러 개의 앞으로 역 검사를 수집 120 평형 시간 s.<ol>
<li>개별적으로 각을 강조 하 고 인터페이스의 오른쪽 중간에 빨간색 X를 클릭 하 여 인터페이스의 아래 부분에서 이전 버퍼 평형 검사를 삭제 합니다. "시리즈 추가" 버튼을 클릭 "추가 하는 단계", 필드에 20을 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 상자를 검사 하 여 새로운 검사를 추가 합니다. 확인을 클릭 하 고 위와 같이 녹색 재생 버튼을 클릭 하 여 실험을 실행.</li>
		<li>반복 단계 3.1-3.1.1 작업 버퍼 참조를 모두 모세 혈관에 ligand의 원하는 농도 포함 하는 리간드에 대 한 실험 (120을 사용 하 여 두 개의 별도 실험을 수집 s 및 600 s 높은 온도 평형 시간 각각, thermolabile 리간드 변환에 대 한 속도 상수 인수에 사용할 수). 참고: 여기에 사용 되는 스캔 속도 통해 후속 실험에서 biomolecule 정방향 및 역방향 검색 ( 내용참조)에서 열 평형에. 스캔 속도 < 0.1-0.2 ° C min-1 시끄러운 thermograms 이어질 DSC 실험에 적용 되지 않습니다. 온도 무료 biomolecule ligand 포화 biomolecule의 녹는 온도 이상 잘의 녹는 온도 아래 우물에서 연장 해야 합니다 (~ MN4 20-80 ° C). (예, 앞으로 10 및 20 총 10 역 검사는 충분 한)에 대 한 검사의 재현성을 확인 합니다.</li>
		<li>(코카인, 말라리아) 등 여러 개의 ligands를 사용 하는 경우는 모세 혈관에서 리간드를 제거 하 고 교차 오염을 방지 하기 위해 실행 사이의 작업 버퍼 (반복 단계 2.5에서에서)의 200 mL와 함께 DSC를 플러시. 참고: 이전 ligand 모 세관 벽에 강하게 adsorbs 버퍼 플러시를 적절 하 게 제거 되지 않습니다 있는지 확인 하려면 ligand 바인딩 실행 후 무료 biomolecule에 복제 실험을 수행 하기 위해 도움이 됩니다. 무료 biomolecule 위한 thermograms ligand 바인딩 실험 후 더 큰 규모와 높은 변성 온도에 이동 될 경우, 그것은 이전 ligand는 여전히 홍 조 후 열 량 계에 존재. 20%를 가진 모 세관을 배양 하 여 흡착된 ligand를 제거 플라스틱 모자와 압력 핸들에서 60 ° C에서 1 시간에 대 한 Contrad-70. DSC 소프트웨어에서 실험 모드를 "등온선" 기간 및 등온선 온도 대 한 60 ° C에 대 한 실험 방법 탭 선택 3600 s 아래 0 평형 시간에 대 한 입력으로 변경. "실험적인 방법에 추가"를 클릭 합니다. 등온 실험 화면 아래 부분에 나타납니다. 완료 후, 2 L 이온된 물으로 악기를 플러시 하 고 단계 2.5에서에서 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 실험 같은 로드 절차 및 실험적인 매개 변수는 참조를 검색 하는 DSC를 사용 하 여 실행 합니다. 무료 biomolecule 데이터 집합에 대 한 샘플 모 세관 작업 버퍼에 원하는 농도에서 무료 biomolecule 포함 하는 동안 참조 모 세관 작업 버퍼를 포함 되어 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>Ligand 바인딩 실험에 대 한 확인 참조 모 세관에 작업 버퍼에는 ligand biomolecule 플러스 ligand 샘플 모 세관에서 작업 버퍼에는. 2.5 단계 에서처럼 다른 ligands의 추가 사이 시스템을 플러시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수행 추가 실험은 biomolecule와 높은 온도 평형 기간 600 증가 thermolabile ligand에 바인딩된 s 및 다른 실험적인 매개 변수는 단계 3.2.1 동일. 참고: 두 번째 ligand 바인딩 실험에 대 한 높은 온도 평형 기간의 기간 단순히는 ligand 짧은 평형 시간 실험 보다 더 빠르게 고갈 되도록 선택 됩니다. 첫 번째에서 ligand 바인딩 봉우리 검색 번호의 기능으로 천천히 부패 실험 하는 경우 (예를 들어, 연속 피크 맥시 마의 차이 인 ≤ 0.5 ° C)에 높은 온도 평형에 10-을 20 배 증가 예상 두 번째 실험 동안에 ligand를 고갈 적절 하 게 합니다. Ligand 변환 속도 상수의 정확한 계산 하려면 두 번째 실험 첫 번째 기준으로 리간드의 신속한 고갈에 합니다. 두 실험의 글로벌 분석에서 추출 된 ligand 농도 유사 하 고 따라서 ligand 고갈 두 번째 실험에서 충분히 가속 되지 경우 사용할 수 없게 될 것입니다.</li>
</ol>4입니다. 데이터 처리
<ol><li>오픈 DSC 실험 DSC 데이터 분석 소프트웨어에서 파일 ( 재료의 표참조) 및 스프레드시트도 원시 전원 데이터 내보내기.</li>
	<li>피팅 하는 데이터에 대 한 소프트웨어에 원시 전원 데이터를 포함 하는 스프레드시트를 가져옵니다.</li>
	<li>초기 자유에서 버퍼 전원 데이터 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 실험을 빼서 샘플 데이터를 뺍니다. 참고: thermolabile ligand 실험에 대 한 초기 ligand의 농도 각 스캔 감소 됩니다. 따라서, 샘플 검사 1에서 버퍼 스캔 1 빼기 위해 이상적 이다. 우리는 ligand 변환 진행 하 고 따라서 단일 thermolabile ligand 버퍼 스캔의 모든 thermolabile ligand 바인딩 데이터를 사용할 수 있는 버퍼 스캔 코카인을 분명 변경 되지 않습니다 나타났습니다.</li>
	<li>열 용량 기준 뺀 샘플 전원 데이터를 변환 합니다. 참고: 변환 예상된14,,1516수 biomolecule의 부분 특정 볼륨을 필요 합니다. 열 용량 전력 변환에 대 한 방정식 되었습니다17위에서 설명한.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>세계적으로 초기 계획, ligand 농도, 폴딩, 및4에서 설명한 대로 매개 변수를 바인딩 ligand의 단일 세트와 함께 짧은 평형 시간 thermolabile ligand 바인딩 열 용량 데이터 집합에 맞게.</li>
	<li>앞에서 설명한4thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 계산 하려면 긴 평형 시간 데이터 집합에 대 한 글로벌 맞는 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+in+life+science%3A+thermodynamics%2C+stability%2C+molecular+recognition+and+application+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li>
<li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Anatoliy_Dragan/publication/7002826_Microcalorimetry_of_biological_macromolecules/links/0912f507f62e09cd1b000000.pdf">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li>
<li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li>
<li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li>
<li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li>
<li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li>
<li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+drug+design%3A+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li>
<li>Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173508511000141">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li>
<li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2710.1978.tb00096.x/full">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li>
<li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12066569">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li>
<li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15025917">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li>
<li>Hinz, H. -J. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDurchschlag%2C+H+%22Thermodynamic+Data+for+Biochemistry+and+Biotechnology%22">Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).</li>
<li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J+Biophy%22%5BJournal%5D)">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li>
<li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li>
<li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li>
<li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/~kimth/www-mit/8.13/error_propagation.pdf">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li>
<li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

