Name: 아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 아밀로이드-β42 합성 및 주사를 통한 성어 제브라피시 뇌 내 알츠하이머병 모델링 방법입니다. 이 기법은 신경줄기세포 활성화 및 퇴행성 뇌질환 치료 전략 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 DZNE와 헬름홀츠 협회 (VH-NG-1021), CRTD에 의해 지원 되었다 TU 드레스덴 (FZ-111, 043_261518), 그리고 DFG (KI1524/6) (C.K.); 그리고에 의해 Leibniz 협회 (보고-2011-IPF-2) BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). 우리는 또한 감사 하 Ulrike 호프만 펩 티 드 종합을 위한 Nandini Asokan, Prayag Murawala, 그리고 엘리 다나카 절차를 촬영 하는 동안 도움 싶습니다.

이 프로토콜은 EU 지침에 의해 제안 된 표준 절차 (2010/63) 및 생물학 및 의학 (EuFishBioMed)에서 칼 스루 Insitute의 기술 (KIT)에서 물고기 모델에 대 한 유럽 사회. 여기 후 설명 하는 모든 메서드 (Landesdirektion 드레스덴; 문서 번호 TVV-52/2015) 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
 1. Aβ42 펩 티 드의 준비 <ol><li>종합 펩 티 드 (표 1 참조) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-와 표준 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 화학을 사용 하 여 tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) 자동화 된 단단한 단계 펩 티 드 합성기 52에 결합 시 약으로. 합성의 규모는 100 µmol.</li>
	<li>단단한 단계 (0.2 m m o l/g의 용량 로드)로 자동된 펩타이드 합성기 Fmoc 보호 수 지의 500 mg와 로드. 녹은 Fmoc 보호 아미노산 농도 0.5 M에 로드에 필요한 볼륨 및 각 합성기에 대 한 계산으로. 
	참고: 계산 수 지 47 각 빌딩 블록의 5 배 초과로 두 번 각 보호 Fmoc 아미노산의 결합 수 있도록 만들어집니다.</li>
	<li>는 Dimethlyformamide (DMF)에 펩 티 드 합성에 필요한 시 약 분해. 예를 들어 비 반작용 하는 아미노 그룹 모자는 활성 제, HBTU, 0.48 M, 45 %v / v N-Methylmorpholine (NMM) (베이스), 그리고 5 %v / v 아세트산 무수 물 (상한 혼합물)의 농도에 준비.</li>
	<li>Trifluoroacetic 산 (TFA)의 구성 된 갓된 분열 혼합물에 교 반기를 사용 하 여 고체 지원 지속적으로 혼합 하 여 수 지에서 모든 펩 티 드를 쪼개 다: Triisopropylsilane(TIS): 물: 90 (v/v)에 Dithiothreitol (DTT): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v), 4 헤 사용 10 mL 100 µmol의 합성 규모.</li>
	<li>100 mL 차가운 diethyl 에테르를 분열 혼합물을 추가 하 여 쪼개진된 제품 침전. 0.45 μ m의 기 공 크기와 소계 (PTFE) 필터와 20 mL 차가운 diethyl 에테르와 세척을 포함 하 여과 장치를 통과.</li>
	<li>필터 종이에서 필터링 된 펩 티 드를 수집 하 고 디졸브 100mg 5 mL에 침전 된 펩타이드의 이온을 제거 된 증류수: 1: 1에서 이기.</li>
	<li>구슬 크기 10 µ m의 다공성 폴리스 티 렌 divinylbenzene 열을 갖춘 반 대리점 HPLC에 역 상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 Purify.
