Name: 야생형과 간암의 시알 산의 결정 CMAH 넉 아웃 마우스. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 CMAH 넉 아웃 마우스의 간과 우유에서 HPLC를 이용한 시알산 분석 방법을. 이 기술은 야생형 및 헤테로지구스 마우스의 N-글리콜릴뉴라민산과 N-아세틸뉴라민산 수준을 정량화하여 당과학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 중국 자연 과학 재단 (JV 및 LL에 부여 번호 31471703, A0201300537 및 31671854) 및 100 개의 외국 재능 계획 (JV에 부여 번호 JSB2014012)으로 부분적으로 지원되었습니다.

동물 피험자에 관한 절차는 SPF에 수납 된 동물들과 실험 동물 복지에 관한 국가 지침 (과학 기술부, 중국 홍보, 2006)에 따라 난징 농업 대학교 실험 동물 센터의 윤리위원회의 승인을 받았다. 시설 (허가 ID : SYXK-J-2011-0037). 1. Cmah 녹아웃 마우스 모델 <ol><li> 양주 대학교 (중국)의 비교 의학 센터에서 야생형 C57Bl / 6 마우스를 사용하십시오. 참고 : Cmah 녹아웃 마우스는 이전 Cmah 녹아웃 연구 17 , 19 에서 제공된 정보를 기반으로 생성되었으며 Cmah 유전자의 엑손 6에서 92 염기쌍을 제거하여 CRISPR / Cas9 20 전략을 사용하여 상업적으로 얻었습니다. 인간 CMAH 유전자에서 결실 19 . 양의 F 0 &lt;/ 서브&gt; 때문이야 - 쥐 (2 개인)의 이형 때문이야 - F 1을 얻었다 야생형 마우스와 교배. 이형 F 1 때문이야 - 쥐 (5 개인)를 횡단 한 후, 동형 접합 Cmah 녹아웃 F 2 때문이야 - 쥐가 성공적으로 (3 개인)을 얻을 수있다. </li><li> 상업적 DNA 정제 키트를 사용하여 Zangala 21 에 제시된 방법에 따라 게놈 DNA를 사용하여 생쥐의 genotyping을 수행하십시오. <ol><li> 시중의 DNA 중합 효소와 프라이머 쌍 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;및 5&#39;tttaaagtgtcccgggtgagaagc3&#39;를 사용하여 Cmah 유전자의 상응하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 94 ℃에서 40 초 동안 변성, 40 초 동안 63 ℃에서 어닐링, 72 분에서 1 분간 연신하는 34 가지 PCR 사이클을 사용하여 유전자 증폭을 수행하십시오. </li><li> PCR 제품을 1 % 아가 로즈 겔에서 시각화하십시오. 야생형 개체에 대해서는 단일 밴드 (0.5kb)를, 야생형 개체에 대해서는 더블 밴드 (0.4 및 0.5kb)를 관찰해야한다.heterozygous knock-out 개체 및 homozygous knock-out 개체에 대한 단일 밴드 (0.4kb)가 포함됩니다. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 수집 <ol><li> Willingham 등이 기술 한 프로토콜을 사용하여 마우스 우유를 수집 합니다. 22 . </li><li> Gonçalves 등이 설명한 프로토콜을 사용하여 마우스 간 조직을 수집 합니다. -80 ° C에서 23 개 샘플 저장소. </li></ol> 3. 우유에서 시알 산의 분리 <ol><li> 증류 H 2 O 88 ㎖ 중에 빙초산 12 mL를 첨가하여 2 M 아세트산 용액 100mL를 준비 </li><li> 50 mL의 우유를 1.5 mL 원심 분리 튜브에 넣고 준비된 아세트산 수용액 1.2 mL를 넣는다. </li><li> 80 ° C에서 4 시간 동안 현탁액을 품어 내고 샘플을 14,000 xg에서 10 분간 원심 분리한다. </li><li> 상층 액의 상단 1,000 μL를 새로운 1.5 mL 원심 분리 튜브 및 Rem로 옮긴다.실온에서 원심 증발에 의해 용매를 제거하여 건조시킵니다 (부착 된 진공 펌프에 따라 4 ~ 20 시간이 소요됩니다). 재용 증류 H 2 O. 500 μL의 샘플을 </li><li> 마이크로 음이온 교환 컬럼을 준비하십시오. 