수정 및 문제 해결
그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다4위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변환에 의해 흡수 열을 밖으로 취소 자체 처리. (그림 1 및 그림 2) 표준 thermolabile ligand 글로벌 피팅 분석 가정 시스템 온도 스캔을 통해 열역학 평형에 있으며 the...

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위4의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로1,5,6,,78을 대상으로 약물의 디자인 지도 중요 합니다. 그러나, 높은 온도에 반복 검사 (~ 60-100 ° C) 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어 많은 약물 중요 한 화합물 받아야 재배치 또는 높은 온도9,,1011, 즉지속적인된 노출 시 분해, 그들은 thermolabile. DSC에 의해 상호 작용을 일반적으로 바인딩 시험 열역학 분석12열상의 재현성을 확인 하려면 여러 개의 앞으로 역 검사를 필요 합니다. 초기 ligand의 농도 감소 하면서 각 검색 이후 변경 된 바인딩 특성을 가진 보조 형태로 초기 ligand의 열 변환 형태와 연속 thermograms의 위치에서 발음된 차이에 리드는 열 변환 제품 축적. 이러한 데이터 세트는 전통적인 분석 의무가 없습니다.
우리는 최근 열역학 매개 변수 바이오 접는 통치 및 바인딩 참조는 단일 ligand 바인딩 실험에서 상호 작용의 완전 한 집합을 생성 하는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합에 대 한 글로벌 피팅 방법 개발에 무료 biomolecule4에 대 한 필요한 열상. 분석에 필요한 샘플 및 실험 시간 감소 ~ 표준 DSC 접근 방식에 비해 10 배. 우리가 차지 하 고 이것을 가정 하 여 열 변환은 열상 ligand 농도에 의존 하지 않는 각 스캔의 고온 부분 중 발생 하는 리간드에 대 한. 따라서, ligand 농도 열상 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 되는의 부분 내에서 상수 이다. 우리는 또한 어떻게 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수 장기간 높은 온도 평형 한 보충 실험을 수행 하 여 얻어질 수 있다 설명 했다. Ligand 열 변환 덜 온도 따른 시스템에 대 한 (즉, 모든 온도에서 분명 발생), 분석 변수 ligand 농도 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 여기 우리 DNA aptamer MN4 benzoylecgonine 높은 온도에서 빠르게 변환 thermolabile ligand 코카인의 존재에 대 한이 절차 설명 (> 60 ° C). 말라리아 이후 이러한 실험적인 온도에서 변환 받아야 하지 않습니다 또한 MN4 바인딩 ligand thermolability에 대 한 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합 및 그들의 분석 저조한 접는, 바인딩 및 리간드의 열역학 및 운동 매개 변수 변환 프로세스의 인수를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 탈이온수</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 미크론 멸균 주사기 필터</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa 원심 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙 0.5-1.0 kDa 컷오프</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 DSC 플랜지 캡</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>코카인</td><td>시그마 알드리치</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>퀴닌</td><td>시그마 알드리치</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>나노DSC-III 마이크로 열량계</td><td>TA 기기</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun 소프트웨어</td><td>TA 기기</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze 소프트웨어</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

바이오 dsc 프로필 thermolabile ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.

Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 말라리아에 바인딩된에 대 한 데이터는 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)에 대 한 부정적인 컨트롤로 표시 됩니다. 마지막 thermolabile ligand 검사 약간 높은 전환 중간점 및 thermolabile ligand 변환 제품 ...