	<ol><li>전 열이 열 하 고 열 난방 장치를 사용 하 여 50 ° C에서 유지 합니다. 5%에서 100% 용 매 B 4 mL/분에서 25 분 이상으로 그라디언트를 적용 하 여 자동된 분수 수집기를 사용 하 여 모든 주요 분수 수집 
		참고: 용 매 A는 0.1 %TFA 물과 용 매 B에는 0.1 %TFA 이기 52.</li>
		<li>220에서 크로마 모니터링, 적절 한 봉우리를 수집 및 LC-씨를 사용 하 여 분석</li>
	</ol></li> <li>확인 분석 역에 의해 순도 단계 초고 압력 액체 크로마토그래피 (UPLC)에서 220 nm UV 검출기 분석 C18 열 (구슬 크기 1.7 µ m)를 통해 샘플을 전달 하는 동안 모니터링 하 여. 질량 분석에 의해 펩 티 드 제품을 확인. 
	참고: 있는 UPLC 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)와 협력 하 여 사중 극 자 검출기를 결합 이다.</li>
	<li>무성 한 분말 0.052 mbar의 진공을 적용 하 여 둥근 바닥 플라스 크에 원하는 펩 티 드의 정확한 분수를 lyophilize. -80 ° C에서-78 ° C. 점에서 무기한 유지 냉동 장치에 진공 펌프를 커플.</li>
	<li>이기의 혼합물에 1 mM의 재고 솔루션을 준비 하는 동결 건조 된 펩 티 드를 사용 하 여: DMF: 분석 학년 물 1:1: 1은 실험에 대 한. 이 솔루션으로는 펩 티 드가이 솔루션에서 집계 하지 않는 6 개월 이상 저장 될 수 있다.</li>
</ol> 2. 사출 혼합물의 준비 <ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나 2 HPO 4, 2mm KH 2 포 4, pH 7.4) 동결 건조 된 펩 티 드를 diluting에 대 한 준비.</li>
	<li>는 PBS에서 20 µ M의 최종 농도에 펩 티 드를 분해. 이 솔루션 신선한 준비. 잘 혼합 하 고 주사까지 얼음에 저장 합니다. 솔루션에서 집계를 방지 하기 위해 30 분을 초과 하지 마십시오.</li>
</ol> 3. 마 취 <ol><li>준비 마 취약, 0.1% 에틸-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB)는 순환에서 일반 물고기 물에서의 재고 솔루션 시스템. 0.0025% (v/v)의 최종 농도에 anaesthetization 솔루션 준비.</li>
	<li>시스템 물 5 l 운송 컨테이너에 그들의 탱크에서 물고기의 원하는 번호를 제거.</li>
	<li>절반 채우기 플라스틱 페 트리 접시 (90mm) 40 mL 마 취약. 이 접시를 사용 하 여 주사.</li>
	<li>Opercular 운동 정지 했습니다 때까지 마 취약에 물고기를 품 어.</li>
</ol> 4. Cerebroventricular Microinjection <ol><li>사출 기구 준비 <ol><li>준비 유리 주입 모세 혈관 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음 매개 변수: 난방 사이클, 537, 당기 주기, 250, 속도, 1.5 s; 시간, 80 양</li> <li>25 psi 압력 소스에 압력 설정을.</li>
		<li>다음에 microinjector 매개 변수를 설정: 보류 20 psi 압력, 압력 추출 10 psi; 기간 값 2.5 제어 값 100 양</li>
		<li>주입 솔루션 유리 모 세관을 로드합니다. Microinjection 홀더에 유리 모 세관을 삽입 합니다. 45 ° 분사 각도 조정. 
		참고: 참조 27 , 46에 설명 된 대로 찾을 수 있습니다 더 자세한 프로토콜.</li>
	</ol></li> <li>Anaesthetization 솔루션 (3.3 단계)로 가득한 장소 새로운 배양 접시에 생선.</li>
	<li>집게와 주입에 대 한 동양 물고기 잡고.</li>