이 단계는 음이온 성 화합물을 풍부하게하고 우유 및 간 샘플에서 양이온 및 중성 화합물을 제거하므로 시알 산 유도체 화를위한 형광성 OPD 표지제의 선택성을 증가시킵니다. <ol><li> 각 시료 200mg을 음이온 교환 수지 (Dowex 1X8)를 스톱 콕이 부착 된 빈 3mL 컬럼 튜브에 옮긴다. </li><li> 단계 3.1에서 준비한 아세트산 수용액 2 mL를 첨가하여 수지 내의 염화물 이온을 아세테이트 이온으로 대체한다. 솔벤트가 수지 상단에 도달하면 즉시 스톱 콕을 닫으십시오. </li><li> 조심스럽게 증류 H 2 O 2 ㎖를 추가 콕을 열어 즉시 도달 용매의 대부분 같은 흐름을 중지수지의 상단. 수지가 항상 솔벤트로 덮여 있는지 확인하십시오. </li><li> 과량의 아세트산을 제거하기위한 증류 H 2 O 2 mL로 수지 컬럼을 두 번 더 세척 하였다. </li></ol></li><li> 단계 3.4에서 얻은 500 μL의 샘플 용매를 옮기십시오. 수지 칼럼에 놓고 흐름을 버린다. 부드럽게 1.5 ㎖ 중에 50mM의 아세트산 암모늄 용액 1 ㎖를 사용하여 수지로부터 시료 음이온 (암모늄 아세테이트 386 mg을 증류수 H 2 O 100 mL에 용해) 증류 H 2 O. 용출 2 mL로하여 수지를 씻어 원심 분리기 튜브. 실온에서 건조하여 원심 증발시켜 용매를 제거한다. 참고 : 건조 샘플은 4-6 ° C에서 12 개월까지 보관할 수 있습니다. </li></ol> 4. 간 조직으로부터 시알 산의 분리 <ol><li> 부드럽게 20-50 mg의 마우스 간을 해동시키고 그것을 Dounce 조직 분쇄기 (1 mL 또는 2 mL 용량)로 옮긴다. 1.2 mL의 아세트산 수용액단계 3.1에서 준비하고 10 초 동안 부드러운 전단하여 조직을 균질. 생성 된 현탁액을 1.5 mL 원심 분리 튜브에 옮긴다. </li><li> 3.3 단계를 수행하십시오. 3.6. 참고 : 건조 샘플은 4-6 ° C에서 12 개월까지 보관할 수 있습니다. </li></ol> 5. 혼합 시알 산 표준의 제조 <ol><li> 분석 용 저울에 N- 아세틸 뉴 라민 산 5 - 8 mg을 1.5 mL 원심 분리 관에 넣습니다. 정확한 체중을 주마다 mg을 증류수 H 2 O 164 μL를 추가 (즉 Neu5Ac의 중량을 7.2 ㎎을 다음 7.2 = 1 × 164, H 2 O 증류수 181 μL를 추가 할 경우). 최대 12 개월 동안 -20 ° C에서 보관할 수있는 20 mM Neu5Ac 스톡 용액이 생성됩니다. </li><li> 1mg 분량과 같은 적절한 가격으로 소량의 N- 글리콜 릴 뉴 라민 산을 얻습니다. ~ 20 mM의 Neu5Gc 스톡 용액을 제조하기 위해 화합물 2 O 직접 증류 H 154 μL를 추가한다. 전송1.5 mL 원심 튜브에 넣었다. 이 솔루션은 최대 12 개월 동안 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li><li> 단계 5.1 및 5.2의 각 원액에서 5 μL를 신선한 1.5 mL 원심 튜브에 넣고 실온에서 건조하여 원심 증발에 의해 용매를 제거합니다. 참고 : 혼합 시알 산 표준은 최대 12 개월 동안 4 ~ 6 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol> 6. 시알 산의 형광 유도체 화 <ol><li> 오르토 페닐 렌 디아민 100㎎을하고 10ml에 아황산 수소 나트륨 208 mg을 구성된 10 ㎖ OPD-용액을 준비하여 H 2 O를 증류 </li><li> 마우스 우유 (3 단계), 마우스 간 (4 단계), 또는 혼합 시알 산 표준 (5 단계)에서 파생 된 시알 산 샘플에 OPD 솔루션 20 μL를 추가합니다. 어두운 곳에서 80 ° C에서 4 시간 동안 시료를 30 초간 격렬히 교반하고 incubate하십시오 ( 즉 , 알루미늄 호일에 마이크로 튜브를 감싸십시오). </li><li> 샘플을 5 분 동안 식히고 80μ; 증류수 H 2 O의 L 1 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리. </li><li> 상등액에서 80 μL를 300 μL 고 회수 HPLC 바이알로 옮긴다. 유도체 화 된 시알 산 시료는 4 ~ 6 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관할 수 있습니다. </li></ol> 7. 