Name: 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 원자 힘 현미경을 사용한 단일 단백질 분자 힘 분광학으로 단백질의 기계적 특성과 폴딩 경로를 측정하는 방법을. 이 기술은 단백질 안정성과 생물학적 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 교부 금 인 m c B-1244297 및 MCB-1517245 PEM에 의해 지원 되었다.

1. 단백질 준비
<ol><li>DNA 복제입니다.<ol>
<li>관심, NI10C10, 예를 들어 DNA 시퀀스의 DNA 순서를 합성 하거나 통해 PCR 표준 분자 생물학 기법11를 사용 하 여 호스트 유기 체에서 분리 합니다. 합성 또는 5'-끝 (Addgene #74888)12에 플라스 미드 pEMI91 모듈에 해당 하는 PCR 뇌관의에 사이트를 배치 하 여 금지 사이트와 관심사의 유전자를 측면.</li>
		<li>별도로 소화 플라스 미드 pEMI9112 와 제한 사이트의 쌍으로 관심사의 DNA 순서는 관심사의 순서는 I91 ( 그림 1참조)을 반복 하는 협동에 의해 형벌 것입니다. 금지 사이트에 대 한 표준 프로토콜을 따릅니다.</li>
		<li>젤 전기 이동 법을 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 T4 DNA 리가, 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용 하 여 제품을 선. 결 찰, 후 플라스 미드 플라스 미드 정화에 대 한 대장균 세포로 변환 하 고 표준 프로토콜을 사용 하 여 플라스 미드 정화. 시퀀스는 시퀀스 성공적으로 변형 되었다 확인 T7 뇌관 또는 내부 pEMI91 뇌관을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>변환입니다.<ol>
<li>C41 같은 단백질 식 세포 제거 (DE3) pLysS 셀-80 ° C 냉동 고 얼음에 완전히 해 동에서.</li>
		<li>셀에 플라스 미드 DNA의 1 µ L을 추가 하 고 볶음 짧게; 공기 방울을 소개 하 고 온난 한 셀 아래로 pipetting 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>세포와 30 분 동안 얼음에 플라스 미드를 포함 하는 문화 관을 품 어.</li>
		<li>열 충격 45 42 ° C에서 물 욕조에 셀 s.</li>
		<li>2 분 동안 얼음에 튜브를 반환 합니다.</li>
		<li>셀에 파운드 국물의 950 µ L를 배치 하 고 37 ° c.에 1 시간에 250 rpm에서 흔들</li>
		<li>약 200 µ L 파운드 접시 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린에 변환의 장소. PEMI91 다른 플라스 미드를 사용 하는 경우 다음 그 플라스 미드에 대 한 적절 한 항생제를 사용 합니다. 37 ° c.에 인큐베이터에 접시를 하룻밤 장소 다음 날, 인큐베이터에서 제거 접시 parafilm, 포장 하 고 저장소 냉장 1 달까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 식입니다.<ol>
<li>접시에 단일 세균성 식민지로 살 균 피 펫 팁을 감동 하 고 아래로 파운드에 pipetting으로 하룻밤 성장 위한 37 ° C에서 50 mL 튜브에서 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 국물 매체의 15 mL를 접종.</li>
		<li>100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 국물 매체의 1 리터에 15 mL 문화를 전송 하 고 37 ° C에서 4-12 h에 대 한 동요 (까지 명이600 > 0.8).</li>
		<li>10 mL 플라스 미드 준비에 대 한 문화를 수집 합니다.</li>
		<li>0.2-1 m m 이소프로필-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가 하 고 하룻밤 표현 위한 실내 온도에 온도 낮춘 다.</li>
		<li>4 개의 튜브로 분할 하 고 40 분 4000 × g 에서 centrifuging 여 다음날 세포를 수확 하 고 몇 시간 동안-80 ° C에서 펠 릿을 동결.</li>