	<li>생성 사용 하 여 30 G 바늘의 팁 두개골에 광섬유 tectum에 두 개의 측면 판 만나는 슬릿. 뇌 조직에는 팁을 삽입 하지 마십시오,이 출혈과 손상을 일으킬 것입니다. 27 , , 45 46 대 한 자세한 내용은 참조 하는 참조 하십시오.</li>
	<li>슬릿 유리 모 세관 삽입.
	<ol><li>바늘의 팁만을 사용 하 고 두개골을 통해 1 m m 이상 침투 하지 않습니다. 물고기를 잡고 유지 하 고 유리 절 개 사이트를 통해 모 세관의 끝을 삽입.</li>
		<li>동양 유리 쪽으로 45 ° 각도로 telencephalon 모 세관의 끝. 솔루션의 1 µ L을 주입. 액체 주입 직후 분 광.</li>
	</ol></li></ol> 5. 복구 <ol><li>물고기 다시 복구 될 때까지 전송 컨테이너 장소. 최적의 수 질을 보장 하기 위해 정기적으로 순환 물고기 물에 컨테이너를 연결. 
	참고: 복구를 일반적으로 1 분 소요 됩니다. 오래 걸리면, 물고기는 마 취약에서 (이 실험에 의해 최적화가 필요한) 짧은 시간에 대 한 보관 해야 합니다.</li>
</ol > 6. 조직 준비 및 단면화 <ol><li>물고기를 희생 하기 전에 원하는 기간에 대 한 대기. 
	참고:이 실험 질문에 따라 달라 집니다. 아 밀 로이드 증 착 주입 후 1 일 일찍 볼 수 있습니다.</li>
	<li>윤리 규정에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 물고기를 희생 (예, 0.1 M MESAB 물고기 치료).</li>
	<li>지적된 forcep 등 쪽 측에 사용 하 여 광섬유 tectum 위에 두개골을 자르면 고 메스를 사용 하 여 가슴 지 느 러 미 바로 뒤에 머리 부.</li>
	<li>수정 2 %paraformaldehyde (PFA)를 사용 하 여 머리 하룻밤 플라스틱 튜브에 인당 PFA의 4 ° C. 사용 3 mL에 나사 뚜껑. 
	주의: PFA를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>Cryoprotection, decalcification, 0.1 m M에서 세 번 머리를 세척에 대 한 인산 염 버퍼 (pH 7.4), 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 솔루션으로 그들을 전송 그리고 4에서 밤새 품 어 ° c.</li>
	수 지, 단면으로 조직을 포함 <li>드라이 아이스 (블록을 고정 하려면 약 3-5 분)에 플라스틱 조직학 금형에 7.5 %gelatin/20% 자당 솔루션에 머리 고정. -80 ° C에서 샘플을 저장 하거나 (cryosectioning) 다음 단계로 진행.</li>
	<li>12 µ m 두께 cryosections 설명된 28 , 42는 cryostat를 사용 하 여에 머리를 섹션. 유리 슬라이드에 직접 cryosections를 전송 및 장기 사용-20 ° C에서 저장.</li>
</ol> 7. Immunohistochemical 얼룩 및 현미경 참고: 습도 챔버에 모든 인큐베이션 단계를 수행 하십시오. 그리고, 모든 세척 단계 10 분.
<ol><li>건조 실 온에서 30 분 동안 섹션. 녹고, 후 PBS에 두 번, 한 번 PBSTx에 섹션을 세척 (0.03 %PBS-x-100).</li>
	<li>품에서 4 ° C 하룻밤. 주 항 (안티-Aβ42 항 체; PBSTx에서 1: 500 희석)와 함께 다음 날, 세척 한 번 PBS에 PBSTx에 두 번.</li>
	<li>DAPI 함께 보조 항 (형광 결합 감지, 1: 500 희석)와 섹션을 품 어 (1 μ g/mL) 실 온에서 2 h에 대 한 PBSTx에.</li>
	<li>PBSTx에 세 번 세척입니다. 최종 세척 후 coverslip 100 μ 70% 글리세롤을 사용 하 여 슬라이드 마운트.</li>
	<li>취득 형광 이미지 confocal 현미경을 사용 하 여 (예를 들어와 20 X PL APO 없음 0.7 목표 488 여기 범위와 표준 녹색 필터; 그림 2) 39.</li></ol>