시알 산 유도체의 HPLC 분석 <ol><li> 온라인 형광 검출기에 연결된 표준 HPLC 시스템을 사용하여 시료를 분석하십시오. </li><li> 표준 250mm 길이와 4.6mm 직경의 역상 C18 컬럼을 사용하여 분석하십시오. </li><li> 스톡 용액 200 mL를 LCMS 급수 800 mL로 희석하여 용매 A를 준비한다 (LCMS - 액체 크로마토 그래피 질량 분석기). 원액 자체는 다음과 같이 준비 할 수있다 : <ol><li> 46 g의 개미산을 800 mL의 LCMS 등급 H 2 O에 첨가한다. </li><li> 수산화 암모늄 용액 (puriss.pa)을 적가하여 pH를 4.5로 조정한다. </li><li> 솔벤트를실린더를 측정하고 LCMS 등급 H 2 O로 1,000 mL까지 채우십시오.이 저장 용액은 4 ~ 6 ° C에서 3 개월까지 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 용매 B의 경우 LCMS 등급의 아세토 니트릴을 사용하십시오. </li><li> 시알 산 유도체를 1 mL / min 유속으로 다음의 농도 구배로 분리하십시오 : <ol><li> 용매 A에 혼합 된 용매 B를 10 % 첨가하여 시작하십시오. </li><li> 0 분에서부터 15 분까지 점차적으로 용매 B의 비율을 60 %까지 선형 그래디언트로 증가시킵니다. </li><li> 15 분에서 16 분 사이에 선형 그라디언트로 용매 B의 비율을 60 %에서 90 %까지 빠르게 증가시킵니다. 이것은 HPLC 칼럼의 세척을 시작한다. </li><li> HPLC 칼럼을 추가로 세척하기 위해 용매 B의 수준을 16 분에서 18 분 사이에 90 %로 유지 한 다음 용매 B의 수준을 18 분에서 19 분 사이에 다시 10 %로 점차 감소시킵니다. </li><li> HPLC 칼럼을 19 ~ 24 분 사이의 10 % B의 시작 조건으로 재 평형시킨다. </li></ol></li><li> 에서시료 50 μL를 HPLC 시스템에 주입하십시오. </li><li> 373/448 nm의 형광 검출기 여기 / 방출 파장을 사용하여 용리액을 모니터링하고 유도체 화 된 시알 산은 대략 9 분 (Neu5Gc-OPD) 및 10 분 (Neu5Ac-OPD)의 예상 유지 시간에서 예상 할 수 있습니다. </li><li> F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc )와 같이 Neu5Ac (A Neu5Ac )와 Neu5Gc (A Neu5Gc )의 형광 피크 면적으로부터 Neu5Gc (F Neu5Gc )의 상대적 양을 계산 하라 . homozygous Cmah knock-out 마우스의 우유 및 간 샘플의 경우 F Neu5Gc 는 0 %이어야하지만, 이형 접합체 및 야생형 마우스의 F Neu5Gc 값은 마우스 나이와 조직 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다 (2 % 및&gt; 90 %)로 예상 오차 여백은 ± 12 %입니다. </li></ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
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본 명세서에 제시된 프로토콜은 우유 및 간 샘플의 Neu5Gc의 상대적인 양을 분석하고 정량화함으로써 동형 접합성 Cmah 녹아웃 마우스의 표현형 평가를 가능하게한다. 형광 검출을 이용한 표준 HPLC 설정을 사용하여 분석을 수행 하였다. 이 절차의 가장 중요한 단계는 음이온 교환 컬럼을 준비하고 음이온 교환 크로마토 그래피를 수행하는 것입니다. 수지를 적절하게 침전시키고 적절한 세척 및 용출 분획을 수집하는 것은 약간의 연습을 필요로한다. 다르게는, 본원에서 사용 된 유도체 화제 OPD는보다 고가의 유도체 화제 DMB (1,2- 디아 미노 -4,5- 메틸렌 디 옥시 벤젠)로 쉽게 대체 될 수있다. 또한, 수득 된 시알 산 유도체를 단계 6.5로부터 분석 하였다. 또한 수 질량 분광 검출 대신 형광 검출 (MS-2020 검출기와 결합 즉 시마즈 Nexera UPLC 시스템)을 사용하여 분석 할 수있다. 에이단계 7.2-7.6을 적용 할 때, 시...