		<li>시퀀싱에 대 한 셀에서 해당 단백질12 의 삽입된 카세트 하 뇌관으로 추출 하는 플라스 미드를 보내고 삽입된 DNA의 충실도 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 정화입니다.<ol>
<li>실 온에서 30 분 동안 냉동된 세포의 1 개의 관 동</li>
		<li>해 동된 세포 세포의 용 해 버퍼 (38 mL 물, 글리세롤, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 150 m m NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µ g/mL DNase, 1 밀리미터 PMSF, 1mm TCEP, 500 µ g/mL lysozyme의 2 개 mL)를 일시 중단 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 흔들.</li>
		<li>몇 시간 동안-80 ° C에서 lysed 세포를 고정 하 고 다시 실 온에서 해 동.</li>
		<li>4 ° c.에 30 분 13100 × g 에서 lysate 아래로 회전</li>
		<li>특정 태그 (예: Strep 태그 또는 그의 태그)에 대 한 중력 흐름 열 통해는 상쾌한을 실행 합니다.</li>
		<li>버퍼 교환 Strep 태그 또는 그의 태그 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장소에 대 한 적절 한 버퍼를 사용 하 여 원심 필터를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 슬라이드 샘플 준비를 위한 준비
<ol><li>피 라 솔루션을 사용 하 여 유리 슬라이드를 준비 합니다.<ol>
<li>장소 10-30 조각 40 mL 유리 비 커에 유리 커버 전표 (7.5 m m의 반지름) 라운드. 참고: 후드에이 단계와 다음 단계를 수행 합니다. 이 단계 동안 위험한 화학 물질 처리에 대 한 표준 절차를 따릅니다.</li>
		<li>집중된 (18.4 M) 황산 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>30%의 과산화 수소의 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>95 ° c 10-30 분을 위한 혼합물이 열</li>
		<li>신중 하 게는 별도 폐기물 컨테이너 (재사용 또는 폐기)으로 피 솔루션을 가만히 따르다.</li>
		<li>슬라이드 피 솔루션을 제거 하는 이온된 수와 린스.</li>
		<li>아세톤의 40 mL에 슬라이드를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>폐기물 용기에 아세톤을 가만히 따르다와 에탄올 40 mL에 슬라이드를 다시 일시.</li>
		<li>깨끗 한 집게를 사용 하 여 신중 하 게 한 번에 한 슬라이드를 추출 하 고 건조 한 아르곤 또는 공기를 정화.</li>
		<li>장소 깨끗 하 고 건조 슬라이드까지 골드 증발, 진공 또는 아르곤 장기 보관을 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(선택 사항) 골드 코팅된 슬라이드를 준비 합니다. 참고: 이 단계는 주요 대학에서 많은 클린 룸 시설에서 사용할 수 있는 진공 (전자 빔) 증발 기를 사용 하 여를 필요 합니다.<ol>
<li>5 현미경 슬라이드 (25 x 75 mm 직사각형 모양)는 산울타리를 사용 하 여 반으로 잘라.</li>
		<li>양면 접착 테이프는 10의 각각의 중간에 걸쳐 적용 반 현미경 슬라이드.</li>
		<li>스티커 메모의 끈 적 한 면을 잘라 고 메모의 끈 적 한 면이 면 업 이중 면 테이프에 적용 합니다. 스티커 메모는 일반적으로 덜 접착제, 하지만 아직도 단단히 미래의 침입을 방지 하기 위해 슬라이드에 부착. 다음 그 절반 현미경 슬라이드 유리 슬라이드 소유자 지금 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>신중 하 게 4 개의 깨끗 한 유리 슬라이드 (섹션 2.1.10) 소유자의 끈 적 한 면의 각 모서리를 누릅니다.</li>
		<li>전자 빔 증발 기를 유리 슬라이드를 이동 합니다. 70을 적용 하는 증발 기의 사양에 따라 크롬 및 300의 nm 금 표면에 nm.</li>
		<li>아르곤 골드 코팅 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 준비
<ol><li>
슬라이드를 준비 합니다.