저자 공개할 게 없다

녹말 체 펩 티 드 순서 변화 또는 다양 한 태그를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 스크램블된 녹말 체 펩 티 드 생성 될 수 있습니다, 그리고는 펩 티 드 펩 티 드 끝의 N-말단에 형광 태그와 함께 표시 하거나 캐리어 펩 티 드39태그 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜에 캐리어 펩타이드는 세포 관통 펩 티 드 TR 전송 화물 깊은 그 효과 때문에 뇌 조직39에입니다. 또한, 우리의 메서드는 주입 및 독성 집계50,51을 일으킬 수 있는 다양 한 펩 티 드의 분석에 대 한 수 있습니다. 따라서, 우리의 시스템 zebrafish 두뇌와 같은 독성 세포 효과 분석으로 독성 단백질의 수동 삽입에 대 한 다양 한 방법을 제공 합니다.
녹말 체 펩 티 드 집계 신속 하 게, 따라서...

광고 뉴런의 손실에 의해 특징 만성 진보적인 질병 이며 대뇌 피 질1,2,3,,45synapses. 광고의 고전 neuropathological 특징 녹말 체 펩 티 드의 증 착 이며 형성 된 neurofibrillary tangles (NFTs)6. 치 패, 녹말 체 패로 알려진 뇌 실질5β 주름을 잡은 구조를 형성 하는 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드 구성 됩니다. 광고 환자에서 Aβ42의 축적 질병의 진행에는 초기 하 고 중요 한 역할을 하고있다. 광고의 시 냅 스 기능 장애, 장애인된 소성 및 신경 손실7,8,,910이벤트를 트리거합니다.
Teleost zebrafish의 두뇌의 줄기 세포가 소성11,12,13,,1415, 의 규칙을 공부 하는 우수한 모델 역할 16,,1718,,1920 및 광고21,22,23 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 다양 한 질병 ,24. 사용할 수 있는 실험 방법을19,20,25,26,,2728,29, 의 광대 한 배열을 때문 30 , 31이 학문은 유익 하 고 실현. Zebrafish는 CNS13,15,32,33,,3435,36,37, 보충 수 있습니다. 38, 일부 신경 손실19,39,40,41,,4243, 후에 활성화 하는 분자 프로그램을 사용 하 여 44. 따라서, zebrafish neurodegenerative 질병 모델 수립 척 추가 있는 두뇌에서 재생 능력 및 줄기 세포 생물학에 관한 주소 소설 질문을 도울 수 있다.
최근에, 우리는 합성 Aβ42 펩 티 드 (표 1)39를 주입 하 여 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델 개발. 이 주입 발생 neurodegeneration 고기 (예를 들어, 세포 죽음, microglial 활성화, 시 냅 스 변성 및 메모리 적자), 인간의 두뇌 병 리를 연상 시키는 그 zebrafish 도출을 위해 사용할 수 있습니다 나타내는 zebrafish 뇌에서 neurodegeneration, 펩 티 드 immunohistochemical stainings, 및 CNS 수 성인 zebrafish에 중생의 분자 메커니즘으로 검출 될 수 있다 Aβ4239식별. 이 프로토콜에서 사용 하는 cerebroventricular 주입 (CVMI) 방법27,39,,4546 제 브라 두뇌에 합성 녹말 체 펩 티 드의 주입 시연 모방 녹말 체 증 착 (그림 1). CVMI 주입 β 장 구조에 따라 집계 하 고 독성을 발휘 펩 티 드를 제공의 새로운 방법을 제공 합니다. 펩 티 드 전체 rostro 꼬리 축45를 따라 심 실 지역 대상으로 뇌에 걸쳐 균등 하 게 배포 됩니다. 또한이 메서드는 녹말 체 포함에 따라 성인 zebrafish 두뇌에 있는 NSPCs의 형태학 및 분자 응답을 분석 하기 위한 수 있습니다. 이러한 연구 결과 제공할 것입니다 우리에 게 통찰력 포유류에서 성공적인 뇌 수리에 대 한. 광고 같은 증상이 보충 손실 된 신경 세포의 기능 회복을 유도 후 성공적인 재생 응답의 필요한 분자 메커니즘을 이해 하 우리의 메서드를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-protected 아미노산</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, 독일)</td><td></td><td>고체상 펩타이드 합성을 위한 Fmoc-based 아미노산 (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1030</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1180</td><td>라세미제이션 억제제</td></tr><tr><td>N,N-디이소프로필에틸아민</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, 독일)</td><td>SOL-003</td><td>Base</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>SOL-004</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td><td>A12158</td><td>Base</td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, USA)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>822299</td><td>Fmoc 탈보호 시약</td></tr><tr><td>디클로르메탄(DCM)</td><td>MERCK KGaA(독일 다름슈타트)</td><td>106050</td><td>용매</td></tr><tr><td>포름산(FA)</td><td>MERCK KGaA(독일 다름슈타트)</td><td>100264</td> HPLC <td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td>용 완충액 성분<td>MERCK KGaA( 다름슈타트, 독일)</td><td>808260</td><td>클레비지 혼합물 시약</td></tr><tr><td>트리이소프로필실란(TIS)</td><td>MERCK KGaA(다름슈타트, 독일)</td><td>233781 ALDRICH</td><td>클레비지 혼합물 시약</td></tr><tr><td>아세토니트릴(UPLC/LCMS용)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>용제</td></tr><tr><td>아세토니트릴(HPLC용)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>83639.320</td><td>용제</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>23811.326</td><td>펩타이드 침전용 용매</td></tr><tr><td>Dithiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>0281-25G</td><td>Clevage 혼합물 시약</td></tr><tr><td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td><td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td><td>S30023</td> SPPS 펩타이드 합성<td>을 위한 고체상</td></tr><tr><td>필터가 포함된 5ml 주사기</td><td>Intavis AG (쾰른, Germany)</td><td>34.274</td><td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td><td>11806-50-N</td><td>침전된 펩타이드</td></tr><tr><td>여과 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 주사기 필터</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>Pre-filteration for HPLC</td></tr><tr><td>Peptide Synthesizer</td><td>Intavis, Cologne, Germany</td><td>ResPep SL</td><td>자동 고체상 펩타이드 합성기</td></tr><tr><td>Water Alliance HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>반준비용 역상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)</td></tr><tr><td>PolymerX, 비드 크기 10&mu; m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. 독일</td><td>00G-4328-N0</td><td>다공성 폴리스티렌 디 비닐 벤젠 HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, Milli-Q 필터 포함</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td><td>LCPAK0001</td><td>정수 시스템</td></tr><tr><td>여과 장치</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td> <td>16307</td><td>펩타이드 침전 용 여과 장치</td></tr><tr><td>UPLC Aquity (UV 검출기</td> <td>포함)Waters, Milford, Massachusetts, USA</td><td>M09UPA 664M</td> LC-MS ACQUITY UPLC BEH C18<td>용 분석 역상 울트라 HPLC</td></tr><tr><td>, 비드 크기 1.7 &mu; m, 50x2.1 mm</td><td>Waters, Milford Massachusetts, 미국</td><td>186002350</td><td>Analytical C18 column</td></tr><tr><td>ACQUITY TQ Detector</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>QBB908</td><td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td><td>16706, 101542</td><td>진공 펌프가 있는 동결건조기</td></tr><tr><td>Paradigm plate reader</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB(에틸-m-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td>는 <td>제조업체</td><td></td>에 따라 다릅니다</tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Gillies Dissecting Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td></td></tr><tr><td>Glass injection capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>공압 PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>링 조명기; 링 라이트 가이드</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 zebrafish 두뇌에서 neurodegeneration 모델링