N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 글리콜 릴 뉴 라민 산 (Neu5Gc)은 대부분의 포유류에서 가장 흔한 시알 산입니다 1 . Neu5Ac를 내생 적으로 합성 할 수는 있지만, 인간은 CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3을 암호화하는 CMAH 유전자에서 1 차 엑손 결실로 인해 Neu5Gc를 생산할 수 없습니다. 그러나 동물성 식품은 Neu5Gc 4 , 5 , 6 의식이 공급원 일 수있어 Neu5Gc 항체 생산을 유도하여 Neu5Gc 7에 대한 면역 반응을 유발합니다. Neu5Gc의식이 효과는 만성 염증 및 여러 가지 다른 질병에 기여하는 것으로 의심됩니다 ( 8 , 9 , 10) . Neu5Gc의 효과를 종합적으로 이해하기 위해식용 시알 산의 효과에 대한 체계적인 연구를위한 동물 모델은 매우 바람직하다. 녹아웃 마우스를 분석하기위한 중합 효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 기반으로 한 프로토콜이 잘 확립되어 있고 유전형 평가를위한 편리한 방법이지만, 대사 수준에서 표현형의 기능 분석에는보다 구체적인 분석 방법이 필요합니다. Cmah knock-out 마우스 모델의 표현형은 간 또는 우유 샘플에서 시알 산의 조성을 분리하고 분석하여 평가할 수 있습니다. 동물 조직에서 시알 산을 검출하는 몇 가지 방법이 이전에보고되었습니다 : 시알 산을 레조 르시 놀 11 또는 티오 바르 비 투산 12 와 반응 시키면 발색 생성물이 형성되고 플레이트 판독기를 사용하여 간단하게 분석 할 수 있지만 시알 산 산 함량이 결정될 수있다. 대안으로, 시알 산의 분석은 가스 크로마토 그래피13 , MALDI-ToF 질량 분광 분석법 14 또는 전류 법 15 . 그러나, 가장 일반적으로 적용되는 시알 산 분석 방법은 가수 분해 릴리스, 형광 유도체 화 및 후속 고성능 액체 크로마토 그래피 16 , 17 , 18에 근거합니다.