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

이 방법론의 전반적인 목표는 열에 민감한 리간드를 사용하여 단 두 번의 실험만으로 시차 주사 열량 측정법(differential scanning calorimetry, DSC)을 통해 생체 분자의 접힘 및 결합 상호작용을 결정하는 열역학적 파라미터를 추출하는 것입니다. 이 방법은 생체 열량 측정 및 약물 설계 분야에서 생체 분자와 강한 결합 억제제 사이의 상호작용을 결정하는 열역학적 파라미터의 상대적 크기는 어느 정도인가와 같은 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 완전한 리간드 적정이 수행되어 전역 피팅 분석(global fitting analysis)으로부터 열역학적 파라미터를 신속하게 추출할 수 있다는 점입니다.먼저, 정제된 생체 분자를 리간드 용액으로 투석하기 위한 완충액을 준비합니다. 0.5에서 1.7 kilodalton 차단값(cutoff)을 가진 투석 튜브를 사용하여, 생체 분자를 최소 1리터의 완충액에 대해 투석합니다. 고품질의 DSC 데이터를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 생체 분자 리간드를 원하는 완충액에 대해 투석하는 것입니다.이를 통해 DSC 데이터에 버퍼 불일치로 인한 아티팩트가 발생하지 않도록 합니다. 작동 버퍼(working buffer)라고 지칭하는 최종 버퍼를 버퍼로 충분히 평형화시킨 0.2-micron 필터로 여과합니다. 필요한 양의 리간드를 정밀히 측정하여 여과된 작동 버퍼에 녹입니다.원하는 리간드 농도에 필요한 질량이 너무 적어 정확하게 측정하기 어려운 경우, 고농도의 리간드 스톡 용액을 제조하십시오. 바이오분자 스톡 용액을 작동 버퍼로 충분히 평형화시킨 0.2-micron 필터로 여과하십시오. 그다음, 흡광도 측정을 통해 바이오분자 농도를 결정하십시오.준비된 생체 분자와 리간드를 4°C 냉장고에 보관하거나, 생체 분자와 리간드가 동결에 견딜 수 있고 장기 보관이 필요한 경우에는 -20°C 또는 -80°C에 보관하십시오. 시차 주사 열량계(DSC)에 로딩하기 전에 탁상용 탈기 장치를 사용하여 완충액과 리간드 용액의 가스를 제거하십시오. DSC에서 압력 핸들을 돌려 분리하십시오.그 다음, 작업 버퍼로부터 실리콘 튜브를 연결하여 기준 모세관의 전면 플랜지에 부착합니다. 기준 플랜지 후면과 샘플 플랜지 전면을 연결하여 기준 모세관과 샘플 모세관 사이에 브리지를 형성합니다. 이어서, 샘플 플랜지 후면에 진공 라인이 연결된 폐액 플라스크로 이어지는 실리콘 튜브 조각을 부착합니다.진공 라인을 켜서 DSC를 200 milliliters의 작업 버퍼로 세척합니다. 먼저 약 3~5cm 길이의 실리콘 튜브 섹션을 기준 모세관 플랜지에 연결합니다. 다음으로, 후면 플랜지의 실리콘 튜브에 1 milliliter 피펫 팁을 삽입합니다.피펫으로 워킹 버퍼 0.8 milliliters를 취한 후, 버퍼가 담긴 피펫 팁을 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 삽입합니다. 피펫 플런저를 천천히 눌러 워킹 버퍼가 전면 실리콘 튜브를 통해 참조 모세관으로 들어가 후면 플랜지에 연결된 피펫 팁까지 전달되도록 합니다. 워킹 버퍼의 높이가 전면 실리콘 튜브 바로 위까지 도달할 때까지 피펫 플런저를 누른 다음, 워킹 버퍼의 높이가 후면 실리콘 튜브 바로 위까지 도달할 때까지 피펫 플런저를 뗍니다.기포를 제거하기 위해 기준 모세관 내에서 작동 버퍼를 계속해서 앞뒤로 통과시킵니다. 다음으로, 검지 손가락으로 뒤쪽 피펫 팁을 막고, 실리콘 튜브가 연결된 상태에서 뒤쪽 피펫 팁과 앞쪽 피펫을 천천히 끌어올려 기준 플랜지에서 분리합니다. 이전과 동일하게 샘플 모세관에 작동 버퍼를 채웁니다.전면 플랜지는 덮지 않은 상태로 후면 기준 시료 플랜지에 검은색 플라스틱 캡을 씌웁니다. DSC에 압력 핸들을 부착한 후 DSC 소프트웨어를 실행하고, 전력 읽기 값이 안정되면 인터페이스 상단의 빨간색 위쪽 화살표를 클릭하여 장치를 가압합니다. DSC 전력은 인터페이스 우측 상단 상자에 장치 온도 및 압력 읽기 값과 함께 표시됩니다.화면 왼쪽의 실험 방법 탭에서 정방향 및 역방향 스캔을 수행하여 DSC를 작업 버퍼로 평형화합니다. DSC 실행 및 온도 스캔 모드가 선택되었는지 확인하십시오. 