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer의 질병 (광고) 이며 독성 아 밀 로이드-β42의 어떤 축적에 펩 티 드 (Aβ42) 시 냅 스 변성, 염증, 신경 죽음에 이르게 하는 신경 퇴행 성 질병을 쇠 약하게 적자를 학습. 인간 신경 줄기/뿌리 세포 (NSPCs)와 감소 된 성체의 장애인된 증식 능력 때문에 광고의 경우 손실된 신경을 재생성 수 없습니다. 따라서, 효율적인 재생 치료 또한 확산을 강화 한다 neurogenic 용량의 NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) 재생 유기 체, 그리고 우리는 설계할 수 있는 기본적인 분자 프로그램을 배울 수 있는 광고를 태 클에 치료 접근입니다. 이러한 이유로, zebrafish에 광고와 같은 모델의 생성이 필요 했다. 우리의 방법론을 사용 하 여, 성인 zebrafish 뇌 조직 관통 기능 Aβ42 펩 티 드의 합성 파생 상품을 소개 하 고 질병 병 리 및 재생 응답 분석 수 있습니다 우리. 기존의 방법 또는 동물 모델에 장점은 그 zebrafish 수 우리를 가르쳐 어떻게 척추 뇌 수 자연스럽 게 재생성, 따라서 생 NSPCs를 대상으로 하 여 더 나은 인간의 신경 퇴행 성 질환을 치료 하는 데 도움이. 따라서, 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델의 신경 과학 및 임상 의학 분야에서 연구를 위한 새로운도 열 수 있습니다. 또한,이 방법의 간단한 실행 비용 효과적이 고 효율적인 실험 평가 대 한 수 있습니다. 이 원고는 합성 zebrafish 두뇌에 Aβ42 펩 티 드의 주입을 설명합니다.