	<ol>
<li>깨끗 한 철 디스크 (15 m m 직경)를 선택 하 고 그것에 연결할는 접착제 탭.</li>
		<li>접착제 탭의 커버 조각 unattach</li>
		<li>(섹션 2.1.10)에서 깨끗 한 유리 또는 금 (2.2.7 섹션)에서 일부를 선택 하 고 단단히 철 디스크의 끈 적 한 면에 배치,이 샘플 슬라이드 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드에 예금 단백질입니다.<ol>
<li>실험 (25mm Tris HCl, pH 7.6 150 mm NaCl)에 대 한 버퍼는 polyprotein dialyze 0.5 mL 원심 필터 같은 버퍼 교환 열을 사용 하 여. 13000 rpm에서 10 분 동안 열에 단백질 회전 다음 열을 반전 하 고 2 분 1000 rpm에 회전에 의해 새로운 버퍼에 단백질을 elute.</li>
		<li>280에서 흡 광도 측정 하 여 대략적인 단백질 농도 결정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>10-100 µ g/mL에서 100 µ L의 최종 볼륨을 단백질을 희석.</li>
		<li>슬라이드의 중심에 단백질 해결책의 60 µ L를 적용 합니다. 하도록 하지 어떤 액체 유리와 철 슬라이드 사이의 간격으로 아래 입력이 실험 및 통제 샘플 움직임 동안 접착제의 붓기가 발생할 수 있습니다이 단계에서 주의 해야 합니다. 참고: 골드 슬라이드는 소수 성, 그리고 구형 물방울 형태로 유리 슬라이드는 더 친수성 단백질 솔루션 확산 수 있습니다 하는 동안.</li>
		<li>샘플 10-60 분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 이 시간 동안, 원자 힘 현미경 설정을 시작 하려면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 원자 힘 현미경 (AFM) 설치
참고: 다음은 AFM, 설정에 대 한 일반적인 설명 그리고 일부 특정 내용을 특정 계측 사용에 따라 다를 수 있습니다. 사용 계측 이며 부분적으로 집에서 만든 숄13에서 자세히 설명 합니다.
<ol><li>AFM 셀에 캔틸레버를 탑재 합니다.<ol>
<li>응용 프로그램에 대 한 적절 한 속성을 가진 캔틸레버를 선택 합니다. 사용 cantilevers 스프링 상수와 낮은 전개 세력에 대 한 4-10 pN/nm (10 ~ 50 pN), 사용 cantilevers 스프링 상수와 높은 전개 세력에 대 한 15-100 pN/nm.</li>
		<li>신중 하 게 끝에서 캔틸레버를 선택 하 고 셀을 잡고 프로브에 배치.</li>
		<li>지주 셀 단단히 보유 캔틸레버 자리에 계속 하기 전에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>레이저의 정렬에 대 한 AFM 머리에 지주 셀을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AFM 머리에서 레이저를 맞춥니다.<ol>
<li>머리는 거꾸로 한 현미경에 놓고 머리에 레이저 전원 공급을 위한 AFM 머리에 배터리 팩을 연결 합니다.</li>
		<li>레이저 빛은 TV 나 모니터에 구상 될 수 있다 그래야 현미경 검출기에 카메라를 연결 합니다.</li>
		<li>레이저를 위치 하는 캔틸레버의 끝에 위치</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플으로 머리를 탑재 합니다.<ol>
<li>각 셀을 잡고 프로브 포트의 버퍼의 10 µ L를 플러시.</li>
		<li>배양 된 샘플 슬라이드를 incubated 솔루션에서 액체의 40 µ L을 가만히 따르다. 슬라이드에는 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 장소는 압 전 위의 자석에 샘플 슬라이드.</li>
		<li>AFM 단계 높은 위치에 있는지 확인 합니다. AFM 캔틸레버 샘플 방울 위에 되도록 다음 스테이지로 AFM 머리를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>센터는 광다이오드에 반사 된 레이저 빔입니다.<ol>
<li>종이의 작은 조각을 잘라내어 AFM 포토 다이오드 앞에서 그것을 배치.</li>