실험 방법 탭 아래의 온도 파라미터 삽입창에서 가열 버튼을 클릭합니다.하한 및 상한 실험 온도로 1도 및 100도를, 스캔 속도로 분당 1도를, 평형 시간으로 60초를 입력하십시오. 평형 시간 입력 필드 아래의 AddSeries 버튼을 클릭하십시오. 팝업 창의 추가 단계 필드에 2를 입력하고 Alternate Heating/Cooling 확인란을 선택하십시오.확인을 클릭하십시오. 추가된 스캔 항목들이 인터페이스 하단에 나타납니다. 각 스캔의 파라미터가 원하는 대로 설정되었는지 확인하십시오. 인터페이스 상단의 녹색 재생 버튼을 클릭하여 실험을 시작하십시오.원하는 창으로 이동한 후 팝업 창에 실험 저장 파일 이름을 입력하십시오. 실험 방법 탭 오른쪽에 있는 데이터 탭을 클릭하여 실험 진행 상황을 확인하십시오. 두 모세관 모두에 워킹 버퍼를 채워 DSC를 다시 로드함으로써 샘플 데이터의 베이스라인 보정을 위한 참조 실험을 수행하십시오.분당 1°C의 속도로 적절한 온도 범위에서 여러 번의 정방향 및 역방향 스캔을 수행하며, 상승 평형 시간은 120초로 설정합니다. 인터페이스 하단에서 이전의 버퍼 평형 스캔을 각각 강조 표시한 후, 인터페이스 중앙 우측의 빨간색 X를 클릭하여 삭제합니다. 추가할 단계 필드에 20을 입력하고 가열/냉각 교대(Alternate Heating/Cooling) 상자를 선택한 다음, AddSeries 버튼을 클릭하여 새로운 스캔을 추가합니다.그 후, OK를 클릭하고 이전과 같이 녹색 재생 버튼을 클릭하여 실험을 실행합니다. 두 모세관 모두에 원하는 농도의 리간드가 포함된 작동 버퍼를 사용하여 이 단계들을 반복함으로써 리간드에 대한 참조 실험 결과를 얻습니다. 열에 불안정한 전환의 속도 상수를 구하는 데 사용할 두 개의 별도 실험 데이터를 수집하십시오.유리 바이오분자 데이터 세트의 경우, 기준 모세관에는 작업 버퍼가 들어 있고 샘플 모세관에는 원하는 농도의 유리 바이오분자가 작업 버퍼에 포함되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 기준 스캔에 사용된 것과 동일한 DSC 로딩 절차 및 실험 매개변수를 사용하여 샘플 실험을 수행하십시오. 리간드 결합 실험의 경우, 기준 모세관에는 리간드가 작업 버퍼에 들어 있고 샘플 모세관에는 바이오분자와 리간드가 작업 버퍼에 들어 있는지 확인하십시오.이전과 동일하게 서로 다른 리간드를 첨가하는 사이에 시스템을 세척하십시오. 고온 평형 시간을 600초로 늘리고 나머지 모든 실험 매개변수는 이전과 동일하게 설정하여, 열에 불안정한 리간드와 결합된 생체분자를 이용해 추가 실험을 한 번 더 수행하십시오. 이후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 처리 및 분석을 진행하십시오.열민감성 리간드 결합 피크의 위치와 높이는 스캔이 반복됨에 따라 열민감성 리간드가 고갈되면서 비결합 분자의 피크 방향으로 점차 이동합니다. 3D 성숙 프로파일은 열민감성 리간드 전환의 종점을 결정하는 기준으로 사용됩니다. 고온 평형 시간을 늘리면 짧은 평형 시간 데이터 세트와 비교했을 때, 각 스캔 시 열민감성 리간드 농도의 감소가 더 뚜렷하게 나타납니다.두 데이터 세트에서 얻은 최적화된 글로벌 핏(global fit) 농도 매개변수를 사용하여, 높은 평형 온도에서의 리간드 전환 속도 상수를 계산할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 데이터 아티팩트를 방지하기 위해 로딩 피펫을 사용하여 DSC 모세관의 기포를 제거함으로써 생체 분자 리간드 또한 탈기하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청하고 본문을 읽은 후, 여러분은 생체 분자에 대해 DSC 실험을 수행하는 방법과 폴딩 및 결합 상호작용을 지배하는 열역학적 파라미터를 신속하게 추출하기 위한 글로벌 피팅 분석의 구현 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 평형 폴딩 결합 상호작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 느린 폴딩 및/또는 리간드 결합 역학을 보이는 생체 분자와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