HPLC는 합성된 펩 티 드를 정화 하는 데 사용 되었다 그리고 질량 분석 순화 된 아 밀 로이드 β 펩 티 드를 특성화 하는 데 사용 되었습니다. HPLC 열 Aβ 펩 티 드의 분리를 개선 하는 50 ° C에가 열 되었다 그리고 모든 분수 수집 했다. 올바르게 합성된 펩 티 드를 식별 하기 위해 모든 분수에 대 한 질량 분광학 분석 수행 되었다. UPLC 크로마 화합물의 순도 보여준다. UPLC (즉, 충전 필요한 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 정확한 질량)에 대 한 피크를 나왔고 HPLC 분수 실험 (그림 2)에 대 한 추가 처리 했다.
다양 한 분 광 방법39,,48...

합성, 특성, 및 성인 zebrafish 조직학 분석 및 탐지 하는 Alzheimer의 질병 모델을 설정 하에 아 밀 로이드 독성을 생성 하기 위한 단위체 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의 사출이이 프로토콜에 설명 합니다. 집계입니다.

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

이 방법의 전반적인 목표는 아밀로이드 베타 42 펩타이드를 합성하여 성체 제브라피시 뇌에 주입함으로써 알츠하이머병에서 관찰되는 특정 아밀로이드 용량 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 신경 줄기세포에 미치는 아밀로이드 독성의 영향과 이러한 해로운 조건에서 어떻게 회춘 반응을 유도할 수 있는지와 같은 신경과학 분야의 중요한 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 보고가 명확하고 재현성이 높으며, 얻어지는 표현형이 인간 뇌의 알츠하이머병과 매우 유사하다는 점입니다.이 기술의 함의는 알츠하이머병 치료로 확장되는데, 이는 질병 상태에서 신경 줄기세포를 활성화할 수 있는 천연 척추동물 모델을 제공하기 때문이며, 따라서 제브라피시를 통해 신경 퇴행을 회복하는 방법을 배울 수 있습니다. 아밀로이드 베타 42 펩타이드를 준비하려면, 고체상으로서 500 milligrams의 FMOC 보호 레진을 자동 펩타이드 합성기에 넣습니다. 그런 다음 각 합성기에 맞게 계산된 필요한 부피의 0.5 molar 용해된 FMOC 보호 아미노산을 넣습니다.0.48 M 농도로 활성화제 HBTU를 용해하기 위해 dimethylformamide(DMF)를 사용하십시오. 그런 다음 염기인 n-methylmorpholine(NMM)을 45% v/v로, 캡핑 혼합물인 acetic anhydride를 5% v/v로 DMF에 첨가하십시오. 준비된 시약을 합성기에 넣고 자동 합성기를 가동하여 펩타이드의 고상 합성을 수행하십시오.합성기에서 펩타이드 합성 사이클을 완료한 후, 레진을 반응 튜브로 옮기고 다음과 같이 구성된 갓 준비한 절단 혼합물 10 milliliters를 첨가하여 펩타이드를 절단합니다. 그 다음, 고체 지지체에 결합된 펩타이드를 절단하기 위해 절단 혼합물 내에서 고체 지지체를 4시간 동안 계속 혼합합니다. 절단 혼합물을 100 milliliters의 ice cold diethyl ether에 첨가하여 절단된 생성물을 침전시킵니다.0.45 micrometers 공극 크기의 PTFE 필터가 포함된 여과 장치로 용액을 통과시킵니다. 다음으로, 필터지에서 여과된 펩타이드를 회수합니다. 침전된 펩타이드 100 milligrams를 아세토니트릴과 증류수의 1:1 혼합 용액 5 milliliters에 녹인 후, 볼텍스(vortex)하여 조단백 펩타이드를 용해시킵니다.그 다음, 역상 HPLC를 통해 펩타이드를 정제하기 위해, 입자