		<li>AFM 레이저 레이저 자리는 종이에 집중 하 고 밝은 되도록 손잡이 사용 하 여 위치를 변경할.</li>
		<li>레이저 모든 사분면 (A + B + C + D)에 총 신호를 최대화 하기 위해 포토 다이오드를 안타와 상위 2 사이의 차이 신호 발생 및 0 (A + B-C-d)를 두 개의 사분면 아래쪽 AFM 헤드 미러를 조정 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 원자 힘 현미경 교정
<ol><li>파워 스펙트럼을 측정 합니다.<ol>
<li>AFM에 연결 된 필터에 전체 대역폭을 AFM 머리 신호에 대 한 필터 설정을 설정 합니다.</li>
		<li>AFM 자체에 피는 떨어져 잡음 신호에 추가 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>AFM 소프트웨어14 를 사용 하 여 1, 024 데이터 포인트를 계산에서 파워 스펙트럼의 512 계산의 평균을 측정.</li>
		<li>AFM 소프트웨어15 를 사용 하 여 해당 주 모드의 캔틸레버에 대 한 진동 하는 첫 번째 피크에 걸쳐 전력 스펙트럼 밀도 통합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토 다이오드 감도 계산 합니다.<ol>
<li>AFM 자체에서 압 전 컨트롤러 설정 하 고 500 Hz (로우-패스 필터) 필터 설정을 변경.</li>
		<li>0은 AFM 소프트웨어에 주위 변동 한다 차이 신호를 모니터링 합니다. 신속 하 게 micropositioners를 사용 하 여 몇 백 마이크로미터 아래로 AFM 머리를 이동 합니다. 머리를 아래로 이동을 반복 하 고 일관 된 점프에 대 한 차이 신호 모니터링. 표면은 매우 때 신호 점프 근처 시작 높이 증가 합니다.</li>
		<li>최대한 빨리 편향 신호 포화 표면, 접촉 시 표면에서 머리를 약간 이동 합니다.</li>
		<li>AFM 소프트웨어에 입력된 컨트롤을 사용 하 여 표면, 100-5000 nm를 위아래로 이동 하 여 찾을 수 전 전압을 조절. 없으면 표면 여전히 도달에, 수동으로 머리와 샘플 사이의 거리를 줄이기 위해 계속.</li>
		<li>AFM 소프트웨어에서 약 500의 스캔 크기와 당기 실험 실시 nm는 약 100 접촉 들어온다 팁 피 여행의 nm.</li>
		<li>AFM 팁 기판 표면 접촉 유지는 포토 다이오드 신호 대 압 전 변위 곡선의 선형 지역의 경사를 측정 합니다.</li>
		<li>감도 기울기와 통합된 파워 스펙트럼을 사용 하 여 스프링 상수를 계산 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq1.jpg">).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 데이터 수집
<ol><li>준비입니다.<ol>
<li>AFM에 연결 된 필터, 샘플링 주파수가 두 번 이상 대역폭 (Nyquist 조건) 저역 컷오프에 대 한 상한이 줄 것 이다 필터 설정을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측량입니다.<ol>
<li>스캔 크기 펼쳐진 polyprotein (아미노산 × 0.365 수) 플러스 눌러 기판에 대 한 수 있도록 약 40%의 총 이론적인 크기를 설정. 예를 들어 약 300의 이론적인 펼친된 길이 있을 것 이다 당기는 9 x I91 구문 nm, 스캔 크기 약 420 이어야 한다 그래서 nm.</li>
		<li>AFM 소프트웨어의 위치는 캔틸레버 표면에서 스캔 크기의 80%를 (340에 대 한이 경우에, 표면에서 nm).</li>
		<li>AFM 소프트웨어에서 설정 스캔 속도 300 nm/s 처음. 참고: 이 속도 느린, 또는 응용 프로그램에 따라 빠르게 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>당기는 실험을 수행 하 고는 압 전 및 포토 다이오드 신호의 결과 위치를 측정 한다. AFM 소프트웨어를 사용 하 여 스캔을 시작 하려면.</li>
		<li>AFM 소프트웨어에서 측정을 수행 약 10000 녹음 때까지 계속 합니다. 참고: 일반적으로, 긍정적인 통제 분자의 픽업 속도 0.516, 그래서 10000은 분석에 충분 한 데이터를 수집할 수 있을 하는 데 필요한 주위입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>데이터 표준화<ol>