<table><tbody><tr><td><강>화학 물질 : < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N- 아세틸 뉴 라민산</td><td>시그마</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>N- 글리콜 릴 뉴 라민산</td><td>시그마</td><td>50644</td><td>1 mg 분취액은 충분해야합니다</td></tr><tr><td>o- 페닐 렌 디아민</td><td>시그마</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 수소 아황산염</td><td>J & K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>Tools/Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL SPE 튜브</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>빈 고체상 추출 컬럼</td></tr><tr><td>Luer stopcock</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>SPE 튜브의 흐름을 멈추기 위해</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>타이트 핏</td></tr><tr><td>HPLC 분석: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고회수율 HPLC 바이알</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>형광 검출기</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4.6mm</td></tr><tr><td>LCMS 등급 H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS 등급 아세토니트릴</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>하이퍼그레이드</td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss.</td></tr></tbody></table> PA

야생형과 간암의 시알 산의 결정<em&gt; cmah</em&gt; 넉 아웃 마우스.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N- 아세틸 뉴 라민 산 hydroxylase)는 포유류에서 cytidine monophosphate-N- acetylneuraminic acids의 산화를 담당합니다. 그러나, 인간은 CMAH 유전자의 일차 엑손 결실로 인해 시티 딘 모노 포스페이트 -N- 아세틸 뉴 라민 산을 시티 딘 모노 포스페이트 -N- 글리콜 릴 뉴 라민 산으로 산화시킬 수 없다. CMAH 활동의 결핍의 영향과 함축적 의미를보다 자세히 이해하기 위해 마우스에서의 Cmah 녹아웃 모델은 기초 및 응용 연구에 관심이 많습니다 . 이 마우스 모델의 표현형을 결정하기위한 분석 방법은 본원에 상세히 기재되어 있으며, 야생형 및 Cmah 녹아웃 마우스의 간 및 우유에서의 N- 아세틸 뉴 라민 산 및 N- 글리콜로 누 라민 산의 검출에 기초한다. 내인성 시알 산은 방출되고 o- 페닐 렌 디아민으로 유도체 화되어 형광 생성물을 생성하며, 이후에 HPLC로 분석 될 수있다. 제시된 프로토콜은또한 다양한 다른 기원의 우유 및 조직 샘플 분석에 사용되며 N-glycolylneuraminic acid의 영양 및 건강 효과를 조사하는 데 유용 할 수 있습니다.

설명 된 분석 방법의 개략적 인 개요는 그림 1에 표시되어 있으며 야생 형 및 Cmah 녹아웃 돌연변이 마우스의 우유 및 간 샘플에서 시알 산을 분리하고 형광 유도체 화 및 이러한 구성 요소의 HPLC 분석을 포함합니다. 그림 2 와 그림 3 은 homo- 과 heterozygous knock-out Cmah 마우스 (- / -와 +/-)와 야생형 마우스의 우유와 간 샘플 유도체 화 시알 산의 대표적인 HPLC 크로마토 그램을 보여줍니다. 도 4 는 HPLC 피크 면적으로부터 계산 된 분석 마우스 샘플의 N- 글리콜 릴 뉴 라민 산 (Neu5Gc)의 얻어진 상대량을 나타낸다. <p class="jove_...

우리는 마우스 간의 간과 우유에서 N- 아세틸 뉴 라민 산 (N-acetylneuraminic acid)과 N- 글리콜로 누 라민 산 (N-glycolylenuraminic acid)을 측정하기위한 HPLC 기반 방법을 설명합니다.

야생형과 간암의 시알 산의 결정<em&gt; CMAH</em&gt; 넉 아웃 마우스.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