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연구

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Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 수정된 제브라피시 배아를 실체 현미경으로 적척한 다음 콜레스테롤 합성 억제제에 노출시켜 유충에서 혈관 파열과 뇌출혈을 유발합니다. 뚜렷한 붉은 반점으로 식별할 수 있는 출혈성 유충은 이후 추가 분석을 위해 현미경으로 분리됩니다.

제브라피시 유충의 약물 유발 출혈 모델링

이 비디오는 알츠하이머병에서 볼 수 있는 신경 손상을 모방하여 아밀로이드 독성을 생성하기 위해 성인 제브라피쉬의 전뇌에 단량체 아밀로이드 펩타이드를 주입하는 절차를...

아밀로이드 펩타이드 주입을 통한 제브라피시 뇌의 알츠하이머병 모델 확립

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고...

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

개별 세포에 지시된 스트레스나 사멸을 일으키는 표적 조작은 상대적으로 수행하기가 어려웠습니다. 여기에서는 세포 배양 및 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 가하고 죽이는 단일 세포 해상도 절제 접근법을 표준 컨포칼 UV 레이저를 기반으로 설명합니다.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

이 연구는 제브라 피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 목표는 구성 및 상해 유발 신경 발생과 같은 생리적 과정에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 것입니다. 이 연구는 또한 PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 따르는 제브라 피쉬의 사용을 강조합니다.

제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

우리는 인지 성능을 평가하기 위해 설계된 행동 챔버를 제시한다. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 8주 후에 그 일을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리는 또한 고혈당 얼룩말 물고기인지 성능을 변경 했다 보여줍니다., 이 패러다임 인식 및 메모리를 평가 하는 연구에 적용 할 수 있음을 나타내는.

제브라피쉬를 모델 시스템으로 사용하는 3챔버 선택 행동 작업

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

학습과 기억은 발달, 질병 의존, 또는 환경 유발 인지 장애를 연구하는 데 강력한 지표입니다. 대부분의 인지 평가에는 특수 장비와 광범위한 시간 약속이 필요합니다. 그러나 셔틀박스 분석체는 기존의 젤박스를 활용하여 성인 제브라피시 인식의 신속하고 신뢰할 수 있는 평가를 제공하는 연관 학습 도구입니다.

성인 얼룩말 물고기를 사용하여 학습 및 메모리 연구에서 인지 평가를위한 연관 학습 도구로 셔틀 박스 분석

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

현재 프로토콜의 목표는 성체 제브라피쉬에 대한 사회적 선호도 분석을 수립하고 사용하는 데 필요한 단계를 개략적으로 설명하고 에탄올로 인한 사회적 결함을 특성화하는 데 사용할 수 있음을 입증하는 것입니다.

제브라피시의 태아 알코올 스펙트럼 장애를 모델링하여 불리한 배아 환경이 성인의 사회적 행동에 미치는 영향을 특성화합니다.

이 프로토콜은 생 체 내 제브라피시를 이용한 표준화된 고처리량 화합물 스크리닝 방법을 제공하여 도파민성 뉴런 손실과 운동 행동 결손을 정량화하여 신경보호 화합물의 효율적인 스크리닝을 가능하게 합니다.

행동 분석 및 고함량 영상을 이용한 제브라피시 유충의 도파민성 신경퇴행성 생체 내 표현형 분석

학습하세요 아밀로이드-β42 합성 및 주사를 통한 성어 제브라피시 뇌 내 알츠하이머병 모델링 방법입니다. 이 기법은 신경줄기세포 활성화 및 퇴행성 뇌질환 치료 전략 연구에 활용됩니다.

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

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