<li>각 레코딩에 대 한 계산 사용 하 여 확장 확장 변위-F/kc = (kc 5.2.7에서 이다).</li>
		<li>아무 힘 봉우리는 현재 시작 또는 힘-확장 추적의 끝의 평균을 취 함으로써 초기 힘 수준을 결정 하 고 캔틸레버 표면에 대하여 누르는 하지. 전체 힘 확장 곡선 다음이 평균 값으로 이동 수 있습니다.</li>
		<li>되도록 확장 제로 y 축을 따라 데이터를 변환. 이 때문에 분자 확장 추적의 시작 부분에서 0으로 설정 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관심사의 단백질을 식별합니다.<ol>
<li>단일 분자 지문 제공 하는 적어도 4 개의 I91 이벤트와 함께 녹음을 식별 합니다. 이러한 녹음 캡처 진정한 "단일 분자 측정".</li>
		<li>추가 분석에 대 한 단일 분자 이벤트를 표시 하는 이벤트를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>윤곽선 길이 증가 결정 합니다.<ol>
<li>각 레코딩에 대 한 맞게 펼쳐지는 이벤트, 벌레 모양의 체인 모델 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq2.jpg"> 어디 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq3.jpg"> 실내 온도에, p 속성 길이 (일반적으로 0.4 ~ 1 nm), x 는 나노미터의 확장 이며 L 에 윤곽선 길이 나노미터입니다. 참고: 벌레 같은 체인의 형태는 정확한 보정된 솔루션, 더 정확한 숫자 솔루션 Bouchiat 그 외 여러분 에서 발견 된다 17. 대체 피팅 모델 수 외 에서 찾을 수 있습니다 18.</li>
		<li>L 2 연속 펼쳐지는 이벤트, 결정 그리고이 차이가 만들어낸 값 사이의 차이 계산 "윤곽선 길이 증가".</li>
	</ol>
</li>
	<li>파열 힘을 결정 합니다.<ol>
<li>펼쳐진 곡선에서 큰 하락 전에 높은 포인트를 취 함으로써 주어진된 펼쳐진 이벤트에 대 한 파열 힘을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜에 중요 한 단계는 "지문" 단일 분자 이벤트를 긍정적인 통제 역할 단계 1.1.2에서에서 설명 하는 polyprotein의 사용 이다. 일반적으로, 거기 한다 밝혀지고 있을 polyprotein 단백질의 이벤트 (I91, 즉 약 28의 약 200 pN 및 윤곽선 길이 증가의 펼쳐진 힘 nm) 관심사의 단백질의 접힌 되었습니다는 명확 하 게 결론. 예를 들어 때 관심사의 단백질은 양쪽에서 3 개의 I91 도메인에 의해 형벌 이다, 다음 있어야 합니다 그것은 긍정적으로 단일 분자 이벤트 결론 적어도 4 개의 I91 이벤트. Polyprotein, 또는 다른 수단을 통해 긍정적인 통제 없는 경우, 모든 데이터는 오해에 책임.
플라스 미드에 대 한 복제 전략 유전자와 플라스 미드의 관심에 따라 달라 집니다. 우리가 사용할 수 사용 될 수 있는 polyprotein 플라스 미드를에 만들었습니다이 프로토콜12와 함께. 간단한<sup cla...

AFM에 의해 단일 분자 힘 분광학 (SMF)에 발전 기계 조작 및 단일 단백질 분자의 정확한 특성화를 활성화 했습니다. 이 특성화 단백질 기계1,2,3, 단백질-리간드 상호작용4, 단백질 단백질 상호 작용5, 접히는 단백질에 대 한 새로운 통찰력을 생산 하고있다 및 단백질 기반 설계 재료6,,78. SMF는 단백질을 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다 제공 하는 지속적으로 증가 윤곽선 길이를 상승 그들의 강성에 따라 점차적으로 확장 하는 단백질 분자 내의 화학 및 물리적 채권 AFM에 의해 기지개로 전개. 단백질 분자의이 잡아당기고 수 파열 이벤트의 결과로 힘 확장 곡선에서 갑작스러운 변환을 (또는 강제로 피크). 강제로 피크 기계적 전개 과정에서 단백질의 펼쳐 힘 및 구조 변화에 직접 정보를 제공합니다. AFM을 사용 하 여 첫 번째 연구 중 하나 titin1 을 측정 하 고 전개 하 고 집중된 화학 물질 또는 극단적인 온도 같은 부자연 스러운 denaturants의 사용 없이 생리 적인 조건 하에서 refolding 단백질의 새로운 측면을 발견.