이 비디오는 생체 분자와 리간드 사이의 상호 작용을 연구하는 기술인 시차 주사 열량계를 보여줍니다. DNA 압타머와 열불안정 리간드의 결합은 샘플에 반복적인 가열 및 냉각 주기를 적용하고 열역학 분석을 위한 스캔을 얻어 연구합니다.

DNA Aptamer-Thermolabile Ligand 상호 작용을 연구하기 위한 시차 주사 열량계

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

시차 주사 열량은 단백질을 변성시키는 데 필요한 열 전이 온도 (들) 및 전체 열 에너지를 측정한다. 얻어진 결과는 백신 제제에 단백질 항원의 열 안정성을 평가하기 위해 사용된다.

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

이 프로토콜은 화합물과 단백질 분자 간의 결합을 검출하는 고유한 방법을 설명하며, 단백질 샘플 손실을 최소화하고 데이터 정확도가 높다는 이점을 제공합니다.

Differential Scanning Fluorescence를 통한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출

여기에서는 관심 단백질에 대한 소분자의 결합을 조사하는 데 사용되는 고처리량 형광 기반 기술인 열 이동 분석을 제시합니다.

Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

배우세요 DSC를 이용해 생체 분자의 폴딩 및 결합 상호작용을 빠르게 분석하는 방법을. 열 불안정 리간드를 사용하여 두 번의 실험만으로 열역학적 매개변수를 추출하고, 바이오칼로리메트리 및 신약 설계 연구에 활용할 수 있습니다.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

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