야생형과 간암의 시알 산의 결정

이 방법론의 전반적인 목표는 HPLC 분석을 이용하여 야생형 및 CMAH 결핍(knock-out) 마우스의 간과 우유 내 N-Acetylneuraminic acid 및 N-Glycolylneuraminic acid를 검출하는 것입니다. 이 방법은 당과학 분야의 의문, 특히 CMAH 마우스 모델의 유전자형이 이들 동물의 실제 시알산 함량에 미치는 영향에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 유전자 스크리닝과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 이형접합체(heterozygous) 마우스에 대해서도 상대적인 시알산 수치를 결정할 수 있다는 점입니다.

본 방법의 평가는 저희 실험실의 대학원생인 Cui Cao와 Wang Wenjiao가 수행할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 CMAH 녹아웃 마우스로부터 마우스 유즙과 마우스 간 조직을 수집하여 이 절차를 시작하십시오. 유즙에서 시알산을 분리하려면, 50 µL의 유즙을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 준비된 수성 아세트산 용액 1.2 mL를 추가하십시오.

간 조직에서 시알산을 분리하려면, 20~50 mg의 마우스 간을 천천히 해동하여 dounce 조직 분쇄기에 옮깁니다. 1.2 mL의 수성 아세트산 용액을 넣고 10초 동안 가볍게 전단하여 조직을 균질화합니다. 생성된 현탁액을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 산성화된 우유 또는 조직 현탁액을 80 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 샘플을 14,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액의 상단 1000 µL를 새로운 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

실온에서 원심 분리 증발을 통해 용매를 제거하여 완전히 건조시킵니다. 샘플을 500 µL의 증류수에 다시 녹입니다. 다음으로, 샘플당 200 mg의 음이온 교환 수지를 스톱콕이 부착된 빈 3 mL 튜브에 옮겨 마이크로 음이온 교환 컬럼을 준비합니다.

수지 내의 염화 이온을 아세테이트 이온으로 교체하기 위해 2 milliliters의 수성 아세트산 용액을 첨가합니다. 용매가 수지의 상단에 도달하는 즉시 스톱콕을 닫으십시오. 증류수 2 milliliters를 천천히 첨가한 후 스톱콕을 엽니다.

용매의 대부분이 레진 상단에 도달하면 즉시 흐름을 중단하십시오. 레진이 항상 용매로 덮여 있도록 확인하십시오. 그런 다음, 과잉의 아세테이트를 제거하기 위해 2 mL의 증류수로 레진 컬럼을 두 번 더 세척하십시오.

결과물인 500 µL의 시료 용매를 레진 컬럼에 옮기고 통과액은 버립니다. 2 mL의 증류수로 레진을 부드럽게 세척합니다. 1 mL의 50 mM 아세트산 암모늄 용액을 사용하여 레진에서 시료 음이온을 용리시켜 1.5 mL 원심분리 튜브에 담습니다.

실온에서 원심 증발법을 통해 용매를 완전히 제거하여 건조시킵니다. 분석 저울을 사용하여 5~8 mg의 N-Acetylneuraminic acid를 1.5 mL 원심 분리 튜브에 정밀하게 잽니다. 정확한 무게를 기록하고, 1 mg당 164 µL의 증류수를 첨가합니다.

1 mg씩 분주된 소량의 N-Glycolylneuraminic acid를 적절한 가격으로 준비합니다. 화합물에 증류수 154 µL를 직접 첨가하여 약 20 mM 농도의 Neu5Gc 스톡 용액을 만듭니다. 이 용액을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이 용액은 -20 °C에서 최대 12개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 스톡 용액에서 5 µL씩 취해 새 1.5 mL 원심분리 튜브에 혼합합니다. 그런 다음, 실온에서 원심 증발법을 사용하여 용매를 제거하여 완전히 건조시킵니다.

마우스 우유, 마우스 간 또는 혼합 시알산 표준물질에서 유래한 시알산 샘플에 20 µL의 OPD 용액을 첨가합니다. 샘플을 30초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플을 80 °C에서 4시간 동안 암소에서 배양합니다.

시료를 5분 동안 식힌 후, 증류수 80 µL를 첨가하십시오. 그런 다음 튜브를 14,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상층액에서 80 µL를 취해 300 µL 고회수 HPLC 바이알로 옮기십시오.

유도체화된 시알산 시료는 4~6°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 온라인 형광 검출기가 연결된 표준 HPLC 시스템을 사용하여 시료를 분석하십시오. 분석에는 길이 250 mm, 직경 4.6 mm의 역상 C18 컬럼을 사용하십시오.

용매 A와 용매 B를 준비하고 프로토콜에 상세히 기술된 대로 HPLC 분석 설정을 마친 후, 50 µL의 시료를 HPLC 시스템에 주입하십시오. 형광 검출기의 들뜸 파장 373 nm와 방출 파장 448 nm를 사용하여 용출액을 모니터링하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 Neu5Gc의 상대량을 계산하십시오.

여기에 동형접합체 knock-out CMAH 마우스와 이형접합체 knock-out CMAH 마우스에서 유래한 우유 샘플의 형광 표지 시알산(sialic acid)에 대한 대표적인 HPLC 크로마토그램이 나와 있습니다. 야생형(wild-type) 마우스의 결과도 함께 제시되어 있습니다. 마찬가지로, 마우스 간에서 유래한 형광 표지 시알산의 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다.

Neu5Gc의 상대적 양을 비교하면, 동형 접합 CMAH 결손 생쥐에는 Neu5Gc가 포함되어 있지 않은 반면, 이형 접합 CMAH 결손 생쥐와 야생형 생쥐에는 10%에서 75% 사이의 Neu5Gc가 포함되어 있음을 알 수 있습니다. 숙련된 경우, 절차가 적절하게 수행되었다면 8시간 이내에 시료를 준비할 수 있습니다. 그리고 시료는 HPLC 자동 시료 채취기를 통해 밤새 분석할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 시알산의 분리와 유도체화 과정을 같은 날에 진행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 절차 완료 후, 획득한 형광 신호의 성질을 확인하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 연구자들은 생물학적 샘플 내의 시알산 분포를 탐구할 수 있습니다.

고농도의 아세트산과 포름산은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.