여기 우리가 고려만 AFM SMF 실험 다양 한 악기에 수행 됩니다. AFM은 4 개의 주요 요소로 구성: 프로브, 검출기, 샘플 홀더 및 압 전 스캐너. 프로브는 캔틸레버의 중세 끝에 날카로운 끝 이다. 교정, 후 연결 된 분자의 스트레칭 하는 동안 캔틸레버의 휨 측정 된다 Hooke의 법률을 사용 하 여 힘을 정확 하 게 결정 하는 캔틸레버의 뒤쪽에서 반영 되는 레이저 빔을 사용 하 여. 레이저 빔 다이오드 센터에서의 변위에 비례하여 전압을 생성 하는 사분면 포토 다이오드 검출기에 반사 된 레이저 빔 프로젝트. 액체에 단백질 샘플 기판 하위 나노미터 정밀도로 제어할 수 있는 3 차원 압 전 단계에 거치 된다. 컴퓨터 포토 다이오드 감지기에서 전압을 읽는다 고 컴퓨터 제어 전압 공급을 통해 3D 단계를 제어 합니다. 이러한 압 전 액추에이터 단계는 일반적으로 장착 용량 성 또는 스트레인 게이지 위치 센서 정확 하 게 측정 압 전 변위 및 피드 백 제어 시스템을 통해 정확한 히스테리시스. 압 전 컨트롤러에서 센서 신호 출력은 공장에서 캘리브레이션 된 압 전 전압 상수를 사용 하 여 거리 변환 됩니다. 당기는 실험에서 예 힘 확장 곡선 그림 2에 표시 됩니다.
AFM SMF 실험의 두 가지 유형이 있다: 일정 한 속도 지속적인 힘 측정을 당기. 지속적인 힘 SMF 측정 Oberhauser 외 에 설명 되어 있습니다. 9, 여기 우리가 일정 속도 측정에 집중 하는 동안. 전형적인 AFM 상수 속도 당기 실험 기판 캔틸레버 끝에 상대적으로 부드럽게 이동 하는 압 전 전압을 제공 하 여 수행 됩니다. 전형적인 실험 표면에 대해 처음 누르면 팁이 있다. 당기 측정 접촉에서가지고 팁에서 기판으로 이동 하 여 시작 됩니다. 단백질 처음 팁의 접촉으로 온다, 당겨 질 것 이다 하 고 변위에 대 한 힘의 펼쳐진 추적 측정 됩니다. 기판은 다음 팁 접촉 돌아온 것 고 편안한 추적 어디 단백질 접기 결정 될 수 있다 힘 변위에서 측정 된다.

<table><tbody><tr><td>AFM 표본 디스크, 직경 15mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>유리 기판의 기초로 사용</td></tr><tr><td>원형 유리 커버 슬립, 15mm 직경 No.1 두께 Ted</td><td>Pella, Inc.</td><td>26024</td>는 <td>유리 기판 및 금 코팅의 기초 역할을 합니다</td></tr><tr><td>접착 탭</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16079</td><td>유리 커버슬립을 부착하기 위한 끈적한 면을 제공하기 위해 AFM 시편 디스크에 붙여넣기</td></tr><tr><td>STD 다중 모드 헤드 어셈블리</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>1B75C</td><td>AFM 헤드</td></tr><tr><td>유리 프로브 홀더</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>MTFML-V2</td><td>MultiMode AFM을 사용한 유체 스캔용 유리 프로브 홀더.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microlever AFM 프로브</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>MLCT</td><td>질화규소 캔틸레버, 질화규소 팁, 접촉 이미징 모드에 이상적</td></tr><tr><td>Au 코팅 팁이 있는 AFM 프로브</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>OBL-10</td> 낮은 <td>풀림력으로 단백질을 끌어당기는 캔틸레버</td></tr><tr><td>다기능 데이터 수집(DAQ) 카드, 16비트, 1 MS/s(다중 채널), 1.25 MS/s(1채널), 32개의 아날로그 입력</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>PCI-6259</td><td>AFM 헤드 및 피에조 액추에이터의 신호를 위한 데이터 수집</td></tr><tr><td>LISA 선형 피에조 스테이지 액추에이터</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-753.11C</td><td>기판의 위치를 제어하고 당기는 측정을 수행하는 피에조 액추에이터</td></tr>, <tr><td>XY 피에조 스테이지</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-541.2CD</td><td>피에조 액추에이터, 기판 및 기판 표면의 스캔 위치를 제어합니다</td></tr></tbody></table>.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

그들의 네이티브 3D 구조에 그들의 아미노산 시퀀스 로부터 단백질의 접히는 과정의 결정은 생물학에 있는 중요 한 문제 이다. 원자 힘 현미경 (AFM) 스트레칭과 휴식 단일 단백질 분자의 특정 전개 및 refolding 특성의 직접 증거를 제공 함으로써이 문제를 해결할 수 있습니다. AFM 기반 단일-분자 힘-분광학 AFM-SMF () 일관 되 게 에너지 conformations 전통적인 대량 (생화학) 측정에 가능 하지 않은 단백질을 측정 하는 수단을 제공 합니다. 수많은 논문 AFM SMF의 원리를 보여주는에 게시 된, 하지만 그것은 철저 하 게 완전 한 프로토콜의 부족 때문에 SMF 실험을 실시 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 AFM의 원리를 간단히 설명 하 고 광범위 하 게 세부 프로토콜, 절차, 및 데이터 분석 SMF 실험에서 좋은 결과 달성 하는 지침. 단일 단백질 기계 펼쳐진 측정의 대표적인 SMF 결과 설명 하 고 우리가 제공 하는 문제가 발생 하는 일반적으로 몇 가지 문제 해결 전략.