이 방법론의 전반적인 목표는 HPLC 분석을 이용하여 야생형 및 CMAH 결핍(knock-out) 마우스의 간과 우유 내 N-Acetylneuraminic acid 및 N-Glycolylneuraminic acid를 검출하는 것입니다. 이 방법은 당과학 분야의 의문, 특히 CMAH 마우스 모델의 유전자형이 이들 동물의 실제 시알산 함량에 미치는 영향에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 유전자 스크리닝과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 이형접합체(heterozygous) 마우스에 대해서도 상대적인 시알산 수치를 결정할 수 있다는 점입니다.본 방법의 평가는 저희 실험실의 대학원생인 Cui Cao와 Wang Wenjiao가 수행할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 CMAH 녹아웃 마우스로부터 마우스 유즙과 마우스 간 조직을 수집하여 이 절차를 시작하십시오. 유즙에서 시알산을 분리하려면, 50 µL의 유즙을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 준비된 수성 아세트산 용액 1.2 mL를 추가하십시오.간 조직에서 시알산을 분리하려면, 20~50 mg의 마우스 간을 천천히 해동하여 dounce 조직 분쇄기에 옮깁니다. 1.2 mL의 수성 아세트산 용액을 넣고 10초 동안 가볍게 전단하여 조직을 균질화합니다. 생성된 현탁액을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, 산성화된 우유 또는 조직 현탁액을 80 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 샘플을 14,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액의 상단 1000 µL를 새로운 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.실온에서 원심 분리 증발을 통해 용매를 제거하여 완전히 건조시킵니다. 샘플을 500 µL의 증류수에 다시 녹입니다. 다음으로, 샘플당 200 mg의 음이온 교환 수지를 스톱콕이 부착된 빈 3 mL 튜브에 옮겨 마이크로 음이온 교환 컬럼을 준비합니다.수지 내의 염화 이온을 아세테이트 이온으로 교체하기 위해 2 milliliters의 수성 아세트산 용액을 첨가합니다. 용매가 수지의 상단에 도달하는 즉시 스톱콕을 닫으십시오. 증류수 2 milliliters를 천천히 첨가한 후 스톱콕을 엽니다.용매의 대부분이 레진 상단에 도달하면 즉시 흐름을 중단하십시오. 레진이 항상 용매로 덮여 있도록 확인하십시오. 그런 다음, 과잉의 아세테이트를 제거하기 위해 2 mL의 증류수로 레진 컬럼을 두 번 더 세척하십시오.결과물인 500 µL의 시료 용매를 레진 컬럼에 옮기고 통과액은 버립니다. 2 mL의 증류수로 레진을 부드럽게 세척합니다. 1 mL의 50 mM 아세트산 암모늄 용액을 사용하여 레진에서 시료 음이온을 용리시켜 1.5 mL 원심분리 튜브에 담습니다.실온에서 원심 증발법을 통해 용매를 완전히 제거하여 건조시킵니다. 분석 저울을 사용하여 5~8 mg의 N-Acetylneuraminic acid를 1.5 mL 원심 분리 튜브에 정밀하게 잽니다. 정확한 무게를 기록하고, 1 mg당 164 µL의 증류수를 첨가합니다.1 mg씩 분주된 소량의 N-Glycolylneuraminic acid를 적절한 가격으로 준비합니다. 화합물에 증류수 154 µL를 직접 첨가하여 약 20 mM 농도의 Neu5Gc 스톡 용액을 만듭니다. 이 용액을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.이 용액은 -20 °C에서 최대 12개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 스톡 용액에서 5 µL씩 취해 새 1.5 mL 원심분리 튜브에 혼합합니다. 그런 다음, 실온에서 원심 증발법을 사용하여 용매를 제거하여 완전히 건조시킵니다.마우스 우유, 마우스 간 또는 혼합 시알산 표준물질에서 유래한 시알산 샘플에 20 µL의 OPD 용액을 첨가합니다. 샘플을 30초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플을 80 °C에서 4시간 동안 암소에서 배양합니다.시료를 5분 동안 식힌 후, 증류수 80 µL를 첨가하십시오. 그런 다음 튜브를 14,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상층액에서 80 µL를 취해 300 µL 고회수 HPLC 바이알로 옮기십시오.유도체화된 시알산 시료는 4~6°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 온라인 형광 검출기가 연결된 표준 HPLC 시스템을 사용하여 시료를 분석하십시오. 분석에는 길이 250 mm, 직경 4.6 mm의 역상 C18 컬럼을 사용하십시오.용매 A와 용매 B를 준비하고 프로토콜에 상세히 기술된 대로 HPLC 분석 설정을 마친 후, 50 µL의 시료를 HPLC 시스템에 주입하십시오. 형광 검출기의 들뜸 파장 373 nm와 방출 파장 448 nm를 사용하여 용출액을 모니터링하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 Neu5Gc의 상대량을 계산하십시오.여기에 동형접합체 knock-out CMAH 마우스와 이형접합체 knock-out CMAH 마우스에서 유래한 우유 샘플의 형광 표지 시알산(sialic acid)에 대한 대표적인 HPLC 크로마토그램이 나와 있습니다. 야생형(wild-type) 마우스의 결과도 함께 제시되어 있습니다. 마찬가지로, 마우스 간에서 유래한 형광 표지 시알산의 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다.Neu5Gc의 상대적 양을 비교하면, 동형 접합 CMAH 결손 생쥐에는 Neu5Gc가 포함되어 있지 않은 반면, 이형 접합 CMAH 결손 생쥐와 야생형 생쥐에는 10%에서 75% 사이의 Neu5Gc가 포함되어 있음을 알 수 있습니다. 숙련된 경우, 절차가 적절하게 수행되었다면 8시간 이내에 시료를 준비할 수 있습니다. 그리고 시료는 HPLC 자동 시료 채취기를 통해 밤새 분석할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 시알산의 분리와 유도체화 과정을 같은 날에 진행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 절차 완료 후, 획득한 형광 신호의 성질을 확인하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 연구자들은 생물학적 샘플 내의 시알산 분포를 탐구할 수 있습니다.고농도의 아세트산과 포름산은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 형광 검출을 돕기 위해 적절한 형광 표지 시약으로 유도체를 추출한 후 고성능 액체 크로마토그래피, HPLC를 사용하여 시알산, N-아세틸뉴라민산 및 N-글리콜릴뉴라민산을 검출하는 방법을 보여줍니다.

역상 고성능 액체 크로마토그래피: 마우스 간에서 분리된 형광 표지 및 유도체화된 시알산의 정량을 위한 강력한 방법

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

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야생형과 간암의 시알 산의 결정

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