이 프로토콜에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 두 패널 단백질에서 대표적인 힘 확장 곡선을 표시합니다. 상단 하단 표시는 단백질--관심, NI10C 분자 측면 I91 단백질 I91 polyprotein에서 결과 표시 합니다. 이러한 녹음 표시 I91의 특성 힘 (200 pN) 윤곽선 길이 증가 (28 nm) 정렬 및 AFM의 교정 되었는지 나타냅니다. 이러한 힘 확장 곡선 다음 웜 같은 체인 (파선) 분자의 힘-독립적인 길이 결정 하 고 펼친된 잔류물의 수를 결정 하는 데 도움이 하 여 분석할 수 있습니다. 일단 분석, 윤곽선 길이 증가 (후속 윤곽선 길이 차이) 펼쳐진 힘 단백질 안정성, 속도, 전개 및 전개 통로19를 결정 하기 위해 사용 될 수 있다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

단일 분자 힘 분광법은 우리가 힘으로 단 하나 분자를 조작할 수 있게 함으로써 원자 규모의 분자 생물학에 대한 엄청난 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 원자력 현미경을 사용하여 일정한 속도 측정을 보여줍니다. 우리는 궁극적으로 단백질 안정성, 전개 속도 및 전개 경로를 결정하기 위해 데이터를 사용할 수 있습니다.절차를 시작하려면 비전도성 접착제 탭을 15mm 너비의 깨끗한 철 디스크에 부착합니다. 커버 시트를 제거하고 깨끗하고 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 노출된 접착제에 단단히 누릅니다. 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 슬라이드를 보관합니다.다음으로, 정제된 다단백을 원심 필터에 농축한 다음 컬럼을 반전시키고 단백질을 실험에 사용되는 완충제로 엘류한다. 280 나노미터의 흡광도에 기초하여 적절한 단백질 농도를 결정한 다음 단백질의 밀리리터 용액당 100 마이크로그램의 100 마이크로리터를 준비합니다. 단백질 용액의 60 마이크로리터 드롭을 슬라이드 중앙에 적용합니다.이 실험 중에 제어되지 않은 샘플 움직임으로 이어질 것이기 때문에 액체가 슬라이드와 철 디스크 사이에 미끄러지지 않도록주의하십시오. 샘플이 실온에서 최소 10분 동안 앉게 하십시오. 먼저, 캔틸레버를 끝까지 조심스럽게 집어 들고 있는 프로브에 놓습니다.캔틸레버가 단단히 앉는지 확인합니다. 그런 다음 보유 셀을 AFM 헤드에 놓습니다. 반전 된 현미경 단계에 머리를 설정하고 레이저에 전원을 공급하기 위해 AFM 헤드에 배터리 팩을 연결합니다.모니터 또는 TV 화면에서 레이저 빛을 시각화하기 위해 현미경 검출기에 대한 카메라를 설정합니다. 현미경에 의해 유도, 그것은 캔틸레버 팁에 지시 되도록 레이저를 배치. 샘플이 준비되면 실험 버퍼10 마이크로리터를 프로브 홀딩 셀의 각 포트에 플러시합니다.샘플 슬라이드에서 약 40 마이크로리터의 유체를 데수하고 40 마이크로리터의 버퍼를 추가합니다. 한편, 측정을 위한 원자력 현미경을 준비하기 시작한다. 먼저, 슬라이드를 압착 모터 위에 놓습니다.AFM 스테이지가 높은 위치에 있는지 확인한 다음 샘플 액적 위에 캔틸레버를 사용하여 AFM 헤드를 무대에 배치합니다. 다음으로, AFM 포토다이오드 앞에 작은 종이를 놓습니다. 용지의 반점이 밝고 집중될 때까지 레이저를 조정한 다음 용지를 제거합니다.포토디오드에서 신호를 보려면 AFM 소프트웨어를 시작합니다. 4개의 포토다이오드 사분면에서 레이저 신호가 최대화되고 상단과 하단 사분면 쌍 사이의 다른 신호가 0이 되도록 AFM 헤드 미러를 조정합니다. AFM 보정을 시작하려면 AFM 헤드 신호의 필터 설정을 전체 대역폭으로 전환하고 압착이 꺼져 있는지 확인합니다.AFM 소프트웨어에서는 계산당 1, 024 데이터 포인트로 전력 스펙트럼의 평균 512 계산을 측정합니다. 캔틸레버의 주요 진동 모드에 해당하는 첫 번째 피크에 걸쳐 전력 스펙트럼 밀도를 통합합니다. 다음으로, 압전 컨트롤러를 켜고 필터를 500 Hertz로 설정합니다.다른 신호를 모니터링하는 동안 신속하게 AFM 헤드를 수백 마이크로미터 아래로 이동합니다. 다른 신호에서 일관된 점프를 보면서 한 번에 수백 마이크로미터 아래로 머리를 계속 움직입니다. 신호 점프가 높이가 증가하기 시작하면 팁이 샘플 표면에 매우 가깝습니다.변압 신호가 표면과의 팁 접촉 시 포화되면 머리를 약간 올린 다음 압전 전압을 조정하여 AFM 헤드를 100~ 5, 000 나노미터로 위아래로 이동하여 샘플 표면을 찾습니다. 그 후, 팁이 표면에 닿을 수 있도록 약 500 나노미터의 스캔 크기로 당기는 실험을 실시하거나 약 100 나노미터의 압조 모터 이동을 수행한다. 결과를 사용하여 스프링 상수 및 감도를 계산합니다.소프트웨어에서, 전개 폴리 단백의 총 이론적 크기보다 40 % 더 큰 스캔 크기를 설정합니다. 캔틸레버를 배치하여 스캔 크기의 80%가 표면에서 멀리 떨어져 있도록 합니다. 스캔 속도를 초당 300 나노미터로 설정합니다.당기는 실험을 수행하고 결과 압전 위치와 포토다이오드 신호를 측정합니다. 측정 전반에 걸쳐 시간당 유체 세포에 실험 버퍼를 추가하여 샘플이 건조되지 않도록 합니다. I91 폴리단백질과 3개의 I91 도메인이 양쪽에 NI10C 분자를 측면에 있는 다단백의 기록에서 전개되는 사건은 웜과 같은 체인 모델이 장착되었습니다.두 녹음 모두 I91의 특징적인 힘과 윤곽 길이 증가가 AFM 교정이 성공적이었음을 나타냅니다. N110C 분자를 포함하는 다단백의 기록은 새로운 사건이 전개관심의 단백질로부터 이었다는 것을 확인하기 위하여 충분한 I91 사건을 보여주었습니다. 안키린 반복의 평균 윤곽 길이는 약 10.5 나노미터였으며, 전개되는 힘은 8~25피코뉴턴 사이였다.측면 단백질의 전개 이벤트가 단일 분자 이벤트를 지문에 긍정적 인 제어를 제공하기 때문에 다단백을 사용하는 것이 필수적입니다. 이없이, 데이터는 오해에 대한 책임이 있습니다.

force-spectroscopy-single-protein-molecules-using-an-atomic-force

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이것은 목적, 운영, 그리​​고 소설 중력이 분석기의 결과를 보여주는 대표을 단계별로 안내합니다.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

우리는 개시 및 발달과 밀접하게 연관되는 올리고머 응집체 및 아밀로이드 섬유로 단백질 자기 조립의 과정을 구상하기 위하여 적외선 나노 스펙트로스카 및 고해상도 원자력 현미경 검사법의 응용을 기술합니다 인간의 신경 퇴행성 질환의 넓은 범위의.

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.

전단력에 의한 앙상블 힘 분광법

배우세요 원자 힘 현미경을 사용한 단일 단백질 분자 힘 분광학으로 단백질의 기계적 특성과 폴딩 경로를 측정하는 방법을. 이 기술은 단백질 안정성과 생물학적 메커니즘 연구에 필수적입니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

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